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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510528796.2 (22)申请日 2015.08.25 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105219811 A (43)申请公布日 2016.01.06 (73)专利权人 江苏科技大学 地址 212003 江苏省镇江市京口区梦溪路2 号 (72)发明人 朱蔚杰王彦斋邢星星刘曦 赵星宇朱丹梅艺苑王俊 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 楼高潮 (51)Int.Cl. C12P 7/64(2006.01) (56)对比。
2、文件 CN 103667379 A,2014.03.26, CN 103689101 A,2014.04.02, 钟金锋等.人乳脂替代品的酶法合成及其评 价的研究进展. 食品工业科技 .2014,第35卷 (第16期),第377-384页. 张超越.无溶剂体系脂肪催化植物油改性猪 油的研究. 中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑 .2015,第2015卷(第4期),第B024- 183页. 审查员 夏颖 (54)发明名称 一种微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪 替代品及其制备方法 (57)摘要 一种微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪 替代品及其制备方法， 分别将分子筛及饱和盐溶 液放置于密。
3、闭的容器中以控制水活度； 将通过尿 素包合法纯化得到的游离脂肪酸橄榄油、 椰子油 和藻油混合， 与棕榈酸甘三酯一起作为脂肪酶酶 促酯交换的底物， 混合置于同一反应瓶中， 将反 应瓶及盛有脂肪酶的滤纸分别放入各个密闭的 容器中于室温下平衡； 上步平衡结束后， 取出底 物、 脂肪酶放入螺口玻璃瓶密闭， 分别在恒温水 域摇床及微波反应器中进行酶法酯交换反应， 经 减压蒸馏分离出反应所得到的油脂并精炼， 即得 母乳脂肪替代物。 本发明反应终产物中富含DHA 且其sn-2位上的棕榈酸含量也相对较高， 可以保 证与天然母乳脂肪中sn-2位上棕榈酸含量相当。 权利要求书1页 说明书8页 CN 1052198。
4、11 B 2019.01.18 CN 105219811 B 1.一种微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪替代品的制备方法， 其特征在于其步骤 为： 1)水活度的控制方法： 分别将分子筛及NaCl配制成饱和溶液放置于密闭的容器中， 室温下分子筛用于控制水活度0.01， 饱和溶液所控制的水活度为0.75； 将通过尿素包 合法纯化得到的游离脂肪酸橄榄油、 椰子油和藻油按照质量比为90:5:5混合； 2)脂肪酶催 化酸解： 将0.74g棕榈酸甘三酯与1.76g混合的游离脂肪酸混合后， 与0.25g sn-1,3位特异 性脂肪酶Lipozyme RM IM， 分别放在盛有饱和NaCl溶液的密闭玻璃容器内，。
5、 室温下平衡3天 后取出并混合， 反应温度为50， 微波强化功率为100W， 时间60min， 经减压蒸馏分离出反应 所得到的油脂并精炼， 即得母乳脂肪替代物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105219811 B 2 一种微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪替代品及其制备 方法 技术领域 0001 本发明涉及生物催化领域， 具体涉及一种脂肪酶催化混合油的游离脂肪酸及棕榈 酸甘三酯(tripalmitin， PPP)合成母乳脂肪替代品及其制备方法。 背景技术 0002 母乳脂肪作为婴幼儿生长发育期间的重要营养物质， 它对婴儿细胞膜的构建、 维 生素的吸收、 能量补充及智力发育有着重要的作用。 。
