技术领域
本发明涉及分子病毒学和免疫学领域。具体地，本发明涉及由不 同型别HPVL1蛋白杂合组装形成的人乳头瘤病毒型别杂合病毒样颗粒 及其制备方法，所述型别杂合病毒样颗粒可用于预防两种或两种以上 HPV感染及由HPV感染所导致的疾病。本发明还涉及上述型别杂合病 毒样颗粒用于制备药物组合物或疫苗的用途，所述药物组合物或疫苗 用于预防HPV感染及由HPV感染所导致的疾病如宫颈癌、尖锐湿疣 等。
背景技术
人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)主要引起皮肤，粘 膜的疣状病变。根据其与肿瘤发生的关系，HPV可分为高危型与低危 型，其中高危型的HPV感染被证实是诱发包括女性宫颈癌在内的肛生 殖器癌症主要原因；低危型则主要引起尖锐湿疣。预防与控制HPV感 染的最有效方式是HPV疫苗，特别是能引起宫颈癌的高危型HPV疫 苗。
HPV的主要衣壳蛋白L1具有自组装为空心病毒样颗粒(Virus- LikeParticle，VLP)的特性。HPVVLP是由72个主要衣壳蛋白L1 的五聚体以二硫键连接而构成20面体立体对称结构(Doorbar，J. andP.H.Gallimore.1987.JVirol，61(9)：2793-9)。HPVVLP 结构与天然HPV高度相似，保留了天然病毒的绝大多数中和表位，可 诱导高滴度的中和抗体(Kirnbauer，R.，F.Booy，etal.1992 ProcNatlAcadSciUSA89(24)：12180-4)。结构研究和突变分 析表明，HPV16L1蛋白Cys175、Cys185和Cys428对VLP的基本结构 单位五聚体之间的相互作用起关键的作用，Cys161、Cys229、Cys379对 于单体分子间的相互作用是必需的，提示发生在L1蛋白分子内和/或 分子间的二硫键对于HPV病毒样颗粒的组装有重要的作用(IshiiY.， TanakaK.，KandaT.2003Virology.308：128-136)。本研究即对 这些二硫键进行改造，发明新的人工HPV型别杂合病毒样颗粒。
现有的研究发现，HPVVLP主要诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，仅在一些同源性高的型别之间存在交叉保护。因此，现有的HPV疫苗的保护范围有限。如果要扩大HPV疫苗的保护范围只能通过增加疫苗中所含有的HPVVLP型别来实现。这将大大提高HPV疫苗的生产成本，并可能因为免疫剂量增加而带来潜在的安全性问题。而目前已上市的HPV疫苗(包括：Merck公司的HPV16，18，6，11四价疫苗和GSK公司的HPV16，18二价疫苗)均采用单独型别VLP混合制备而成的。因此，本领域仍然需要能够诱导针对多型别HPV保护性抗体的HPVL1病毒样颗粒，从而使制备预防更多型别HPV的宫颈癌疫苗成为可能。
发明内容
本发明至少部分基于发明人的以下的出人意料的发现：利用大肠 杆菌表达系统表达两个或两个以上不同型别的175位与428位半胱氨 酸突变或缺失的HPVL1蛋白，所述突变或缺失的HPVL1蛋白单独不 能形成病毒样颗粒，然而，按照一定的混合方式及一定的浓度比例混 合后去除还原剂，可得到一种新的杂合VLP。该杂合VLP含有两种或 两种以上的HPVL1蛋白，可诱导针对两种或两种以上HPV的高滴度中 和抗体。
因此，在一方面，本发明涉及组装成杂合病毒样颗粒的突变或缺 失的HPVL1蛋白，所述蛋白包括但不限于：HPVL1-C175A、HPVL1- ΔC428、HPVL1-ΔC175、HPVL1-C175S、HPVL1-C428A、HPVL1- C428S等。
在一个优选的实施方案中，HPVL1-C175A与HPVL1-ΔC428按照 1∶1的摩尔比混合。在其它实施方式中，二者的比例包括2∶1、1∶2等 等。
在另一个方面，本发明涉及一种制备本发明的杂合病毒样颗粒的 方法。在一个优选实施方案中，制备本发明的杂合病毒样颗粒的方法 包括：
a)在大肠杆菌中表达所述突变或缺失HPVL1蛋白，
b)将表达所述突变或缺失HPVL1蛋白纯化，得到纯度95％以上的 突变或缺失HPVL1蛋白，
c)将b)纯化的突变或缺失L1蛋白：HPVL1-C175A与HPVL1-Δ C428按照1∶1的摩尔比混合，透析去除还原剂，即得到杂合VLP。
d)将c)得到的杂合VLP进一步纯化，收集颗粒组分。
本发明还涉及一种制备疫苗的方法，其包括将本发明的HPV杂合 VLP与药学可接受的载体和/或赋形剂混合，任选地还混合一种或多种 选自HPV6、11、16、18、31、33、45、52、58和59的HPV型别的病 毒样颗粒或其他型别的杂合VLP。如上所论述的，所获得的疫苗可以 用于预防HPV感染或由HPV感染所导致的疾病如宫颈癌等。
在另一个方面，还涉及根据本发明的杂合病毒样颗粒在制备药物 组合物或疫苗中的用途，所述药物组合物或疫苗用于预防HPV感染或 由HPV感染所导致的疾病。
本发明中相关术语的说明及解释
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词 具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培 养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内 广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关 术语的定义和解释。
根据本发明，术语“HPVL1”是指人乳头瘤病毒(HPV)的L1蛋 白，其序列是本领域公知的(参见，例如NCBI数据库序列号： DQ469930.1)。在本发明中，当涉及HPVL1的序列时，参考Ishii Y，TanakaK，KandaT.Virology.(2003)，308(1)，128-36。 其使用NCBI数据库序列号：DQ469930.1进行描述。
根据本发明，术语“HPVL1突变体蛋白”是指，在L1蛋白中的 某一位或某几位半胱氨酸(C)残基进行缺失或用其它氨基酸残基置换 所获得的蛋白质，非必需地包括对L1蛋白进行N端或C端的缺失。
