技术领域
本发明涉及柑橘柚类植物的种植技术领域，更特别地，涉及一种基于S基因型的为目标柑橘柚植株鉴定授粉供体的试剂盒及鉴定方法。
背景技术
柑橘是世界上第一大类水果，产业经济价值巨大。柑橘柚类(Citrus grandis)是其中重要的栽培种之一，以沙田柚、琯溪蜜柚等我国传统优良柚品种为主，种植面积较大。而人们实际生产过程中发现大多数柚类品种有自交不亲和的机制存在,该机制严重影响果实的产量，所以在柚类生产栽培中授粉树的选择至关重要。有研究显示，柚类植物的自交不亲和性状在遗传上受单一位点的复等位基因控制，即S位点。S位点具有很高的多态性，不亲和反应表现在花粉的S基因型与花柱的S基因型一致时，花粉管的将在花柱中停止生长，无法完成双受精。
尽管具有自交不亲和的柑橘品种的数量不断增加，但是这些自交不亲和品种的S基因型几乎未知。“Banpeiyu”为日本的一种柚类品种，它的S基因型被定义为S1S2。日本研究者利用花幼期自交亲和的特性，在“Banpeiyu”幼期进行自交授粉，从而得到S1S1的纯合植株。分别对55份“Banpeiyu”的自交后代授以母本(S1S2)的花粉，观察其花粉管的生长位置，从而鉴定出具有S1S1或者S2S2的纯合植株。此外55个后代中，有23个单株具有具有S1等位基因，16棵具有S2等位基因。然而这仅有的两种基因型完全无法指导柚类授粉树的选择，实际操作中对于柚类授粉的选择仍具有很大的盲目性，这严重阻碍了柚类产业的发展。
早前，柚类授粉树的选择多数是由农户的经验决定，或是参考授粉统计结实率，但这工作量大，周期长，且授粉后的坐果率受环境影响因数较大。除了参照人工授粉后的坐果率，也可通过授粉后，对花柱进行苯胺蓝染色，观察花粉管在柱头中的生长状态，这也成为了判断亲和与否的常用方法。在茄科，蔷薇科和虞美人配子体自交不亲和中，信号分子是由柱头表面细胞所产生，信号级联反应是发生在不亲和的花粉管之中，最终导致花粉管生长被抑制。苯胺蓝染色发现绝大多数具有配子体自交不亲和的物种花粉管都在花柱内部停止生长，当然也有例外，比如罂粟和草。传统的苯胺蓝染色方法多用于茄科、蔷薇科等花柱较小的作物上，授粉后采样时间、组织固定液配方、及组织软化、染色等时间都易于掌握，然而，柚类花柱较大，对于大型花柱一直未有较成熟的苯胺蓝染色方法被报导。
相对于传统的方法而言，如果知道品种的S基因型或者是能快速高效的鉴定出品种的基因型，那么授粉品种的选择问题将迎刃而解。本课题组首次鉴定到了9个候选的柚类S基因柑橘柚类，即CgRNS1-CgRNS9(Citrus grandis S ribonuclease)，发现基于该9个基因设计特异性引物，可用于柚子的S基因型鉴定工作。
发明内容
本发明提供了一种基于S基因型的为目标柑橘柚植株鉴定授粉供体的试剂盒，其包括S基因检测试剂组。
在一个优选实施方案中，所述S基因检测试剂组包括引物对1-9中的两个或多个组合，所述引物对1由SEQ ID NO:1和2所示序列的引物组成，所述引物对2由SEQ ID NO:3和4所示序列的引物组成，所述引物对3由SEQ ID NO:5和6所示序列的引物组成，所述引物对4由SEQ ID NO:7和8所示序列的引物组成，所述引物对5由SEQ ID NO:9和10所示序列的引物组成，所述引物对6由SEQ ID NO:11和12所示序列的引物组成，所述引物对7由SEQ ID NO:13和14所示序列的引物组成，所述引物对8由SEQ ID NO:15和16所示序列的引物组成，所述引物对8由SEQ ID NO:17和18所示序列的引物组成。
在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括花粉管苯胺蓝检测试剂组。
在一个优选实施方案中，所述花粉管苯胺蓝检测试剂组包括固定液、95％的酒精、4M NaOH溶液、0.1M K3PO3配制的0.1％苯胺蓝溶液。
本发明还提供了一种基于S基因型的为目标柑橘柚植株鉴定授粉供体的方法，其特征在于，使用权利要求1-4中任一项所述的试剂盒检测目标柑橘柚植株和候选授粉供体的的S基因，当所述目标柑橘柚植株和候选授粉供体的S基因不同时，判定所述候选授粉供体可作为所述目标柑橘柚植株的授粉供体，当所述目标柑橘柚植株和候选授粉供体的S基因相同时，判定所述候选授粉供体不能作为所述目标柑橘柚植株的授粉供体。
在一个优选实施方案中，所述S基因检测试剂组包括引物对1-9中的两个或更多个组合，所述方法包括以下步骤：
步骤1：分别提取所述目标柑橘柚植株和候选授粉供体的基因组；
步骤2：分别以步骤1中提取的所述目标柑橘柚植株和候选授粉供体的基因组为模板，使用所述引物对进行PCR扩增，检测扩增产物；
步骤3：当所述候选授粉供体基因组的扩增产物与所述目标柑橘柚植株基因组的扩增产物不同时，判定所述候选授粉供体可作为所述目标柑橘柚植株的授粉供体；当所述候选授粉供体基因组的扩增产物与所述目标柑橘柚植株基因组的扩增产物相同时，判定所述候选授粉供体不能作为所述目标柑橘柚植株的授粉供体。
在一个优选实施方案中，所述方法还包括步骤4：对授粉后的柑橘柚类植株上的花粉管进行苯胺蓝染色，以确定花粉管已及时到达花柱底部。
在一个优选实施方案中，步骤4包括以下步骤：
步骤41：步骤3中鉴定的所述授粉供体给所述目标柑橘柚植株授粉5天后，取柱头组织在固定液中固定12-24小时；
步骤42：将固定后的柱头组织浸泡于55℃的4M NaOH中，直至组织变软；
