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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510953561.8 (22)申请日 2015.12.18 C12N 15/10(2006.01) (71)申请人 李文娴 地址 065201 河北省廊坊市三河市燕郊开发 区创业大厦 B405 (72)发明人 李文娴 (74)专利代理机构 北京誉加知识产权代理有限 公司 11476 代理人 郝颖洁 张争艳 (54) 发明名称 一种提取 RNA 的提取液和方法 (57) 摘要 本发明属于分子生物学技术领域， 涉及核酸 的提取。 具体而言， 本发明提供一种可以用于水煮 法提取 RNA 的提取液以及一种水煮法提取 RNA 的 方法， 用。
2、于提取病毒拭子、 全血等样品中的 RNA。 本发明的RNA提取液包含RNA酶抑制剂、 阳离子螯 合剂、 去污剂和反应缓冲液等成分。 利用本发明的 RNA 提取液和方法通过水煮法即可获得能够用于 PCR反应的RNA， 使得RNA的提取简单易行， 成本降 低。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 CN 105441425 A 2016.03.30 CN 105441425 A 1.一种RNA提取液， 包含RNA酶抑制剂、 阳离子螯合剂、 去污剂和反应缓冲液， 其中所述 RNA酶抑制剂为尿素和氧钒核糖核酸复合物中的。
3、一种或几种的组合， 所述阳离子螯合剂为 EDTA、 8-羟基喹啉螯合树脂、 聚苯乙烯吡啶树脂、 Chelex-100树脂、 壳聚糖改性树脂、 冠醚树 脂和丝瓜络中的一种或几种的组合， 所述去污剂是吐温20、 Triton-X100和对羟基苯甲酸甲 酯中的一种或几种的组合， 所述反应缓冲液是醋酸钾/冰醋酸缓冲液、 氯化钾/HCl缓冲液、 甘氨酸/盐酸缓冲液或HAc/NaAc缓冲液。 2.根据权利要求1所述的RNA提取液， 其中， 所述尿素的浓度是14M， 优选为2.2M； 所述 氧钒核糖核酸复合物的浓度是10100mM， 优选为30mM。 3.根据权利要求1所述的RNA提取液， 其中， 所述ED。
4、TA的浓度是0.15mM， 优选为1.5mM； 所述8-羟基喹啉螯合树脂的浓度是510W/V， 优选为8W/V； 所述聚苯乙烯吡啶树脂 的浓度是510W/V， 优选为8W/V； 所述Chelex-100树脂的浓度是510W/V， 优选 为8W/V； 所述壳聚糖改性树脂的浓度是510W/V， 优选为8W/V； 所述冠醚树脂的浓 度是510W/V， 优选为8W/V； 所述丝瓜络的浓度是510W/V， 优选为8W/V。 4.根据权利要求1所述的RNA提取液， 其中， 所述吐温20的浓度是0.12W/V， 优选 为0.5W/V； 所述Triton-X100的浓度是0.12W/V， 优选为0.5W/V；。
5、 所述对羟基苯甲 酸甲酯的浓度是0.10.2W/V， 优选为0.1W/V。 5.根据权利要求1所述的RNA提取液， 其中， 所述反应缓冲液的pH值范围是4.05.5， 优 选为4.8。 6.根据权利要求5所述的RNA提取液， 其中， 所述醋酸钾/冰醋酸缓冲液的浓度以钾离子 计算是20500mM， 优选为100mM； 所述氯化钾/HCl缓冲液的浓度以钾离子计算是20 500mM， 优选为100mM； 所述甘氨酸/盐酸缓冲液的浓度以甘氨酸计算是10100mM， 优选为 50mM； 所述HAc-NaAc缓冲液的浓度以钠离子计算是50500mM， 优选为200mM。 7.根据权利要求1-6任意一项所述。
6、的RNA提取液， 其成分为2.2M尿素、 30mM氧钒核糖核 酸复合物、 1.5mMEDTA、 8W/VChelex-100树脂、 0.5W/V吐温20、 0.5W/VTritonX- 100、 0.1W/V对羟基苯甲酸甲酯、 以甘氨酸计算浓度为50mM的甘氨酸/盐酸缓冲液、 pH4.8。 8.一种提取RNA的方法， 包括： 向样品中加入权利要求1-7任意一项所述的RNA提取液， 样品与RNA提取液的体积比为3:1， 95100加热520min， 剧烈振荡， 1200014000rpm离 心1530s。 9.一种提取RNA的试剂盒， 所述试剂盒包含权利要求1-7任意一项所述的RNA提取液。 1。
