技术领域
本发明涉及细胞分析技术，具体是一种用于细胞打印的微流控芯片。
背景技术
单细胞分析已经发展成为细胞生物学领域研究细胞功能的一个关键 问题，并且受限于工具和技术支持使得对单个细胞的分离，对后续的单细 胞研究等问题变得越来越突出。通过一段较长的时间，在固定的位置分选 单细胞有利于维持细胞的状态。分选细胞的技术中有接触式和非接触式两 种模式，分选细胞往往是结合微流控系统，它提供在很短的时间尺度上的 测量和营养物或试剂的连续供电，偶尔提供“分选释放”功能。微流控芯 片单细胞操纵是在微米级通道内驱动细胞并将其运送到预定位点或将其固 定在特定位置的方法。目前微流控芯片单细胞操纵手段主要是在力学、电 学等原理上建立起来的，具体可以分为机械捕捉，磁场捕捉，光学，介电 泳捕捉，超声捕捉，水动力捕捉等。
实际应用产品方面，对于非商用研究中的单细胞技术，一定数量的单 细胞应用已经被全世界的开发研究小组在非商业产品或原型系统中实现。 多数的这些技术是基于微流控芯片，并且发展了更加灵活的方法，研究者 们已经开发出了基于液滴的技术，比如激光引导打印，改进的喷墨打印， 在不同的基板上打印单细胞。从上世纪90年代到21世纪初，商用得喷墨 打印头，比如Wilson和Boland在他们的工作中展示的HP660C已经成功 吸引了大家的注意。这个设备能够实现产生仅比细胞稍微大的液滴，许多 研究者使用改进这种打印头来实现打印包含活细胞的生物悬浊液，能够完 成针对组织领域的多功能工程应用。通过精确调整细胞浓度，喷墨打印头 已被证明是适用于喷射包含单细胞的液滴。然而基于喷墨的细胞打印会使 许多细胞受损或死亡。而细胞打印主要用于药物开发和组织再生、细胞功 能和细胞间通讯的研究，这就要求细胞只有是活的才能发挥作用。当细胞 喷出喷射出口，就只50％到80％的成活率，因此提高细胞的成活率成为细 胞打印亟需解决的关键问题。
美国休斯顿卫理公会研究院的研究人员开发出一种可将活细胞打印 到任何表面和几乎任何形状上的技术，且整个过程中几乎所有的细胞仍能 存活。新技术犹如中国古代木刻版印刷术和现在儿童橡皮印章玩具，与喷 墨打印方法有所不同。这种方法在可产生2D细胞阵列，打印出的最小细胞 直径为5微米(大多数动物细胞在10到30微米)，并允许使用许多不同类 型的细胞，虽然接近100％的细胞成活率。但其捕捉成功率只在百分之九 十到九十四，而且其捕捉时间通常在半个小时左右，还不能像喷墨打印一 样可打印出多层结构。
发明内容
本发明的主要目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于细胞打印 的微流控芯片。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于细胞打印的微流控芯片，包括键合在一起的上盖板和下基 板，所述上盖板和所述下基板之间形成有微流道和压缩气体流道，所述微 流道具有用于输入细胞悬浮液的细胞悬浮液入口、用于输入不含细胞的培 养液的培养液入口、以及液体出口，所述压缩气体流道具有压缩气体入口， 所述微流道包括在细胞悬浮液入口、培养液入口与液体出口之间的圆弧形 的主流道，所述主流道在中间位置与所述压缩气体流道以及喷射出口连通， 形成细胞捕捉区，在所述细胞捕捉区设置有用于捕捉细胞的钩状微挡流结 构，所述钩状微挡流结构的凹陷侧迎向所述主流道的来流方向以及所述喷 射出口，所述钩状微挡流结构与所述主流道的近端壁面的最大距离大于目 标细胞直径且小于目标细胞直径的两倍，而最小距离小于目标细胞直径， 所述钩状微挡流结构与所述主流道的远端壁面的最小距离大于目标细胞直 径。
进一步地：
所述主流道为180度的半圆弧，所述细胞捕捉区位于半圆弧中间位置。
所述压缩气体流道和所述喷射出口进行了疏水处理，所述喷射出口为 疏水阀喷射出口。
所述微流道通过应用软光刻技术刻在下基板的内表面。