根据本发明，术语“HPVX-CYZ”是指，用Z氨基酸残基置换 HPVX型L1蛋白质第Y位的半胱氨酸(C)残基所获得的蛋白质，其 中X是指HPV的型别，Y是指GenBankABF06542.1(其核苷酸序列为 DQ469930.1)氨基酸序列的从N端甲硫氨酸(M)开始计数的氨基酸所 处的位置，如X＝16，Y＝175是指ABF06542.1氨基酸序列的第175位 氨基酸半胱氨酸C，非HPV16型别的Y值则指将目标蛋白序列与 ABF06542.1氨基酸序列进行序列比对(可使用Blast、Fasta、 Cluster等程序)后，相应于ABF06542.1氨基酸序列的位置。如 “HPV16-C175A”指用丙氨酸(A)残基置换HPV16型L1蛋白质 ABF06542.1的第175位的半胱氨酸(C)残基所获得的蛋白质； “HPV52-C175A”指用丙氨酸(A)残基置换HPV52型L1蛋白质中对 应于ABF06542.1氨基酸序列的第175位残基的半胱氨酸残基(C)后 所获得的蛋白质。
根据本发明，术语“HPVX-ΔCY”是指，将HPVX型L1蛋白质 的第Y位的半胱氨酸(C)残基缺失所获得的蛋白质，其中氨基酸位置 编号适用以上定义。如“HPV16-ΔC428”指将HPV16型L1蛋白质 ABF06542.1的第428位半胱氨酸残基缺失后所获得的蛋白质； “HPV52-ΔC428”指将HPV52型L1蛋白质中对应于ABF06542.1氨 基酸序列的第428位残基的半胱氨酸残基(C)缺失后所获得的蛋白 质。
根据本发明，术语“杂合颗粒”是指，将2种或2种以上型别经 突变后不能单独组装形成VLP的L1蛋白混合组装，所形成的VLP。
根据本发明，术语“X与Y杂合VLP”是指，将X与Y蛋白混合组 装，所形成的杂合VLP。如“HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂 合VLP”是指将HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428蛋白混合组装， 所形成的杂合VLP。
根据本发明，术语“变体”是指这样的蛋白，其氨基酸序列与本 发明的突变的HPVL1蛋白的氨基酸序列具有一个或多个(例如1-10 个或1-5个或1-3个)氨基酸不同(例如保守氨基酸置换)或者具有 至少60％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，或99％的同一性， 并且其保留了所述截短蛋白的必要特性。此处术语“必要特性”可以 是如下特性中的一个或者多个：能够诱导针对该型HPV的中和抗体； 能够在大肠杆菌中可溶性地表达；利用本发明所涉及的表达纯化方法 能够获得高产率的纯化蛋白。
根据本发明，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之 间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的 碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的 某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖 氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百 分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位 置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹 配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和 CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常， 在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过 使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar，Inc.) 方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453 的方法来实现。还可使用已整合ALIGN程序(版本2.0)的E. Meyers和W.Miller(Comput.ApplBiosci.，4：11-17(1988))的 算法，使用PAM120权重残基表(weightresiduetable)、12的缺 口长度罚分和4的缺口罚分来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一 性。此外，可使用已整合入GCG软件包(可在www.gcg.com上获得)的 GAP程序中的Needleman和Wunsch(JMoIBiol.48：444-453 (1970))算法，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、 12、10、8、6或4的缺口权重(gapweight)和1、2、3、4、5或6 的长度权重来测定两个氨基酸序列之间的百分数同一性。