6、当母乳供应不足， 或者婴儿断奶后需要 增加辅食时， 母乳脂肪替代品(Human milk fat subsititute,HMFS)作为代替母乳的婴儿 喂养食物， 其结构功能应当与天然母乳脂肪及其类似， 除了提供母乳所能提供的营养物质 之外， 还必须给予婴幼儿更多有助于他们身体、 智力发育的必要元素和有机物。 添加HMFS的 配方奶粉， 在体内主要以sn-2棕榈酸甘油单酯和游离油酸的形式吸收， 防止产生游离棕榈 酸和Ga 2+形成不溶的皂钙影响脂肪酸和Ga2+的吸收， 造成大量钙质的流失(Lipid Technology,2010,22(6):126-129)， 从而引起婴幼儿便秘及腹痛。 0。
7、003 此外， 与喂食普通奶粉的婴儿相比， 喂食高含量sn-2棕榈酸配方奶粉的婴儿骨骼 矿物质的吸收率更高， 从而更好地支持婴幼儿体格和骨骼的自然成长。 因此， HMFS的化学结 构和脂肪酸组成是影响婴幼儿配方奶粉营养功能的重要因素。 0004 目前， 现阶段市场上的人工合成HMFS的原料主要有鱼油、 猪油、 牛乳脂等动物油， 棕榈油、 菜籽油等植物油， 虽然来源丰富， 但是这些底物均有相应的缺点。 如鱼油易氧化不 稳定， 猪油中含过多硬脂酸， 易使产物结块， 影响婴儿吸收并且会受人文宗教因素的限制； 牛乳代替母乳直接喂养， 难以被婴儿吸收， 已被市场所淘汰； 植物油中虽然说其组成与HMFS 。
8、具有相似性， 但是脂肪酸甘油三酯中分布结构的不同(American Dairy Science Association,2007,90(4):2147-2154)， 导致了婴儿还是难以吸收。 综上， 这些原材料来源 往往受到诸多方面的限制， 且营养价值也良莠不齐； 制备工艺过程繁琐， 不饱和脂肪酸易氧 化， 生产成本高； 不同国家、 地区、 民族、 及文化背景等地域文化的限制客观存在。 因此， 都不 是人工合成HMFS的最佳原料。 0005 近年来， 随着陆地资源的枯竭， 促使人类走向海洋寻求新型的资源， 与此同时， 易 培养、 高油脂、 富含DHA、 脂肪酸组成及分布多样化的微藻的出现带给人。
9、类前所未有的机遇。 研究表明， 藻油作为一种新兴的纯天然油脂， 其总多不饱和脂肪酸含量很高(50以上)， 含 有丰富的DHA、 DPA等-3不饱和脂肪酸(European Journal of Lipid Science and Technology,2013,115(9):965-976)， 而且具有安全、 无污染、 营养价值高等优点， 理论上是 制备功能性HMFS的优质原料。 但是， 由于藻油甘油三酯中脂肪酸组成及分布的自身特点， 其 sn-1,3位含有一定量的棕榈酸， 不利于婴幼儿的消化吸收， 不能直接用作HFMS。 因此,本专 利选择将天然的藻油进行合理的酶法结构改造， 将其与富含短碳。
10、链的椰子油、 富含单不饱 和脂肪酸的橄榄油和富含DHA的藻油按照相应的比例制备成酰基供体， 与PPP酶促合成更加 符合婴幼儿营养需求的母乳化HMFS是一种非常合理且切实可行的途径。 说明书 1/8 页 3 CN 105219811 B 3 0006 酶法制备母乳脂肪替代品， 除了上述酶和原材料的开发和研究以外还有生物催化 技术的改进。 由于油脂粘度较高， 给反应过程的传质传热效应带来负面的影响， 然而， 近年 来发展的利用低温微波技术来增强液-液非均相体系的传质是一种有效的解决油脂流动性 问题的手段(Bioresource Technology,2011,102(11):6617-6620)。。
11、 与传统反应器相比， 微 波场强化能够增强酯类合成反应的场效应， 促使酶促反应高效进行， 大大提高了目标产物 的时空产率， 缩短了反应时间， 提高酶的稳定性(Bioresource Technology,2013,149:367- 374)等优点被广泛应用于生物催化中， 尤其是非水相酶促反应中。 0007 目前 “微波辐射-酶耦合催化技术” 已被广泛应用于实验研究(Bioresource Technology,2010,101(13):4851-4861)， 用恒定的微波辐射功率结合恒定的反应温度， 使 微波的非致热效应得到显著加强。 然而， 截至目前， 利用微波辅助酶促合成母乳脂肪替代品 的。