7、0.权利要求1-7任意一项所述的RNA提取液在水煮法提取RNA中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 105441425 A 2 一种提取RNA的提取液和方法 技术领域 0001 本发明属于分子生物学技术领域， 涉及核酸的提取。 背景技术 0002 分子生物学实验经常需要从样品中提取核酸物质， 用于后续的PCR扩增。 目前， 提 取DNA通常采用水煮法， 即， 通过水煮10-20分钟裂解样品， 利用EDTA、 Chelex-100树脂等螯 合剂螯合掉样品裂解后所释放的干扰后续PCR反应的金属离子， 从而得到可用于PCR反应的 DNA。 水煮法具有简便、 易操作、 核酸提取率高等特点， 广。
8、泛应用于疾控、 法医等领域(杨电， 刘超， 徐曲毅， 胡慧英.Chelex-100法提取脱落细胞检材DNA的实时定量研究J.刑事技术 .2009(05)； 钱雪琴， 张军， 沈芳.Chelex-100法和碱性裂解法提取细菌DNA的比较J.中国 卫生检验杂志.2008(08)。 RNA通常用TRIzol法、 硅胶柱和磁珠法等方法提取(Trizol： 美国 专利号5346994； 钟海军， 唐孝亮， 曾刚毅.核酸纯化柱提取核酸定量检测丙型肝炎病毒RNA 的临床应用J.检验医学与临床.2008(13)； 何世成， 林源， 王昌建， 刘道新， 谭丹， 唐小明， 王卫国， 鲁杏华， 邱立新， 何玉玲.五。
9、种核酸提取法对猪繁殖与呼吸综合征病毒提取效率的 比较.J.中国动物检疫.2014(8)。 然而TRIzol法中使用的重蒸酚具有毒性； 硅胶法、 磁珠 法等费用较高， 且提取率不高； 而普通的水煮法无法直接用于提取RNA， 主要是因为样品中 存在内源性的RNA酶， 而这些RNA酶会将RNA降解。 因此， 本领域需要一种能够简便易操作且 能够高效率提取RNA的方法。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种可以用于水煮法提取RNA的提取液以及一种水煮法提取 RNA的方法， 以解决水煮法不能提取用于PCR的RNA的问题。 0004 本发明的一个方面是提供一种RNA提取液， 用于提取病毒(包括但不限。
10、于流感病 毒)拭子、 全血等样品中的RNA， 所述提取液包含RNA酶抑制剂、 阳离子螯合剂、 去污剂和反应 缓冲液等成分， 其中所述RNA酶抑制剂为尿素和氧钒核糖核酸复合物中的一种或几种的组 合， 所述阳离子螯合剂为EDTA、 8-羟基喹啉螯合树脂、 聚苯乙烯吡啶树脂、 Chelex-100树脂、 壳聚糖改性树脂、 冠醚树脂和丝瓜络中的一种或几种的组合， 所述去污剂是吐温20、 Triton-X100和对羟基苯甲酸甲酯中的一种或几种的组合， 所述反应缓冲液是醋酸钾/冰醋 酸缓冲液、 氯化钾/HCl缓冲液、 甘氨酸/盐酸缓冲液或HAc/NaAc缓冲液。 0005 优选地， 所述尿素的浓度是14M。
11、； 更优选地， 尿素的浓度是2.2M。 0006 优选地， 所述氧钒核糖核酸复合物的浓度是10100mM； 更优选地， 氧钒核糖核酸 复合物的浓度是30mM。 0007 优选地， 所述EDTA的浓度是0.15mM； 更优选地， 所述EDTA的浓度是1.5mM。 0008 优选地， 所述8-羟基喹啉螯合树脂的浓度是510W/V， 更优选地， 8-羟基喹啉 螯合树脂的浓度是8W/V。 0009 优选地， 所述聚苯乙烯吡啶树脂的浓度是510W/V， 更优选地， 聚苯乙烯吡啶 说明书 1/4 页 3 CN 105441425 A 3 树脂的浓度是8W/V。 0010 优选地， 所述Chelex-100。