如本文中使用的，术语“保守置换”意指不会不利地影响或改变 包含氨基酸序列的蛋白/多肽的生物学活性的氨基酸置换。例如，可通 过本领域内已知的标准技术例如定点诱变和PCR介导的诱变引入保守 置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸 残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似 (例如具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢 键的能力等)的残基进行的置换。已在本领域内定义了具有相似侧链 的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、 精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷 的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、 酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、 亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链 (例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨 酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，优选用来自相同 侧链家族的另一个氨基酸残基替代相应的氨基酸残基。鉴定氨基酸保 守置换的方法在本领域内是熟知的(参见，例如，Brummell等人， Biochem.32：1180-1187(1993)；Kobayashi等人ProteinEng. 12(10)：879-884(1999)；和Burks等人Proc.NatlAcad.SetUSA 94：412-417(1997)，其通过引用并入本文)。
根据本发明，术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株) 与载体组成的表达系统，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到 的菌株，例如但不限于：GI698、ER2566、BL21(DE3)、B834(DE3)、 BLR(DE3)等等。
根据本发明，术语“载体(vector)”是指，可将多核苷酸插入 其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸所编码的蛋白 获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染 导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载 体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌体；柯斯质 粒等等。
可用于本发明的方法中的缓冲液是本领域公知的，包括但不限 于，Tris缓冲液，磷酸盐缓冲液，HEPES缓冲液，MOPS缓冲液等等。
根据本发明的HPV杂合病毒样颗粒可通过如下步骤获得：将上述 纯度至少95％的突变或缺失的HPVL1蛋白按1∶1的摩尔比混合组 装；去除该溶液中的还原剂，得到所述HPV杂合病毒样颗粒。去除还 原剂的方式是本领域已知的，包括但不限于，透析，超滤或者层析 等。
根据本发明，术语“药学可接受的载体和/或赋形剂”是指在药理 学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是 本领域公知的(参见例如Remington′sPharmaceuticalSciences. EditedbyGennaroAR，19thed.Pennsylvania：Mack PublishingCompany，1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面 活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸 盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表 面活性剂，例如Tween-80；佐剂包括但不限于铝佐剂(例如氢氧化 铝)，弗氏佐剂(例如完全弗氏佐剂)；离子强度增强剂包括但不限 于氯化钠。
发明的有益效果
目前制备HPV病毒样颗粒均为单一型别L1组装形成的VLP，主要 诱导针对同型HPV的中和抗体，产生针对同型HPV的保护性免疫，仅 在一些同源性高的型别之间存在交叉保护。因此，现有的HPV疫苗的 保护范围有限。如果要扩大HPV疫苗的保护范围只能通过增加疫苗中 所含有的HPVVLP型别来实现。这将大大提高HPV疫苗的生产成本， 并可能因为免疫剂量增加而带来潜在的安全性问题。
虽然有研究表明，HPVL1蛋白的175位和428位半胱氨酸对于病 毒样颗粒组装可能其重要作用，突变或删除这些氨基酸可能影响HPV VLP的形成，但是本发明经过突变分析和组装条件摸索，却出乎意料 地发现，这些半胱氨酸只影响同种型别HPVL1蛋白组装成VLP，但是 这种影响却可以通过不同型别HPVL1来消除，从而发明制备不同型别 HPVL1组装杂合VLP的方法，这种方法完全排除了同种型别HPVL1 蛋白组装成为VLP的可能性，因为单独型别的HPVL1蛋白的175位 或428位突变体自身无法形成VLP，只有与其他型别的HPVL1蛋白突 变体相互补才能形成杂合型的VLP，这样的方法不仅可以应用于HPV VLP的结构和组装机理研究，以及疫苗制备的用途，也可应用于基于 HPVVLP结构和组装的纳米材料及相关的研究。
将不同型别L1蛋白杂合组装形成杂合具有免疫原性好，易产生非 疫苗型别的交叉保护等优点，但如采用不同型别L1蛋白直接混合组装 成VLP，不仅组装效率低，组装成的VLP形态也较差，同时还存在可 能存在各种配比而VLP不均一的问题，限制了杂合VLP的工业化的制 备，严重影响了获得的杂合VLP的免疫原性。
本发明提供的杂合VLP和其制备方法有效的解决了上述问题。首 先，本发明采用突变后单独无法组装成VLP的L1蛋白为原料，确保了 其易于制备。其次，用该突变蛋白以一定的条件和比例组装制备杂合 VLP，能够获得高组装效率的杂合VLP，且组装比例一致，组装得到的 杂合VLP状态均一。进一步，该杂合VLP在同等剂量下能比同种VLP 混合免疫在体内获得更高滴度的中和抗体，具有更好的免疫原性，此 外，还能获得更高滴度的非疫苗型别的中和抗体，与混合的多价VLP 相比，更适合作为疫苗使用。
