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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410360111.3 (22)申请日 2014.07.28 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) (71)申请人 广州君赫生物科技有限公司 地址 510000 广东省广州市广州国际生物岛 螺旋三路一号办公区第六层 609、 610 房 (72)发明人 朱威 贺雄雷 郭蕾 雷楗勇 潘武广 (54) 发明名称 检测男性不育症 Galntl5 基因 1 个致病突变 位点的试剂盒及其 PCR 扩增方法 (57) 摘要 本发明公开了一种检测男性不育症 Galntl5 基因中 1 个致病突变位点的试剂盒。
2、及其 PCR 扩增 方法。其方法特点是经耐 3 -5 外切酶酶切修饰 的突变检测引物在高保真 DNA 聚合酶参与的 PCR 反应中， 从而提高 PCR 的特异性， 可直接观察凝胶 电泳的产物条带的有无来判断 Galntl5 基因相应 突变位点的基因型。本检测试剂盒对仪器设备要 求低， 操作简单， 经济， 无需测序， 一般分子生物学 实验室即可操作。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表2页 附图1页 CN 105316394 A 2016.02.10 CN 105316394 A 1/1 页 2 1. 一种检测人。
3、类男性不育症致病基因突变的 PCR 试剂盒， 其特征在于 ： 所述试剂盒包 括检测男性不育症 Galntl5 基因中 1 个致病突变位点 G323A 的一组特异性引物中及 PCR 反 应 mix。 2. 根据权利要求 1， 以男性不育症 Galntl5 基因致病位点 G323A 所在的 Galntl5 基因 的第2外显子DNA序列为模板设计引物， 其特征在于 ： 针对致病位点G323A所设计的引物对 中， 正常模板配对引物中上游引物的 3 端含有序列 AGTAGA， 突变模板配对引物中上游引物 的 3 端含有序列 AGTAAA ； 其中 3 端的 -3 与 -2 位碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫。
4、酰修饰， 或将 -2 位碱基经锁核酸化 （LNA） 修饰。 3. 根据权利要求 2， 优选的一组特异性引物的序列分别如下所示 ： 正常模板配对引物 G323A N F ： 5 -GTGATTATCAGTAGA-3 ； 突变模板配对引物 G323A M F ： 5 - GTGATTATCAGTAAA-3 ； 共同的下游引物 G323A R ： 5 -AACACATTTTGTGCC-3 ； 其中， 所 述正常模板配对引物 G323A N F 和突变模板配对引物 G323A M F 的 3 端的 -3 与 -2 位碱 基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰， 或将 -2 位碱基经锁核酸化 （LNA） 修饰。
5、。 4. 根据权利要求 3， 所述正常模板配对引物及突变模板配对引物的 3 端的 -3 与 -2 位 碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰， 或将 -2 位碱基经锁核酸化 （LNA） 修饰。 5. 一种采用权利要求 1 和 2 检测人类男性不育症 Galntl5 基因中 1 个致病突变位点 G323A的PCR扩增方法， 其特征在于 ： PCR扩增由预变性和30-40次扩增温度循环组成， 循环 条件为95 预变性10 min， 94 变性30 sec， 55 退火30 sec， 72 延伸30 sec， 循环 30-40 次， 循环结束后 72 补齐延伸 10 min 后反应结束。 权 利 要 求。
6、 书 CN 105316394 A 2 1/4 页 3 检测男性不育症 Galntl5 基因 1 个致病突变位点的试剂盒 及其 PCR 扩增方法 技术领域 0001 本发明属于生物医学领域中的临床检测技术， 涉及对人类男性不育症基因致病突 变位点的检测方法。 0002 本发明提供一种检测人类男性不育症致病基因突变的 PCR 试剂盒。本发明的内容 涉及一种检测男性不育症 Fkbp6 基因中 1 个致病突变位点的试剂盒及其 PCR 扩增方法， 该 检测结果可用来临床辅助检测男性不育症。 背景技术 0003 男性不育症， 是指男子在规律性生活且未避孕的情况下， 一年内未使健康配偶妊 娠。 男性不育症。