12、文献报道较少， 但是， 考虑到微波的场致特性， 它在HMFS合成中的应用将会逐渐扩大。 因 此， 本文考察了脂肪酶催化混合游离脂肪酸与PPP反应制备HMFS的同时， 通过控制水活度来 试图提高产物得率， 将低温微波技术应用到酶促转酯化制备富含DHA的HMFS上， 分别阐明微 水、 微波对酶促转酯化的影响。 发明内容 0008 解决的技术问题： 本发明针对用于婴儿配方食品的现有HMFS及其制备方法的相关 问题， 以富油棕榈酸(C16:0)的橄榄油、 含有辛酸(C8:0)、 月桂酸(C10:0)等短碳链脂肪酸的 椰子油， 及富含DHA的微藻为原料， 提供一种微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪替代品及。
13、 其制备方法， 选择性富集甘油三酯中sn-1,3位上DHA等不饱和脂肪酸的含量， 制备出的HMFS 不用再额外添加DHA。 本方法制备出的HMFS提高了sn-2位上棕榈酸的含量， 能与母乳脂肪 sn-2位保持一致， 即60以上。 对于HMFS的功能提高有很大帮助。 0009 技术方案： 一种微波中酶促混合脂肪酸合成母乳脂肪替代品的制备方法， 其步骤 为： 1)水活度的控制方法： 分别将分子筛及LiBr、 LiCl、 CH3COOK、 Mg(NO3)26H2O、 NaCl、 KCl、 K2Cr2O7配制成饱和溶液放置于密闭的容器中， 室温下分子筛用于控制水活度 0.01， 各个饱和溶液所控制的水。
14、活度分别为0.05、 0.11、 0.23、 0.54、 0.75、 0.85、 0.95； 将通 过尿素包合法纯化得到的游离脂肪酸橄榄油、 椰子油和藻油按照质量比为70:15:1598: 1:1混合， 与棕榈酸甘三酯一起作为脂肪酶酶促酯交换的底物， 并将游离脂肪酸混合物和棕 榈酸甘三酯混合置于同一反应瓶中， 将反应瓶及盛有脂肪酶的滤纸分别放入各个密闭的容 器中于室温下平衡2-3d； 2)脂肪酶催化酸解： 上步平衡结束后， 取出底物、 脂肪酶放入螺口 玻璃瓶密闭， 分别在恒温水域摇床及微波反应器中进行酶法酯交换反应， 所述棕榈酸甘三 酯与混合游离脂肪酸的混合质量比为1:11:15， 酯交换反应。
15、后， 经减压蒸馏分离出反应所 得到的油脂并精炼， 即得母乳脂肪替代物。 0010 所述脂肪酶为Lipozyme RM IM、 Lipozyme IM60、 Lipozyme IM20、 Lipase SP435、 Lipase SP382、 Candida rugosa lipase、 Lipase MC7、 Lipozyme TL IM、 Novozym 435、 Candida antarctica lipase B、 R275A lipase或猪胰脂肪酶。 0011 所述配制成饱和溶液的溶剂为乙醇、 正丁醇、 正己烷、 环己烷、 乙酸乙酯或乙酸丁 酯。 0012 所述脂肪酶占反应体系的质。
16、量比例为115， 所述酶法酯交换反应的反应温 说明书 2/8 页 4 CN 105219811 B 4 度为3080， 反应时间为15120min。 0013 上述方法制备得到的母乳脂肪替代品。 0014 有益效果： 本发明采用sn-1,3位特异性脂肪酶催化混合脂肪酸与PPP定向合成 HMFS。 反应终产物中富含DHA且其sn-2位上的棕榈酸含量也相对较高， 可以保证与天然母乳 脂肪中sn-2位上棕榈酸含量相当， 即达到70左右。 更重要的是， 将低温微波技术应用到酶 促转酯化合成HMFS中， 为今后规模化制备HMFS提供理论基础和技术支撑， 对于国外垄断产 品的国产化、 提高富油微藻的资源利。
17、用度、 延伸我国乳品行业的产业链具有积极的现实指 导意义。 具体实施方式 0015 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0016 用于脂肪酸的定性定量分析的方法是高效气相色谱， 其条件为： 采用Agilent 6820气相色谱仪， 型号HP-INNOWAX， 色谱柱长30m,外径0.25mm， 内径0.25 m， 采用梯度升温 方式， 初始温度80， 柱箱最高温度250， 。