12、树脂的浓度是510W/V， 更优选地， Chelex-100树脂 的浓度是8W/V。 0011 优选地， 所述壳聚糖改性树脂的浓度是510W/V， 更优选地， 壳聚糖改性树脂 的浓度是8W/V。 0012 优选地， 所述冠醚树脂的浓度是510W/V， 更优选地， 冠醚树脂的浓度是8 W/V。 0013 优选地， 所述丝瓜络的浓度是510W/V， 更优选地， 丝瓜络的浓度是8W/V。 0014 优选地， 所述吐温20的浓度是0.12W/V， 更优选地， 吐温20的浓度是0.5W/ V。 0015 优选地， 所述Triton-X100的浓度是0.12W/V， 更优选地， Triton-X100的浓。
13、 度是0.5W/V。 0016 优选地， 所述对羟基苯甲酸甲酯的浓度是0.10.2W/V， 更优选地， 对羟基苯 甲酸甲酯的浓度是0.1W/V。 0017 优选地， 所述醋酸钾/冰醋酸缓冲液的浓度(钾离子浓度)是20500mM， 更优选地， 浓度是100mM； 该缓冲液的pH值范围是4.05.5， 更优选地， pH值是4.8。 0018 优选地， 所述氯化钾/HCl缓冲液的浓度(钾离子浓度)是20500mM， 更优选地， 浓 度是100mM； 该缓冲液pH值范围是4.05.5， 更优选地， pH值是4.8。 0019 优选地， 所述甘氨酸/盐酸缓冲液的浓度(甘氨酸浓度)是10100mM， 更优。
14、选地， 浓 度是50mM； 该缓冲液pH值范围是4.05.5， 更优选地， pH值是4.8。 0020 优选地， 所述HAc-NaAc缓冲液的浓度(钠离子浓度)是50500mM， 更优选地， 浓度 是200mM； 该缓冲液的pH值范围是4.05.5， 更优选地， pH值是4.8。 0021 进一步地， 一种优选的提取液的成分为： 尿素2.2M， 氧钒核糖核酸复合物30mM， EDTA1.5mM， Chelex-100树脂8W/V， 吐温200.5W/V， TritonX-1000.5W/V， 对羟基苯甲 酸甲酯0.1W/V， 甘氨酸/盐酸缓冲液(甘氨酸浓度)50mM， pH4.8。 0022 。
15、本发明的第二个方面提供一种提取RNA的方法， 包括： 向样品中加入本发明的RNA 提取液， 样品与RNA提取液的体积比为3:1， 95100加热520min， 取出后用振荡器剧烈 振荡， 1200014000rpm离心1530s。 0023 本发明的第三个方面是提供一种提取RNA的试剂盒， 所述试剂盒包含本发明的RNA 提取液。 0024 本发明的第四个方面是提供本发明的RNA提取液在水煮法提取RNA中的应用。 0025 本发明的方法中， 依靠高温水煮来裂解样品并释放核酸。 释放核酸的同时， 会有一 部分杂质阳离子也被释放出来， 这部分离子会干扰实验， 用阳离子螯合剂螯合掉； 同时用去 污剂去。
16、除样本中的脂质、 脂蛋白等。 缓冲液选择酸性条件的缓冲液， 且不含磷酸根、 柠檬酸 根等可能与Mg离子结合沉淀的离子。 释放核酸的同时， 会有内源性RNA酶释放出来。 选用合 适的抑制剂， 如尿素或氧钒核糖核酸复合物等， 既能灭活RNA酶(尿素可以变性蛋白)， 又不 会干扰后面的PCR反应(Taq酶可以耐受)， 从而避免RNA被降解， 仅利用水煮法即可获得能够 用于PCR反应的RNA， 使得RNA的提取简单易行， 成本降低。 说明书 2/4 页 4 CN 105441425 A 4 附图说明 0026 图1是TRIzol法(ThermoFisher货号： 15596-026， 按说明书操作)提。
17、取禽流感病毒 H5亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图； 0027 图2是利用本发明的水煮法提取禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩 增图； 0028 图3是TRIzol法(ThermoFisher货号： 15596-026， 按说明书操作)提取禽流感病毒 H7N9亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR扩增图； 0029 图4是利用本发明的水煮法提取禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原RNA的PCR 扩增图； 0030 图5是阴性对照结果图。 具体实施方式 0031 下面结合具体的实施方式说明本发明， 但本发明的范围不限于此。 0032 下述实施例中， 如无特别说明， 所使用的。