所述钩状微挡流结构的弯折部分的弯折角为90度。
所述钩状微挡流结构的一条边与所述主流道的近端壁面垂直，另一条 边与所述主流道的远端壁面平行。
所述钩状微挡流结构与所述主流道的底部的距离小于目标细胞直径， 钩状微挡流结构顶部与所述主流道的顶部的距离大于捕获细胞直径。
所述钩状微挡流结构与所述主流道的远端壁面的最小距离为目标细胞 平均直径的1.7倍。
所述钩状微挡流结构到所述主流道的远端壁面的最小距离与所述钩状 微挡流结构到所述主流道的近端壁面的最小距离的比值不小于6。
所述微流控芯片为可抛弃式微流控芯片。
本发明的有益效果：
本发明能够有效克服目前单细胞打印技术存在的成活率低、精度低、 难以实现单个细胞精确受控组装的不足，通过基于微流控芯片流体聚焦和 单细胞捕获以及微喷头的结构设计，本发明能实现具有单个细胞分辨率的 精确单细胞捕获和喷射，从而为单细胞细胞研究提供发展机理、诊断及治 疗等，探索出一条新的研究和实验手段。这对于生物医药学研究领域，特 别是生物细胞学的研究，具有不可替代的优势，并有可能开创肿瘤学研究 和药物研究的新模式。
尤其是，本发明的微流控芯片结构充分利用流体力学原理和微流控技 术，将流动聚焦理论与钩状微挡流结构相结合，实现对单细胞的长时间精 准捕获，并与疏水阀微喷头和压缩气体驱动相配合，实现单细胞液滴的精 准受控喷射。具体来说，本发明实施例具有以下优点：1、实现了单细胞自 动捕获和喷射；2、采取了可抛弃式微流控芯片制作简单，没有高深比结构， 免清洗和可扩展性强3、实现了接近百分之百的精确捕捉；4、通过钩状微 挡流结构优化和弯曲微通道显著提高了捕获效率；5、喷射后细胞存活率达 95％以上。
附图说明
图1是本发明实施例的一种用于单细胞打印的微流控芯片的结构示意 图；
图2是本发明微流控芯片中钩状微挡流结构捕获细胞和疏水阀微喷 的局部放大图；
图3是本发明微流控芯片俯视图的局部放大图；
图4是图3在A-A面的剖视图；
图5a至图5d是本发明微流控芯片捕获和喷射细胞的流程示意图，分 别代表准备、捕获、冲洗、喷射四个过程；
附图标记说明：1——下基板；2——上盖板；3——微流道；4—— 无细胞的培养液入口；5——细胞悬浮液入口；6——压缩气体入口；7—— 液体出口；8——钩状微挡流结构；9——喷射出口；10——压缩气体流道。
具体实施方式
以下对本发明的实施方式作详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅 是示例性的，而不是为了限制本发明的范围及其应用。
参阅图1至图5d，在一种实施例中，一种用于细胞打印的微流控芯片， 包括键合在一起的上盖板2和下基板1，所述上盖板2和所述下基板1之 间形成有微流道3和压缩气体流道10，所述微流道3具有用于输入细胞悬 浮液的细胞悬浮液入口5、用于输入不含细胞的培养液的培养液入口4、以 及液体出口7，所述压缩气体流道10具有压缩气体入口6(压缩气体可以 是压缩空气)，所述微流道3包括在细胞悬浮液入口5、培养液入口4与液 体出口7之间的圆弧形的主流道，所述主流道在中间位置与所述压缩气体 流道10以及喷射出口9连通，形成细胞捕捉区，在所述细胞捕捉区设置有 用于捕捉细胞的钩状微挡流结构8，所述钩状微挡流结构8的凹陷侧(即 钩形的正面一侧)迎向所述主流道的来流方向以及所述喷射出口9，所述 钩状微挡流结构8与所述主流道的近端壁面的最大距离大于目标细胞直径 且小于目标细胞直径的两倍，而最小距离小于目标细胞直径，所述钩状微 挡流结构8与所述主流道的远端壁面的最小距离大于目标细胞直径。
所述微流道3可以通过软光刻技术刻在下基板1的内表面。所述微流 控芯片优选采用可抛弃式微流控芯片，其可降低制造成本，同时避免清洗 步骤带来的效率降低和成本上升。
在优选的实施例中，所述主流道为180度的半圆弧，所述细胞捕捉区 位于半圆弧中间位置。