7、 （Male Infertility） 严重影响现代男性健康和家庭幸福， 据 WTO 统计表 明 ： 育龄夫妇约 15% 不能生育， 其中男性因素占 50%。导致男性不育的原因复杂广泛， 涉及 生殖系统解剖结构和功能、 激素调节、 遗传物质、 感染免疫等诸多方面的异常和障碍。其中 相当一部分属于原因不明的特发性不育， 包括特发性无精子、 弱精子、 少精子、 畸形精子症。 0004 目前， 分子生物学方法已经深入到男性不育症研究当中。导致男性不育的遗传损 害是多种多样的， 除了染色体非整倍体畸形和基因重排， 还包括微缺失和单个基因缺陷。 小 鼠和果蝇基因敲除实验发现超过 3000 个基因涉及雄性。
8、生育能力的遗传调控， 相关基因不 仅涉及生精细胞系， 还包括与性腺及躯体发育相关的功能基因调控网络。目前发现了一大 批涉及男性不育的染色体畸形和多效性单基因遗传病。 0005 1AZF 基因 1976 年 , Tiepolo 和 Zuffardi 通过核型分析发现了 6 例无精子症患者 Y 染色体长臂 的微缺失并提出了无精子因子 （AZF） 概念， 随后的研究将其定位于 Yq11.23， AZFa 缺失表 现为唯支持细胞综合征， AZFb 缺失表现为生精阻滞， AZFc 缺失的病理表现为从正常到无精 子。 AZF并不是单一的基因， 而是在功能上相互关联的基因家族， 在精子发生、 发育和成熟中 。
9、发挥重要作用， 各种研究表明严重精子发生障碍包括无精子症患者中约有3%-15%具有Y染 色体微缺失。 0006 2X 来源睾丸特异性逆基因 在精子发生的减数分裂期， 性染色体隔离为 XY 小体， 处于转录失活状态， X 染色体上活 跃表达的管家基因也停止转录， 而在此时， 常染色体上一些 X 染色体来源睾丸特异性逆基 因开始转录表达， 对其前辈基因的缺失表达起到补偿作用， 这称为补偿假说， 该假说认为逆 基因在精子发生中发挥重要作用， 它们的突变可能导致男性不育症的发生。一名少精子症 男子发生在 10q22 的交互易位， CSTE2T 基因就位于 10q22q23, 研究推断少精子症的发生 与。
10、其有关。 0007 3. 性激素相关基因 比较常见的有雄激素受体基因 （AR） ， 卵泡刺激素受体基因 （FSHR） ， 黄体生成素受体基 因 （LHR） ， 促性腺激素基因 , 促性腺激素释放激素受体基因 （GnRHR ） 。其中， 人 FSH 受体基 说 明 书 CN 105316394 A 3 2/4 页 4 因第 7 个外显子的纯合子点突变表现为不同程度的生精损害。LHR 基因突变导致的功能丧 失会引起睾丸间质细胞发育不良， 轻者表现为性腺功能减退， 重者表现为男性假两性畸形。 FSH-b 突变的男性呈现无精子症的表现。 0008 4. 线粒体相关基因 线粒体DNA的完整性和精子活动及。
11、精液质量普遍相关。 KaoS在1995年发现， 活动力最 低的精子细胞拥有最高的4977bp mtDNA缺失率， 认为mtDNA突变在精子病变中发挥重要作 用。 0009 5. 人类生精阶段标志基因 精子的生成需要经历有丝分裂、 减数分裂和精子形成等几个阶段， 不育症患者可出现 不同阶段的生精阻滞。 研究发现， 在某一个阶段特异性的表达某些调控生精的关键基因， 利 用睾丸活检组织进行特定基因表达谱检测， 就可了解精子发生阻滞的阶段。 0010 随着分子生物学技术的进步和男性不育症致病基因定位的日渐明确， 通过聚合酶 链式反应 （PCR） 和基因测序等技术进行分子检测逐渐大行其道， 其中，“分子。
12、开关” 检测突变 由于其操作简单、 不用测序、 成本低廉等优势， 成为广泛应用的一项技术。 0011 高保真DNA聚合酶在进行DNA扩增时， 当引物与模板完全配对时， 则在聚合酶的聚 合中心直接进行聚合反应 ； 当引物与模板不完全配对时， 则送到酶解中心进行校正， 校正后 的引物再被送回聚合中心进行聚合反应 ； 如果引物不能被即时校正， 则 PCR 反应无法正常 进行， 从而引发聚合反应的非成熟性终止。于是产生了 “配对引物可以延伸， 不配对引物不 延伸” 二元化效果。 在进行点突变分析时， 就可以利用这种二元化效果对特定位点进行非此 即彼的二元化识别。而且， 聚合酶对错配碱基的识别并不局限于。
13、引物的 3 末端或新生 DNA 分子， 也能识别 3 末端上游 1 个至数个碱基距离的错配。根据这一特征， 可以认为高保真 聚合酶对 DNA 合成时的碱基错配存在一个反复识别的过程。由此， 可以将耐外切酶消化的 硫化磷酸修饰的碱基特异性引物结合具有 3 -5 外切酶活性的高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 反应， 而构成了受单碱基差异调控的复合突变敏感性 “分子开关” 。 0012 该突变敏感性 “分子开关” 已经成功应用于神经性耳聋GJB3基因和苯丙酮尿症 PAH基因突变位点的检测 ； 对性染色体以及线粒体上的 SNP 位点的检测也取得成功， 说明 “分子开关” 突变检测技术是一种简便经济实。