18、试剂、 耗材为本领域常规试剂和耗材， 可 以从普通的化学和生物试剂商店或供货商处购买； 所使用的方法为分子生物学领域的常规 方法， 本领域技术人员根据本领域常识可以明确知道如何进行所述实验。 0033 分别取180 L禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原(购自哈尔滨维科生物技术开 发公司,2mL1xPBSpH7.4稀释)、 禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原(购自哈尔滨维 科生物技术开发公司)， 用如下方法提取： 0034 a)配制100mLRNA提取液， 配方如下： 0035 0036 b)取1.5mLPCR管， 加入待检样本液180 L； 0037 c)加入提取液60 L， 混匀， 10。
19、0水煮1520min； 0038 d)取出， 剧烈振荡510s， 12000rpm离心15s； 0039 e)取上清液35 L作为RNA模版。 0040 由于市场上并无水煮法提取RNA的方法， 所以以Trizol试剂(ThermoFisher货号： 15596-026)， 按说明书操作试剂， 分别对禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原、 禽流感病毒 H7N9亚型血凝抑制试验抗原进行提取， 作为对照。 分别取180 L禽流感病毒H5亚型血凝抑制 说明书 3/4 页 5 CN 105441425 A 5 试验抗原、 禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原， 按如下步骤进行提取： 0041 a)取1.。
20、5mLPCR管， 加入待检样品液180 L； 0042 b)加入400 LTRIzol和180 L氯仿， 振荡， 12000rpm离心10分钟， 取上清液； 0043 d)加入等体积异丙醇洗涤， 振荡， 12000rpm离心10分钟， 弃上清液； 0044 e)加入2倍体积的DEPC酒精洗涤， 振荡， 12000rpm离心10分钟， 弃上清液； 0045 f)超净工作台简单吹干， 加入240 LDEPC水。 0046以上实验和对照， 每组设置4次重复， 全部提取完之后， 使用AIV- MatrixReagents(lifetechnology)进行扩增， 扩增条件为4515min， 9515m。
21、in； 95 15s， 5845s， 40个循环。 扩增结果如下： 0047 使用TRIzol法提取的禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原， 4个重复的CT值分别 为16.75、 15.97、 16.39、 14.8(图1)； 使用水煮法提取RNA的4个重复， CT值分别为15.97、 14.75、 14.36、 15.71(图2)。 结果证实， 水煮法可以提取出禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验 抗原， 并且其灵敏度高于TRIzol法。 0048 使用TRIzol法提取的禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试验抗原， 4个重复的CT值分 别为21.73、 21.06、 22.18、 20.71(图3)； 使用水煮法提取RNA的4个重复， CT值分别为18.96、 19.49、 16.81、 18.68(图4)。 结果证实， 水煮法可以提取出禽流感病毒H7N9亚型血凝抑制试 验抗原， 并且其灵敏度高于TRIzol法。 0049 以上实验以H7N9阴性的鸡囊胚液作为阴性对照， 按照上述方法进行相同的实验， 结果均成立(图5)。 说明书 4/4 页 6 CN 105441425 A 6 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 7 CN 105441425 A 7 图4 图5 说明书附图 2/2 页 8 CN 105441425 A 8 。