18、后进样口最高温度250， 后检测器最高温度280 ， 总计43min， 进样量为1 L。 0017 实施例1 0018 本实施例说明酯交换所用底物的脂肪酸组成分析。 0019 分别将橄榄油、 椰子油、 藻油通过尿素包合法纯化得到游离脂肪酸， 将三种油的游 离脂肪酸按照质量比为70:15:1598:1:1(橄榄油:椰子油:藻油)混合后经过气相色谱测 定， 得到橄榄油、 椰子油和藻油以及混合游离脂肪酸中(以质量比橄榄油:椰子油:藻油 90:5:5为例)各个脂肪酸的含量见下表1。 后续实施例所用混合游离脂肪酸均以本实施例为 原料。 0020 表1橄榄油、 椰子油和藻油以及混合油(橄榄油:椰子油:藻油。
19、90:5:5)中各个脂 肪酸的含量 说明书 3/8 页 5 CN 105219811 B 5 0021 0022 a:未检测到 0023 以下实施例说明以脂肪酶作催化剂催化酯化反应的过程。 0024 实施例2 0025 将PPP(0.62g)与混合游离脂肪酸(1.88g)摩尔比1:9混合后， 加入sn-1,3位特异性 脂肪酶Lipozyme RM IM 10(0.25g)， 放入60水浴摇床中反应3h。 0026 反应结束后取出500 L， 加入60mg猪胰脂肪酶水解3min， 用乙醚萃取， 取有机层进 行薄层层析， 刮取sn-2位单甘脂条带。 加入2mL正己烷和2mL 0.5mol KOH-。
20、甲醇溶液在65 水浴摇床中反应60min进行甲酯化， 然后进行气相色谱检测， 测得产物油脂中各脂肪酸含量 如下表2。 0027 0028 实施例3 0029 将PPP(0.74g)与混合的游离脂肪酸(1.76g)摩尔比1:7混合后， 加入sn-1,3位特异 性脂肪酶Lipozyme RM IM 6(0.15g)， 放入60水浴摇床中反应3h。 0030 反应结束后取出500 L， 加入60mg猪胰脂肪酶水解3min， 用乙醚萃取， 取有机层进 行薄层层析， 刮取sn-2位单甘脂条带。 加入2mL正己烷和2mL 0.5mol KOH-甲醇溶液在65 水浴摇床中反应60min进行甲酯化， 然后进行。
21、气相色谱检测， 测得产物油脂中各脂肪酸含量 如下表3。 说明书 4/8 页 6 CN 105219811 B 6 0031 0032 实施例4 0033 将PPP(0.74g)与混合的游离脂肪酸(1.76g)摩尔比1:7混合后， 加入sn-1,3位特异 性脂肪酶Lipozyme RM IM 10(0.25g)， 放入70水浴摇床中反应3h。 0034 反应结束后取出500 L， 加入60mg猪胰脂肪酶水解3min， 用乙醚萃取， 取有机层进 行薄层层析， 刮取sn-2位单甘脂条带。 加入2mL正己烷和2mL 0.5mol KOH-甲醇溶液在65 水浴摇床中反应60min进行甲酯化， 然后进行气。
22、相色谱检测， 测得产物油脂中各脂肪酸含量 如下表4。 0035 0036 实施例5 0037 将PPP(0.93g)与混合的游离脂肪酸(1.57g)摩尔比1:5混合后， 加入sn-1,3位特异 性脂肪酶Lipozyme RM IM 10(0.25g)， 反应温度为60， 微波强化功率为100W， 时间 60min。 0038 反应结束后取出500 L， 加入60mg猪胰脂肪酶水解3min， 用乙醚萃取， 取有机层进 行薄层层析， 刮取sn-2位单甘脂条带。 加入2mL正己烷和2mL 0.5mol KOH-甲醇溶液在65 水浴摇床中反应60min进行甲酯化， 然后进行气相色谱检测， 测得产物油脂。
23、中各脂肪酸含量 如下表5。 0039 0040 a： 未检测到 0041 实施例6 0042 将PPP(0.62g)与混合的游离脂肪酸(1.88g)摩尔比1:9混合后， 加入sn-1,3位特异 性脂肪酶Lipozyme RM IM 8(0.20g)， 反应温度为50， 微波强化功率为100W， 时间 60min。 说明书 5/8 页 7 CN 105219811 B 7 0043 反应结束后取出500 L， 加入60mg猪胰脂肪酶水解3min， 用乙醚萃取， 取有机层进 行薄层层析， 刮取sn-2位单甘脂条带。 加入2mL正己烷和2mL 0.5mol KOH-甲醇溶液在65 水浴摇床中反应60。