14、用的突变检测方法。本专利运用突变敏感性 “分子开关” 突变检测技术， 建立了男性不育症 Fkbp6 基因的 1 个致病突变位点的检测方法。 发明内容 0013 本发明的目的在于提供了一种检测人类男性不育症致病基因突变的 PCR 试剂盒 及相应的 PCR 扩增方法。目的是建立导致人类男性不育症的 Fkbp6 基因中 1 个致病突变位 点的检测方法， 该检测结果用于判读患者是否携带 Fkbp6 致病突变。 0014 本发明的技术要点是设计引物， 根据目的片段的有无为临床诊断提供依据。为实 现上述目的， 本发明采用的技术方案如下 ： 根据男性不育症的 Fkbp6 基因中 1 个致病突变位点 T141。
15、G 设计以下引物 ： 正常模板配对引物 T141G N F ： 5 -TCCGAGAAGGAGCTG-3 ； 突变模板配对引物 T141G M F ： 5 - TCCGAGAAGGAGCGG-3 ； 共同的下游引物 T141G R ： 5 -AGGCTGAGGCAGGAG-3 。其中， 所述正常模板配对引物 T141G N F 和突变模板配对引物 T141G M F 的 3 端的 -3 与 -2 位 说 明 书 CN 105316394 A 4 3/4 页 5 碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰， 或将 -2 位碱基经锁核酸化 （LNA） 修饰。其扩增产 物长度 284bp， 其序列见序列表中。
16、的序列 4。 0015 本发明提供了检测一种男性不育症 Fkbp6 基因中 1 个致病突变位点 T141G 的试剂 盒， 包括 ： 2 PCR 反应 mix。mix 中含有 PCR 反应缓冲液、 dNTP、 引物、 耐热性高保真pfu DNA 聚合酶、 溴酚蓝上样缓冲液。 0016 为达到上述目的， 本发明采用的技术方案是 ： 一种采用权利要求1和4所述的试剂 盒检测男性不育症 Fkbp6 基因 1 个致病突变位点的一套操作流程， 包括 ： 1， PCR 扩增采用权利要求书 1 的一组引物。 0017 2， PCR 扩增由预变性和 30-40 次扩增温度循环组成。PCR 反应条件为 ： 95 。
17、预变 性 10 min， 94 变性 30 sec， 55 退火 30 sec， 72 延伸 30 sec， 循环 30-40 次。循环 结束后 72 补齐延伸 10 min 后反应结束。琼脂糖电泳分析鉴定 PCR 产物。将样品及阳性 和阴性对照一起电泳鉴定， 完成后， 将凝胶经溴化乙锭染色后在紫外灯下观察， 比较各泳道 电泳条带情况， 以判定样品为受检样品是否带有致病突变。 0018 上述技术方案中， 所述引物是 PCR 技术中重要的组成部分， 它是一小段单链 DNA， 作为 DNA 复制的起始点。 0019 上述方案中， 在运用 PCR 扩增方法时， 将以上所列针对不同突变位点的一组引物 。
18、中， 突变模板配对引物与下游引物为一对， 正常模板配对引物与下游引物为另外一对， 这两 对引物分别与该组对应检测位点基因型位置的 DNA 模板， PCR 反应 mix 构成两个单独的反 应体系 ； 分别对 2 个单独的反应体系进行 PCR 扩增。 0020 由于上述技术方案的运用， 本发明与现有技术相比具有下列优点和效果 ： 1， 本发明采用特殊设计并经修饰的引物， 其 PCR 产物特异性非常高。利用该基因检测 方法， 在完成 PCR 反应和凝胶电泳后， 可直接观察产物条带的有无来判断男性不育症Fkbp6 基因 1 个致病突变位点的基因型。 0021 2， 本发明操作简单， 经济， 无需测序，。
19、 一般分子生物学实验室即可操作。 附图说明 0022 附图 1 ： 本发明采用 PCR 扩增方法检测Fkbp6基因 T141G 位点得到的凝胶电泳图 （第一组引物， 三个样本） 。 0023 第 1 泳道， 100bp DNA Ladder Marker， 条带大小 （bp） 由上至下分别为 1500、 1000、 900、 800、 700、 600、 500、 400、 300、 200、 100 （下同） ； 第2泳道， 样品1， 引物T141G N F和T141G R 配对的 PCR 产物电泳图 ； 第 3 泳道， 样品 1， 引物 T141G M F 和 T141G R 配对的 PC。