在优选的实施例中，所述压缩气体流道10和所述喷射出口9进行了疏 水处理，所述喷射出口9为疏水阀喷射出口9。
在优选的实施例中，所述钩状微挡流结构8的弯折部分的弯折角为90 度。
在优选的实施例中，所述钩状微挡流结构8的一条边与所述主流道的 近端壁面垂直，另一条边与所述主流道的远端壁面平行。
在优选的实施例中，所述钩状微挡流结构8与所述主流道的底部的距 离小于目标细胞直径，钩状微挡流结构8顶部与所述主流道的顶部的距离 大于捕获细胞直径。
在优选的实施例中，所述钩状微挡流结构8与所述主流道的远端壁面 的最小距离为目标细胞平均直径的1.7倍。
在优选的实施例中，所述钩状微挡流结构8到所述主流道的远端壁面 的最小距离与所述钩状微挡流结构8到所述主流道的近端壁面的最小距离 的比值不小于6。
根据一些实施例，微流控芯片由上盖板2键合下基板1组成。通过用 软光刻法结合聚二甲硅氧烷(PDMS)制作的成型技术制备在下基板1表面刻 有微流道3，其中流道包括弯曲流道，包括细胞悬浮液入口5、不含细胞的 培养液入口4、主流道、用于细胞捕捉的钩状微挡流结构8、液体出口7、 压缩气体入口6、压缩气体流道10和微喷头。其中压缩气体流道10和喷 射出口9的疏水处理可以有效的阻止细胞捕捉过程的泄露。
根据本发明的实施例，圆弧形的微流道3设计可以减小微流芯片尺寸， 而且细胞在剪切力、诱导升力和离心力的共同作用下产生惯性聚焦流动， 把细胞推向壁面有利于提高捕获效率。
根据一些实施例，细胞捕捉区的钩状微挡流结构8距离微通道底部的 高度小于目标细胞直径，二者均小于微通道的深度，而其钩状微挡流结构 8顶部与上盖板2的间距应该大于捕获细胞直径以免发生堵塞。细胞的固 有弹性使其直径具有0.7倍到1.1倍的变化范围。细胞捕捉区的钩状微挡 流结构8与近端壁面的最小距离d2小于目标细胞直径，与近端壁面的最大 距离d1大于目标细胞直径，为了避免捕捉到多个细胞，最大距离d1小于 目标细胞直径的两倍。
钩状微挡流结构8与流道远端壁面的距离d3远大于距离d2，液体流 过远端时的流量Q3也远大于流过近端的流量Q2，绝大部分细胞不经过微 挡流结构而从傍边路径流走。在大多数情况下，单细胞捕获发生只有当旁 路路径是暂时被其他细胞占据时。优选的，距离d3是1.7倍的平均细胞直 径，此时其捕捉效率最高。减小距离比d3/d2的比值可以提高目标细胞流 入钩状微挡流结构8的概率，提升捕捉效率，然而，由于捕获位置容易产 生涡旋，细胞容易变形和被挤出等不稳定因素的影响下。优选地，当d3/d2 的比例不小于6，更优选大于6时，特别是在小于1m/s的流速下，可以获 得稳定的捕获，而提高细胞流的流速和细胞悬浮液的浓度都可以显著提升 细胞捕捉效率。
根据本发明的实施例，当细胞被钩状微挡流结构8捕捉后，其通过的 流量会由于细胞的阻挡进一步缩小，加上微挡流结构在绝大多数情况下只 能容纳一个细胞。在非常罕见的情况下，当一个陷阱捕获多个细胞，不含 细胞的缓冲液的进一步冲洗也能够除去钩状微结构附近以及流道其他地方 额外的细胞。单细胞捕获精确度能够达到100％。
根据本发明的实施例，细胞释放和喷射，由位于钩状微挡流结构8上 放的压缩气体短时间的脉冲喷射完成，压缩气体流道10和微喷射出口9 均作了疏水处理，因此在细胞捕获冲洗时不会液体或者细胞残。当压缩气 体喷射时，流体出口和入口均为封闭状态，细胞只能从喷口喷出。
根据本发明的实施例，利用流体力学原理和微流控技术，将流动聚焦 理论与钩状微挡流结构8相结合，实现对单细胞的长时间精准捕获，并与 疏水阀微喷头和压缩气体驱动相配合，实现单细胞液滴的精准受控喷射。 为了降低制造成本，避免清洗步骤带来的效率降低和成本上升采用可抛弃 式微流控芯片。微流控芯片可由上盖板2键合下基板1组成。通过用软光 刻法结合聚二甲硅氧烷(PDMS)制作的成型技术在下基板1表面刻有微流道 3，其中流道包括弯曲流道，细胞悬浮液入口5、不含细胞的培养液入口4、 主流道、钩状微挡流结构8、液体出口7、压缩气体入口6、压缩气体流道 10和微喷头。其中压缩气体流道10和喷射出口9的疏水处理可以有效的 阻止细胞捕捉过程的泄露。本发明的微流控芯片提升了芯片的单细胞捕获 精度，操作简单，可扩展性强。