24、min进行甲酯化， 然后进行气相色谱检测， 测得产物油脂中各脂肪酸含量 如下表6。 0044 0045 a： 未检测到 0046 实施例7 0047 将PPP(0.74g)与混合的游离脂肪酸(1.76g)摩尔比1:7混合后， 加入sn-1,3位特异 性脂肪酶Lipozyme RM IM 10(0.25g)， 反应温度为50， 微波强化功率为100W， 时间 30min。 0048 反应结束后取出500 L， 加入60mg猪胰脂肪酶水解3min， 用乙醚萃取， 取有机层进 行薄层层析， 刮取sn-2位单甘脂条带。 加入2mL正己烷和2mL 0.5mol KOH-甲醇溶液在65 水浴摇床中反应60。
25、min进行甲酯化， 然后进行气相色谱检测， 测得产物油脂中各脂肪酸含量 如下表7。 0049 0050 a： 未检测到 0051 实施例8 0052 将PPP(0.74g)与混合的游离脂肪酸(1.76g)摩尔比1:7混合后， 加入sn-1,3位特异 性脂肪酶Lipozyme RM IM 10(0.25g)， 反应温度为30， 微波强化功率为100W， 时间 60min。 0053 反应结束后取出500 L， 加入60mg猪胰脂肪酶水解3min， 用乙醚萃取， 取有机层进 行薄层层析， 刮取sn-2位单甘脂条带。 加入2mL正己烷和2mL 0.5mol KOH-甲醇溶液在65 水浴摇床中反应60。
26、min进行甲酯化， 然后进行气相色谱检测， 测得产物油脂中各脂肪酸含量 如下表8。 说明书 6/8 页 8 CN 105219811 B 8 0054 0055 a： 未检测到 0056 实施例9 0057 将PPP(0.74g)与混合的游离脂肪酸(1.76g)摩尔比1:7混合后， 与sn-1,3位特异性 脂肪酶Lipozyme RM IM 10(0.25g)， 分别放在盛有分子筛(aw0.01)的密闭玻璃容器 内， 室温下平衡3天后取出并混合。 反应温度为50， 微波强化功率为100W， 时间60min。 0058 反应结束后取出500 L， 加入60mg猪胰脂肪酶水解3min， 用乙醚萃取。
27、， 取有机层进 行薄层层析， 刮取sn-2位单甘脂条带。 加入2mL正己烷和2mL 0.5mol KOH-甲醇溶液在65 水浴摇床中反应60min进行甲酯化， 然后进行气相色谱检测， 测得产物油脂中各脂肪酸含量 如下表9 0059 0060 a： 未检测到 0061 实施例10 0062 将PPP(0.74g)与混合的游离脂肪酸(1.76g)摩尔比1:7混合后， 与sn-1,3位特异性 脂肪酶Lipozyme RM IM 10(0.25g)， 分别放在盛有饱和NaCl溶液(aw0.75)的密闭玻璃 容器内， 室温下平衡3天后取出并混合。 反应温度为50， 微波强化功率为100W， 时间60mi。
28、n。 0063 反应结束后取出500 L， 加入60mg猪胰脂肪酶水解3min， 用乙醚萃取， 取有机层进 行薄层层析， 刮取sn-2位单甘脂条带。 加入2mL正己烷和2mL 0.5mol KOH-甲醇溶液在65 水浴摇床中反应60min进行甲酯化， 然后进行气相色谱检测， 测得产物油脂中各脂肪酸含量 如下表10。 0064 0065 a： 未检测到 0066 实施例11 说明书 7/8 页 9 CN 105219811 B 9 0067 本方法定向合成的HMFS中总脂肪酸及sn-2位脂肪酸含量与母乳脂肪的对比情况 如表11所示。 与母乳脂肪相比， 本方法制得的反应终产物中油酸结合率高达54 .40 1.76， 富含短碳链脂肪酸， 且其sn-2位棕榈酸含量相对较高， 有利于促进婴幼儿的消化吸 收。 0068 表11.本方法制备的HMFS中总脂肪酸及sn-2位脂肪酸与母乳脂肪对比 0069 0070 a： 未检测到； b:Journal of Agriculturaland Food Chemistry.2012,61(1): 167-175. 0071 注： 表11中所述HMFS具体数据对应实施例10。 说明书 8/8 页 10 CN 105219811 B 10 。