步骤43：将软化的柱头组织浸渍于苯胺蓝染色液染色，至着色可用于观察。
在一个优选实施方案中，步骤43中，所述苯胺蓝染色液染为0.1M K3PO3配制的0.1％苯胺蓝溶液。
在一个优选实施方案中，步骤43中，染色时间为20min。
本发明首次提供柚类9个S基因型，基于该9个基因型可鉴定广为栽培的柚类品种的S基因型，为柚类自交不亲和基因型提供了可靠的鉴定方法，同时也为指导柚类生产过程中授粉树的配置提供了理论依据。
本发明的鉴定方法快捷、低廉、准确。传统的柚类授粉树的选择依据是通过不同授粉组合后，对坐果率进行比较。而该方法费时费力，且容易受外界环境的影响。而本方法可采用市场上最低廉的mix进行PCR扩增检测，操作简单，且结果准确。
本发明提供了适用于大型花柱的染色方法，便于授粉后对花粉管生长状态的观察。传统的苯胺蓝染色方法多适用于茄科、蔷薇科及十字花科等小型花柱，而柚子花柱较大，传统的染色方法无法获得清楚的染色图片。而本方法首先通过调整授粉后生长天数，以保证采集柱头时，亲和的花粉管已及时到达花粉管底部。
附图说明
图1为使用9个引物对检测14种柑橘柚类植株的S基因的结果示图；
图2为对GB×SM、ZP×MD、WS×TG、WS×SJ的授粉后的柱头组织进行苯胺蓝染色后的荧光照片。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.S基因的鉴定
发明人对大量柑橘柚类植株材料进行研究，鉴定出9种不同的S基因。并专门为这9种S基因设计引物如表1所示。
表1引物对1-9及相关基因信息
2.对14种柚类植物鉴定S基因型
选取14个柚类品种为待测材料，如表2所示。
表2 14各柚类品种信息汇总
使用CTAB方法提取待测样品的基因组DNA。分别以这些基因组为模板，使用表1中的引物对进行PCR扩增，10μl PCR扩增体系为：5μl 2×Taq plus master mix，0.25μl正引物，0.25μl正引物，150ng DNA模板，并用水补足至10μl。扩增条件为先94℃预变性5min；再94℃变性30s，退火30s(退火温度参照表2)，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸5min。
按照以上PCR扩增后，取7μl的PCR产物于1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示。根据扩增结果可判断14个待测柚类品种的基因型：ST的基因型为S1S2，GB的基因型为S1S3，SM的基因型为S1S3，WS的基因型为S2S4，TG的基因型为S2S4，WB的基因型为S2S5，HB的基因型为S2S7，MD的基因型为S3S5，ZP的基因型为S3S5，ZG的基因型为S3S5，SJ的基因型为S5S6，HN的基因型为S1S9，SU的基因型为S2S9，GX的基因型为S3S5。由此可见，14个柚类品种存在同名异种的情况，桂林沙田柚，石门沙田柚，秭归沙田柚都为沙田柚，然而他们却是不同S基因型，可见这3种沙田柚只是当地农户叫法一致，实质上并非同一品种。具有不同S基因型的柚类资源，相互之间可以互作为授粉树。
3.授粉后花粉管染色验证
根据预测，具有完全相同S基因型的柚类品种相互授粉后，花粉管将在花柱内停止生长，无法到达花柱底端；只有含一个或者两个不同S基因型的柚类品种相互授粉，花粉管才能生长穿过柱头，进入子房，完成双受精。因此，为验证通过PCR获得的柚类S基因型是否准确，采用授粉后对花柱进行苯胺蓝染色的方法观察花粉管的生长位置。
授粉验证选取4对组合：(1)GB(母本，S1S3)×SM(父本，S1S3)；(2)ZP(母本，S3S5)×MD(父本，S3S5)；(3)WS(母本，S2S4)×TG(父本，S2S4)；(4)WS(母本，S2S4)×SJ(父本，S5S6)。
柚类花粉管苯胺蓝染色方法为：(1)对母本去雄后，授以合适花粉后，套袋5天；(2)将授粉后的柱头置于固定液(无水乙醇：冰醋酸＝4：1)中固定12-24个小时；(3)用95％的酒精清洗2-3遍，保存至70％的酒精中待用；(4)用清水清洗2-3遍，浸泡在4M NaOH中，55℃至少30min直到组织变软；(5)用清水清洗掉表面NaOH，加入适量的苯胺蓝染色液(使用0.1M K3PO3为溶剂配置0.1％苯胺蓝溶液)，染色20min左右；(6)使用甘油压片，在UV滤片下观察花粉管的生长状况。
根据以上方法获得的花粉管生长状况荧光图见图2，由图可见，以与父本相同S基因型的柚类的花粉进行授粉，花粉管皆在花柱1/3位置停止生长，在花柱底端只有发光的花柱道胼胝质，如授粉组合(1)、(2)、(3)所示；而以与父本不同S基因型的柚类的花粉进行授粉，可观察到大量的花粉管延伸到花柱底部，如授粉组合(4)所示。由此也可说明，根据PCR鉴定出的柚类S基因型准确可靠。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 基于S基因型的为柑橘柚鉴定授粉供体的试剂盒及方法
<130> TSBD181-043
<141> 2018-10-08
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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