实例
采用本发明的微流控芯片对平均直径约为10微米的癌细胞进行打印： 通过用软光刻法结合聚二甲硅氧烷(PDMS)制作的成型技术制备如图2所示 的微流控芯片，微流道3刻在下基板1上，上盖板2和下基板1的材料均 为PDMS，上基板1和下基板2键合在一起，微流道3的深度为30微米宽 为35微米，钩状微挡流结构8距离微流道3底部的距离为8微米，钩状微 挡流结构8与上盖板2之间的间隙为22微米，钩状微挡流结构8中，弯折 角为直角。如图5a所示，钩状微挡流结构8中每个直边的宽度为5微米， 钩状微挡流结构距离壁面的距离d2为3微米，d1为12微米，d3为18微 米。疏水阀微喷9的宽度为20微米，深度为30微米，长度为2毫米。压 缩气体流道的宽度为100微米，深度为30微米。液体和气体入口直径均为 2毫米，出口直径也为2毫米。
其工作流程如图5a至5d所示，开始阶段用注射泵通过培养液入口4 注入培养液冲刷微通道，流速为0.1m/s，确保微流通道内没有残留细胞如 图5a所示；接着如图5b所示为正向压力驱动将含有密度较高(每毫升150 个细胞)的细胞悬浮液从流道入口5进入流道3，流速为0.05m/s,当液体流 至钩状微挡流结构8时，大部分细细胞悬液顺利通过坝状结构8与上盖板 2之间的间隙流向液体出口7，只到有细胞流向钩状微挡流结构和壁面的小 缝隙，因为直径大于8微米而被挡在了钩状微挡流结构8的内侧，从而成 功将细胞捕获。接着通过培养液入口4驱动无细胞的缓冲液流入微通道3， 流速为0.1m/s，这样可以把微通道中残留细胞冲出保证整个细胞捕捉区只 有一个单细胞。最后压缩气体通过入口6，经过气体通道10，流经钩状微 挡流结构8，在钩状微挡流结构内部捕捉的单细胞顺着气流进入喷射出口， 并被喷出，单细胞滴准确喷射到指定位置,如标准384孔板、培养皿或者实 现3d细胞打印。整个过程只有一个压力源应用于每一个步骤，可以在8 秒内完成。
本发明的微流控芯片还可以通过调整钩状微挡流结构8的尺寸大小、 微通道3之间间隙的大小，可以实现对不同直径目标细胞的捕获和喷射。 还可以在弯曲流道中设置多喷头，实现多个单细胞的一次捕捉喷射。其液 体出口也可以连接回收容器，回收没有被捕获的细胞悬浮液，在加入循环 泵实现细胞的循环打印。
主要技术指标
本发明克服现有单细胞捕获喷射体统存在的制造成本高、精度低、难 以单个细胞快速精确受控组装的，在重复性和可靠性上尚不能满足生化检 测关键难题作为切入点，开发基于微流控芯片的细胞精密微输运、微喷射 系统以实现单细胞的精确捕捉、控制和喷射，并达到以下技术指标：
1.应用微机电技术加工制成单细胞分选系统，实现单细胞捕捉、控制 与喷射。
2.捕获效率：液滴中单细胞的效率达到95％以上。
3.喷射精度：连续喷射的线单元尺寸小于400μm，离散的微滴单元体 积小于10nL；
4.细胞存活率：喷射后细胞存活率达95％以上，24小时后的细胞存活 率达到85％以上，72小时后的细胞存活率达到百分之80％以上，而且一直 维持多能性，即分化出多种细胞的潜能。
以上内容是结合具体/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说 明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这 些已描述的实施方式做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当 视为属于本发明的保护范围。