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但 是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而 不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描 述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显 然。
附图说明
图1显示了实施例1中经HIC(疏水相互作用色谱)纯化获得的 HPV-L1突变体的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M：蛋白分子 量标记；泳道1：HPV16L1-C175A经HIC(疏水相互作用色谱)纯化洗 脱级分；泳道2：HPV16L1-ΔC428经HIC(疏水相互作用色谱)纯化 洗脱级分；泳道3：HPV52L1-C175A经HIC(疏水相互作用色谱)纯化 洗脱级分；泳道4：HPV52L1-ΔC428经HIC(疏水相互作用色谱)纯 化洗脱级分；结果显示，经过ButylSepharose4FastFlow柱纯化 后，HPV16L1-C175A、HPV16L1-ΔC428、HPV52L1-C175A、HPV52L1-Δ C428蛋白纯度达到95％以上。
图2显示了实施例2中所得的HPV-L1突变体蛋白复性后透射电镜 观察(放大100,000倍，Bar＝0.1μm)结果。图2A，复性后的 HPV16L1-C175A蛋白；图2B，复性后的HPV16L1-ΔC428蛋白；图 2C，复性后的HPV52L1-C175A蛋白；图2D，复性后的HPV52L1-Δ C428蛋白。结果显示，在这4个图的视野中可见大量半径在5nm左右 的五聚体，没有病毒样颗粒存在。
图3显示了实施例3中所述方法制备的HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428在不同的缓冲液条件下，按摩尔比1∶1组装的杂合 VLP的透射电镜观察结果(100,000倍，Bar＝0.1μm)。图3A，HPV16 L1-C175A与HPV52L1-ΔC428在50mMPB(磷酸钠缓冲液)，pH 6.0，0.5MNaCl组装成的杂合VLP；图3B，HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428在20mMPB，pH6.5，0.5MNaCl组装成的杂合VLP； 图3C，HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428在20mMPB，pH7.0， 0.5MNaCl组装成的杂合VLP。结果显示，图3A视野中可见大小不均 一半径为20nm左右的病毒样颗粒，图3B视野中可见大小均一，半径 30nm左右的病毒样颗粒，图3C视野中可见大量半径在5nm左右的五 聚体，没有病毒样颗粒存在。
图4显示了实施例4中所述方法制备的HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428按不同的摩尔比例组装的杂合VLP的凝胶过滤层析 的结果。结果显示，HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428按摩尔比 1∶1组装的杂合VLP颗粒组装比例比较合适，五聚体剩余最少。
图5显示了实施例4中所述的方法制备的HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428按不同的摩尔比例组装的杂合VLP的透射电镜观察 结果(100,000倍，Bar＝0.1μm)。图5A，HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428按摩尔比2.5∶1组装的杂合VLP；图5B，HPV16L1- C175A与HPV52L1-ΔC428按摩尔比2∶1组装的杂合VLP；图5C， HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428按摩尔比1∶1组装的杂合VLP； 图5D，HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428按摩尔比1∶2组装的杂合 VLP。结果显示，图5A视野中可见大量半径在5nm左右的五聚体，没 有病毒样颗粒存在。图5B视野中可见大小不均一，半径20-30nm左右 的病毒样颗粒；图5C视野中可见大小均一，半径30nm左右的病毒样 颗粒；图5D视野中视野中可大小不均一的，半径20nm左右的病毒样 颗粒，并有大量半径在5nm左右的五聚体。
图6显示了实施例4所述方法得到的HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428杂合VLP的冷冻电镜观察的结果及其重建的三维结 构。图6A，HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP；图6B，H HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP的重建的三维结构。重 建的三维结构显示，HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP是 由72个壳粒(形态亚单位，五聚体)形成的T＝7的二十面体结构 (h＝1，k＝2)。与一般的符合准等价原理的二十面体病毒衣壳不同， HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLPVLP结构中所有的组成 亚单位均为五聚体，而未见六聚体，且VLP的最外围直径为约60nm。 这与之前报道的天然HPV病毒颗粒及真核表达系统(例如，痘病毒表 达系统)来源的HPVVLP的三维结构(BakerTS，NewcombWW， OlsonNH.etal.BiophysJ.(1991)，60(6)：1445-1456. HagenseeME，OlsonNH，BakerTS，etal.JVirol. (1994)，68(7)：4503-4505.BuckCB，ChengN，ThompsonCD.et al.JVirol.(2008)，82(11)：5190-7.)类似。