20、R 产物电 泳图 ； 第 4 泳道， 样品 2， 引物 T141G N F 和 T141G R 配对 ； 第 5 泳道， 样品 2， 引物 T141G M F 和 T141G R 配对的 PCR 产物电泳图 ； 第 6 泳道， 样品 3， 引物 T141G N F 和 T141G R 配对的 PCR 产物电泳图 ； 第 7 泳道， 样品 3 引物 T141G M F 和 T141G R 配对的 PCR 产物电泳图。 具体实施方式 0024 下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明， 但本发明不受实施例的限制。 0025 所有实施例中的分子生物学操作方法为该领域技术人员所熟悉， 可以参考 Sam。
21、brook 等 “分子克隆” （实验室手册， 冷泉港， 1989） 及 “精编分子生物学实验指南” （美 / 说 明 书 CN 105316394 A 5 4/4 页 6 F. 奥斯伯等著， 颜子颖等译， 北京， 科学出版社， 1998） 。 0026 实施例一 以人类男性不育症Fkbp6基因致病位点 T141G 所在的Fkbp6基因的第 2 外显子 DNA 序 列为模板， 利用软件 primer premier 5.0 设计引物。 0027 检测 T141G 突变位点的引物的碱基序列 ： 正常模板配对引物 T141G N F ： 5 -TCCGAGAAGGAGCTG-3 ； 突变模板配对引物。
22、 T141G M F ： 5 - TCCGAGAAGGAGCGG-3 ； 共同的下游引物 T141G R ： 5 -AGGCTGAGGCAGGAG-3 。其中， 所述正常模板配对引物 T141G N F 和突变模板配对引物 T141G M F 的 3 端的 -3 与 -2 位 碱基之间的磷酸二酯键采用磷硫酰修饰， 或将 -2 位碱基经锁核酸化 （LNA） 修饰。 0028 实施例二 取受检患者血液样品， 提取 DNA 后， 才用引物试剂盒使用流程操作。PCR 产物用凝胶电 泳系统进行鉴定， 根据电泳条带的有无来判断Fkbp6基因 T141G 突变位点的基因型。具体 判断方法如下 ： 1， 当突。
23、变模板配对引物与下游引物组成的一对引物对未知的 DNA 模板进行 PCR 扩增， 如果观察到目的电泳条带则表明该未知 DNA 模板在相应的检测位点含有突变型基因。 0029 2， 当正常模板配对引物与下游引物组成的一对引物对未知的DNA模板进行PCR扩 增， 如果观察到目的电泳条带则表明该未知 DNA 模板在相应的检测位点含有正常型基因。 0030 3， 当上述两对引物都对未知 DNA 模板进行扩增并通过电泳观察到目的条带， 则表 明该检测位点为杂合型。 0031 PCR 扩增结果如附图 1 所示。根据 PCR 产物电泳条带状况判断， 样品 1 的Fkbp6基 因中T141G位点为正常纯合 ；。
24、 样品2的基因型为突变纯合 ； 样品3的基因型为杂合。 将该片 段送测序， 测序结果印证了 PCR 检测结果正确。由此判断， 样品 1 的携带者患有遗传病男性 不育症的几率很低 ； 样品 2 的携带者患有遗传性男性不育症的几率极高。 说 明 书 CN 105316394 A 6 1/2 页 7 序 列 表 广州君赫生物科技有限公司 检测男性不育症 Galntl5 基因 1 个致病突变位点的试剂盒及其 PCR 扩增方法 2014 4 PatentIn version 3.5 1 15 DNA 人工序列 1 gtgattatca gtaga 15 2 15 DNA 人工序列 2 gtgattatc。
25、a gtaaa 15 3 15 DNA 人工序列 3 aacacatttt gtgcc 15 序 列 表 CN 105316394 A 7 2/2 页 8 4 290 DNA Homo sapiens 4 gtgattatca gtagaagctt gggcatcgaa agagaagtgc cagataccag gagtaaaatg 60 tatgttgtct ctctctttct ctcattctct agatagatag atagatagat agatagatag 120 atagatagat agaaagaaaa cagttactaa ccagatttta atttgatcat actagaaatg 180 ttatagattc ctatttttag gacttgaagt cagataatgt caagattcta tttcaagatt 240 ctaatgctta tagtgtagag aatgtcttct tcgtgggcac aaaatgtgtt 290 序 列 表 CN 105316394 A 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 105316394 A 9 。