图7显示了实施例4中制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-Δ C428杂合VLPSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果。泳道M：蛋白分子量 标记；泳道1：HPV16L1蛋白；泳道2：HPV16L1-C175A与HPV52L1- ΔC428杂合VLP；泳道3：HPV52L1蛋白。结果显示：电泳结果表明 HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP有两条特异条带，分别 与HPV16L1、HPV52L1的条带相一致。
图8显示了实施例4中制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-Δ C428杂合VLP与HPV16特异线性抗体21A5进行蛋白质免疫印迹检测 结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1：HPV52L1蛋白；泳道2： HPV16L1蛋白；泳道3：HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合 VLP。结果显示HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP与 HPV52特异线性抗体21A5Western反应有特异性的条带。
图9显示了实施例4中制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-Δ C428杂合VLP与HPV52特异线性抗体12D10进行蛋白质免疫印迹检测 结果。泳道M：蛋白分子量标记；泳道1：HPV52L1蛋白；泳道2： HPV16L1蛋白；泳道3：HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合 VLP。结果显示HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP与 HPV52特异线性抗体Western反应有特异性的条带。
图10显示了实施例4中制备的HPV16L1-C175A与HPV52L1-Δ C428杂合VLP，突变体蛋白和HPVVLP热稳定性检测的结果。
图11显示了实施例7中免疫不同阶段血清中和抗体滴度检测结 果。结果表明根据实施例1-4所述方法获得的HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428、HPV52L1-C175A与HPV16L1-ΔC428杂合VLP具有 良好的免疫原性，可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV16、HPV52的中 和抗体。同时还产生针对HPV58、33、35的中和抗体。
图12显示了实施例5中所述的HPV52L1-C175A与HPV16L1-Δ C428杂合VLP，HPV16L1-C175A与HPV6L1-ΔC428杂合VLP， HPV6L1-C175S与HPV16L1-ΔC428HPV6杂合VLP，HPV6L1-C175S与 HPV52L1-ΔC428HPV52L1-C175S，HPV52L1-C175A与HPV6L1-ΔC428 杂合VLP在储存缓冲液中的透射电镜观察结果(100,000倍， Bar＝0.1μm)。图12A，HPV52L1-C175A与HPV16L1-ΔC428杂合 VLP；图12B，HPV16L1-C175A与HPV6L1-ΔC428杂合VLP；图 12C，HPV6L1-C175S与HPV16L1-ΔC428HPV6杂合VLP；图12D， HPV6L1-C175S与HPV52L1-ΔC428杂合VLP；图12E，HPV52L1-C175A 与HPV6L1-ΔC428杂合VLP。结果显示，视野中均可见大小较均一半 径为25nm左右的病毒样颗粒。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来 描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检 测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2 版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分 子生物学实验指南，第3版，JohnWiley&Sons，Inc.，1995中所 述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本 领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本 发明所要求保护的范围。
实施例1.用于构建杂合病毒样颗粒的HPVL1突变蛋白的表达与 纯化
构建HPVL1突变蛋白表达载体
基因克隆采用定点突变PCR反应来进行，使用的初始模板包括 pT0-T7-HPV16L1N30C质粒(在表1中简写为16L1)，pT0-T7- HPV52L1N40C质粒(在表1中简写为52L1)，pT0-T7-HPV6L1N5C质粒 (在表1中简写为6L1)。各个PCR反应的模板、引物见表1，PCR反 应扩增条件设为：94℃变性10分钟，25个循环的“94℃变性50秒， 指定温度退火一定时间，72℃延伸50秒”，最后72℃延伸10分钟。 所使用的PCR引物的序列列于表2。
表1.构建突变HPVL1蛋白的各PCR反应条件
表2：用于构建突变HPVL1蛋白的引物序列(SEQIDNO：19-30)
PCR扩增得到产物(50μL)加入2μLDpnI限制性内切酶，在 37℃处理60min。取10μL转化40μL以氯化钙法制备的感受态大肠 杆菌ER2566(购自新英格兰生物实验室公司)细菌，将其涂布于含卡 那霉素(终浓度25mg/mL，下同)的固体LB培养基(LB培养基成分： 10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，下同)，并37℃静置培 养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至含4mL液体LB培养基 (含卡那霉素)的试管，在37℃220转/分钟下振荡培养10小时，从 中取1mL菌液于-70℃保存。利用T7引物，测得pT0-T7质粒中插入 的目的片段的核苷酸序列分别为SEQIDNO：13、14、15、16、17、 18，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO：4、5、6、7、8、9。
HPVL1突变蛋白的大量表达
从-70℃中取出携带重组质粒pT0-T7-HPV16L1-C175A、pT0-T7- HPV16L1-ΔC428、pT0-T7-HPV52L1-C175A、pT0-T7-HPV52L1-Δ C428、pT0-T7-HPV6L1-C175S、pT0-T7-HPV6L1-ΔC428的大肠杆菌菌 液，分别接种100ml含卡那霉素的LB液体培养基中，在200rpm， 37℃下培养大约8小时；然后分别转接入15瓶500ml含卡那霉素的 LB培养基中(接1ml菌液)。当细菌浓度达到OD600为0.6左右 时，将培养温度降至25℃，每瓶加入500μLIPTG诱导培养8小时， 离心收集菌体。获得表达了HPV16L1-C175A、HPV16L1-ΔC428、 HPV52L1-C175A、HPV52L1-ΔC428、HPV6L1-C175S、HPV6L1-ΔC428 蛋白的菌体。
表达HPVL1突变蛋白的菌体破碎
按1g菌体对应10mL裂解液(20mMTris缓冲液，pH7.2，300mM NaCl)的比例重悬上述得到的菌体。采用超声波仪破碎菌体30min。以 13500rpm(30000g)离心菌体破碎液15min，留取上清(即，破菌上 清)。
HPVL1突变蛋白的色谱纯化
仪器系统：GEHealthcare公司(原AmershanPharmacia公司) 生产的AKTAexplorer100型制备型液相色谱系统。
层析介质：SPSepharose4FastFlow(GEHealthcare公 司)、CHT-II(购自Bio-RAD)、ButylSepharose4FastFlow(GE Healthcare公司)。
缓冲液：20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mMDTT
20mM磷酸盐缓冲液pH8.0，20mMDTT，2MNaCl
样品为上述方法获得的HPV16L1-C175A、HPV16L1-ΔC428、 HPV52L1-C175A、HPV52L1-ΔC428、HPV6L1-C175S、HPV6L1-ΔC428 的菌体破碎上清
洗脱程序为：先用SPSepharose4FastFlow进行阳离子交换 纯化：400mMNaCl洗脱杂蛋白，800mMNaCl洗脱目的蛋白，收集 800mMNaCl洗脱级分；然后将前一步800mMNaCl洗脱级分进行CHT II(羟基磷灰石色谱)纯化：将前一步骤获得的800mMNaCl洗脱级 分，将NaCl浓度稀释至0.5M，500mMNaCl洗脱杂蛋白，1000mM NaCl洗脱目的蛋白，收集1000mMNaCl浓度时的洗脱级分。最后将前 一步骤获得的1000mMNaCl洗脱级分进行HIC(疏水相互作用色谱) 纯化：1000mMNaCl洗脱杂蛋白，200mMNaCl洗脱目的蛋白，收集 200mMNaCl浓度时的洗脱级分。
取200mMNaCl浓度时的洗脱级分150μL，加入30μL6X LoadingBuffer，混匀并于80℃水浴10min；然后取10μl于10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳120min；然后以考马斯亮兰 染色显示电泳条带。电泳结果见图1。结果显示，经过上述纯化步骤 后，HPV16L1-C175A、HPV16L1-ΔC428、HPV52L1-C175A、HPV52L1-Δ C428蛋白的纯度大于95％。
实施例2：HPVL1突变蛋白的复性与形态学检测
突变蛋白的复性
取2ml实施例1所得的纯度大于98％的HPV16L1-C175A、 HPV16L1-ΔC428、HPV52L1-C175A、HPV52L1-ΔC428、HPV6L1- C175S、HPV6L1-ΔC428突变蛋白或单独或于2L复性缓冲液(50mMPB (磷酸钠缓冲液)pH6.0，2mMCaCl2，2mMMgCl2，0.5MNaCl)透 析充分交换。在交换完后，用2L储存缓冲液(20mMPB(磷酸钠缓冲 液)pH6.5，0.5MNaCl)进行交换。
HPVL1突变蛋白的形态学检测
将按上述方法复性组装后的HPV16L1-C175A、HPV16L1-ΔC428、 HPV52L1-C175A、HPV52L1-ΔC428蛋白进行透射电镜观察。使用的仪 器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000倍。 将复性后的HPV16L1-C175A、HPV16L1-ΔC428、HPV52L1-C175A、 HPV52L1-ΔC428蛋白用2％磷钨酸pH7.0负染，固定于喷炭的铜网 上，进行观察。电镜结果见图2-5，其中均可见大量均一的直径为8nm 左右的壳粒。
实施例3：HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428以不同组装缓冲 液组装杂合VLP与颗粒形态学检测
HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428以不同组装缓冲液组装杂合 VLP
测定HPV16L1-C175A、HPV52L1-ΔC428的蛋白浓度，取一定体积 的(约2ml)HPV16L1-C175A和HPV52L1-ΔC428按照质量比1∶1的 比例混合后透析于2L储存缓冲液(20mMPB(磷酸钠缓冲液)pH 6.5，0.5MNaCl)；2L复性缓冲液(50mMPB(磷酸钠缓冲液)pH 6.0，2mMCaCl2，2mMMgCl2，0.5MNaCl)；20mMPB(磷酸钠缓冲 液)pH7.0与0.5MNaCl；三种缓冲液中进行交换12h。
杂合病毒样颗粒形态学检测
将上述三种组装条件下的样品取100μL进行透射电镜观察。使用 的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000 倍。将四种组装条件下的样品取13.5μL用2％磷钨酸pH7.0负染，固 定于喷炭的铜网上，进行观察。电镜结果见图3，其中图3A与3B可 见大量半径为25nm左右的病毒样颗粒，进一步比较可以发现图3B中 的颗粒大小较为均一，而图3C可见大量半径在5nm左右的五聚体，没 有病毒样颗粒存在。这表明HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428能在 储存缓冲液(20mMPB(磷酸钠缓冲液)pH6.5，0.5MNaCl)、复性 缓冲液(50mMPB(磷酸钠缓冲液)pH6.0，2mMCaCl2，2mMMgCl2， 0.5MNaCl)条件下组装，不能在20mMPB(磷酸钠缓冲液)pH7.0 与0.5MNaCl条件下组装，在复性缓冲液(50mMPB(磷酸钠缓冲液) pH6.0，2mMCaCl2，2mMMgCl2，0.5MNaCl)0.5MNaCl条件下组装 的颗粒大小较为均一。
实施例4：HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428以不同组装比例 组装杂合VLP与颗粒性分析
HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428不同组装比例组装杂合 VLP
测定HPV16L1-C175A、HPV52L1-ΔC428的蛋白浓度，取一定体积 的(约2ml)HPV16L1-C175A和HPV52L1-ΔC428按照质量比 2.5∶1、2∶1、1∶1、1∶2的比例混合后透析于2L复性缓冲液中进行交 换12h。
分子筛层析分析杂合病毒样颗粒性
采用美国安捷伦公司的1120CompactLC高效液相色谱系统进行 层析，使用的分析柱为TSKGelPW5000xl7.8x300mm。以2倍柱体 积的PBS预先平衡层析柱至280nm处的吸收值无明显的变化，将检测 器的吸收值归零。由自动进样器进样并分析结果。结果如图4所示， HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428以不同比例组装的蛋白最先出现的 蛋白峰均在12min左右，与HPV16VLP相当，比HPV52L1-ΔC428保留 时间提前，这表明以上述比例杂合组装均可形成颗粒形式；上述蛋白 第二个蛋白峰在16min左右，与HPV52L1-ΔC428保留时间相当，说 明是剩余的为组装的五聚体，进一步比较可以发现，按质量比1∶1比 例组装的杂合VLP剩余第二个蛋白峰峰高最低，表明其组装时剩余的 五聚体最少，组装比例最为合适。
杂合病毒样颗粒形态学检测
将上述三种组装条件下的样品取100μL进行透射电镜观察。使用 的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为100,000 倍。将四种组装条件下的样品取13.5μL用2％磷钨酸pH7.0负染，固 定于喷炭的铜网上，进行观察。电镜结果见图6-8。观察结果见图 5，其中均可见大量病毒样颗粒；进一步比较可以发现，图5C视野中 均为大小均一，半径30nm左右的病毒样颗粒，表明HPV16L1-C175A 与HPV52L1-ΔC428按照质量比1∶1组装形成的颗粒大小均一。
实施例5：HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428病毒样颗粒的三 维结构重建
使用冷冻电镜三维结构重建实验(WolfM，GarceaRL，GrigorieffN.etal.ProcNatlAcadSciUSA.(2010)，107(14)：6298-303.)来重建HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合病毒样颗粒的三维结构。简而言之，在HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP的冷冻电镜图像中(图6A)分别选取372个大小均一、直径超过50nm的颗粒进行计算机重叠和结构重建，从而获取HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合的三维结构。所获得的三维结构如图6B所示，其中HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP的分辨率为。结果显示，HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP是由72个壳粒(形态亚单位，五聚体)形成的T＝7的二十面体结构(h＝1，k＝2)。与一般的符合准等价原理的二十面体病毒衣壳不同，HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP结构中所有的组成亚单位均为五聚体，而未见六聚体，且VLP的最外围直径为约60nm。这与之前报道的天然HPV病毒颗粒及真核表达系统(例如，痘病毒表达系统)来源的HPVVLP的三维结构类似。
实施例6：HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428、HPV52L1-C175A 与HPV16L1-ΔC428杂合VLP验证
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测
取实施例5纯化的HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP 样品100μL，加入20μL6XLoadingBuffer，混匀并于80℃水浴 10min；然后取10μl于10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中以120V电压电泳 120min；然后以考马斯亮兰染色显示电泳条带。电泳结果见图7。电 泳结果表明HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428杂合VLP有两条特异 条带，分别与HPV16L1、HPV52L1的条带相一致，二者质量比例约为 1∶1。
蛋白质免疫印迹检测(western-blot)
按上述方法对实施例5纯化的HPV16L1-C175A与HPV52L1-Δ C428、HPV52L1-C175A与HPV16L1-ΔC428杂合VLP进行电泳，电泳 结束后，使用HPV16特异抗体21A5以及HPV52特异抗体12D10分 别进行Western检测，结果见图8-9。结果显示HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428杂合VLP与HPV52特异线性抗体12D10Western反应 有特异性的条带，二者质量比例约为1∶1。
实施例7：HPVL1突变蛋白，HPVVLP，HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428杂合VLP热稳定性评价
使用购自美国GE公司(原MicroCal公司)差温量热仪VP CapillaryDSC评价HPVL1突变蛋白，HPVVLP，HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428杂合VLP热稳定性。使用蛋白的储存缓冲液作为对 照，以90℃/min的升温速率，对各蛋白在10℃-90℃区间进行扫描， 检测结果见图10。结果显示HPV16L1-C175S与HPV52L1-ΔC428杂 合VLP的熔解温度为67.63℃，高于突变蛋白HPV16L1-C175S和 HPV52L1-ΔC428的熔解温度66.98℃与56.86℃，介于HPV16VLP和 HPV52VLP的熔解温度69.15℃与64.41℃之间，说明HPV16L1- C175S与HPV52L1-ΔC428、HPV52L1-C175S与HPV16L1-ΔC428杂合 VLP热稳定性要优于五聚体，与VLP的稳定性相当。
实施例8：HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428、HPV52L1-C175A 与HPV16L1-ΔC428杂合VLP免疫保护性评价
使用小鼠评价本发明的HPV16L1-C175A与HPV52L1-ΔC428、 HPV52L1-C175A与HPV16L1-ΔC428杂合VLP的免疫保护性。免疫用 动物为4周龄普通级小鼠(购自上海斯莱康实验动物有限公司)。将 实施例2所制备的杂合颗粒以及HPV16VLP与HPV52VLP吸附于氢氧化 铝佐剂上。按不同的免疫抗原分为5组，每组免疫3只小鼠。免疫程 序为：0周时初次免疫；2和4周时各加强一次。免疫方式为腹腔注 射，按照表2所示免疫抗原与剂量进行免疫。初次免疫后，第8周抽 取眼球静脉血，分离血清，检测中和抗体滴度。检测结果如图12所 示。结果表明，根据实施例1-4所述方法获得的HPV16L1-C175A与 HPV52L1-ΔC428、HPV52L1-C175A与HPV16L1-ΔC428杂合VLP具有 良好的免疫原性，可在小鼠体内诱导高滴度的针对HPV16、HPV52的中 和抗体，可用作预防HPV16、HPV52感染的有效疫苗，此外，HPV16 L1-C175A与HPV52L1-ΔC428、HPV52L1-C175A与HPV16L1-ΔC428 杂合VLP还诱导产生了一定的针对HPV58的中和抗体。除了使用弗氏 佐剂外，该疫苗也可使用本领域公知的其他佐剂，例如氢氧化铝或磷 酸铝佐剂。
表3免疫剂量与程序表
实施例9：HPV16L1-C175A与HPV6L1-ΔC428、HPV52L1-C175A与 HPV16L1-ΔC428、HPV52L1-C175A与HPV6L1-ΔC428、HPV6L1-C175S 与HPV16L1-ΔC428、HPV6L1-C175S与HPV52L1-ΔC428杂合病毒样颗 粒制备以及形态学观察
杂合病毒样颗粒的组装
取2ml实施例1所得的纯度大于98％的杂合体蛋白按以 HPV16L1-C175A与HPV6L1-ΔC428、HPV52L1-C175A与HPV16L1-Δ C428、HPV52L1-C175A与HPV6L1-ΔC428、HPV6L1-C175S与HPV16L1- ΔC428、HPV6L1-C175S与HPV52L1-ΔC428组合按1∶1配比于2L复性 缓冲液透析充分交换，在交换完后，用2L储存缓冲液进行交换。
杂合病毒样颗粒形态学检测
将上述五种组合条件下组装的样品取100μL进行透射电镜观察。 使用的仪器为日本电子公司生产的100kV透射电镜，放大倍数为 100,000倍。将四种组装条件下的样品取13.5μL用2％磷钨酸pH7.0 负染，固定于喷炭的铜网上，进行观察。电镜结果见图12。图12显 示，这些蛋白可组装形成大量半径为25nm左右的病毒样颗粒，颗粒大 小与理论大小相符，且均匀一致。
另外，通过使用实施例8描述的方法可证实，本发明所获得的 HPV16L1-C175A与HPV6L1-ΔC428、HPV52L1-C175A与HPV16L1-Δ C428、HPV52L1-C175A与HPV6L1-ΔC428、HPV6L1-C175S与HPV16L1- ΔC428、HPV6L1-C175S与HPV52L1-ΔC428杂合体VLP同样具有良好 的免疫原性，可在动物体内诱导高滴度的中和抗体，从而可用作预防 HPV感染的疫苗。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人 员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修 改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围 由所附权利要求及其任何等同物给出。