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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410679166.0 (22)申请日 2014.11.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104497065 A (43)申请公布日 2015.04.08 (73)专利权人 浙江大学 地址 310027 浙江省杭州市西湖区浙大路 38号 (72)发明人 崔艳丽程照东夏成峰毛建卫 (74)专利代理机构 杭州浙科专利事务所(普通 合伙) 33213 代理人 郑文涛严晓 (51)Int.Cl. C07H 15/10(2006.01) C07H 1/00(200。
2、6.01) A61K 31/7032(2006.01) A61P 37/04(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 31/00(2006.01) (56)对比文件 CN 102020685 A,2011.04.20, JP 平1-93562 A,1989.04.12, CN 1279713 A,2001.01.10, CN 101010086 A,2007.08.01, CN 102020685 A,2011.04.20, CN 104497064 A,2015.04.08, Teiichi Murakami， 等. “A Convenient Synthesis。
3、 of Galactocerebroside Using D- Glucosamine as a Chiral Source of the Ceramide Moiety” . J. CHEM. SOC. PERKIN TRANS. 1 .1992,第1875-1876页. 审查员 郭冰洁 (54)发明名称 -半乳糖神经酰胺新异构体及其用途 (57)摘要 本发明提供了一种-半乳糖神经酰胺新异 构体及其用途， 所述-半乳糖神经酰胺新异构 体在鞘氨醇链的构型改变为4,5顺式双键鞘氨醇 链， 其能够被NKT细胞所识别并起刺激产生细胞 因子， 具肿瘤免疫治疗的应用潜力。 权利要求书1页 说明书4页 附。
4、图4页 CN 104497065 B 2017.10.24 CN 104497065 B 1.一种 -半乳糖神经酰胺异构体在制备优先诱导Th1细胞因子药物中的应用， 该 -半 乳糖神经酰胺异构体的鞘氨醇链为4,5顺式双键鞘氨醇链， 酰基链上带一个或多个顺式双 键。 2.一种 -半乳糖神经酰胺异构体在制备肿瘤免疫药物中的应用， 该 -半乳糖神经酰胺 异构体的鞘氨醇链为4,5顺式双键鞘氨醇链， 酰基链上带一个或多个顺式双键。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104497065 B 2 -半乳糖神经酰胺新异构体及其用途 技术领域 0001 本发明属于细胞生物学领域， 具体是一种 -半乳糖神经酰胺新。
5、异构体及其用途。 背景技术 0002 在20世纪的90年代Kirin Breweries等发现Agelas mauritianus海绵的提取物含 活性分子， 后合成化合物a结构见图1 (a-galactosylceramide， a-GalCer， KRN7000)具有免 疫生物活性。 -半乳糖神经酰胺 （KRN 7000） 是糖基神经酰胺(鞘糖脂)家族中最著名的成 员， 其被抗原提呈分子CD1d所识别形成二元复合体， 再与NKT细胞受体 （TCR） 相互作用， 激活 负责细胞间交流的信号传输分子即细胞因子， 细胞因子Th1/Th2免疫反应激活特定的其他 免疫细胞 （B细胞、 T细胞、 巨噬细。
6、胞等） 来起抗肿瘤、 抗菌功能 （Th1） 或保护机体对抗自身免 疫疾病 （Th2） 。 KRN7000的临床研究不是很成功， 主要因为KRN7000同时产生相互对抗的Th1 和Th2型免疫反应， 还有一个的缺点是过度刺激； 有必要发展新的KRN7000类似物能选择性， 适当地激活NKT细胞仅产生Th1型或Th2型免疫反应。 0003 由于KRN 7000令人向往的较广泛的应用前景和存在的缺陷， 吸引近十年众多的课 题组研究找寻优势诱导NKT细胞Th1型细胞因子分泌或优势诱导NKT细胞Th2型细胞因子分 泌的新 -半乳糖神经酰胺同系物。 0004 经查阅， 对鞘氨醇链 （Sphingosine。
7、 chain， 见图1化合物a） 的构型改变后分子活性 的研究罕有报道， 以往的研究都是关于4,5反式双键鞘氨醇链衍生物的合成 （见图1， 化合物 c, e） 与活性研究， 我们发明的 -半乳糖神经酰胺新异构体是在鞘氨醇链具有4,5顺式双键 （见图2） 。 我们注意到了最近有关的研究进展， 虽然磷脂抗原、 细菌源的抗原与 -半乳糖神 经酰胺同系物的脂类不同、 结构有区别， 但顺式双键在抗原脂链上表现得很显眼； 如在磷脂 抗原研究表明， NKT 细胞能够识别在一条或两条脂肪链上的一个或多个双键结构, 但是这 种双键结构必须是顺式构型, 只有至少含有一条不饱和脂肪酸链的才能被NKT 细胞识别， 而。
8、且含有多个双键结构比只含有单个双键结构更容易被识别， 此外, 增加酰基链的不饱和 度, 与CD 1 d分子结合的稳定性也随之增加。 对细菌源的抗原研究的发现其脂肪酸是带顺 式双键油酸具免疫活性。 电脑模拟的研究中发现， 酰胺链上插入顺式双键， 使链僵硬， 相对 比较接近CD 1 d分子。 并且带顺式双键能提高抗原的溶解度， 这对生物活性的实验很重要。 但对合成的 -半乳糖神经酰胺的4,5顺式双键鞘氨醇链衍生物的免疫活性研究 （见图2, 化 合物1a, 1b, 1c） 还未见报道。 发明内容 0005 为了解决上述技术问题， 本发明提供了一种 -半乳糖神经酰胺新异构体及其用 途。 0006 一种。
9、 -半乳糖神经酰胺新异构体， 其特征在于其在鞘氨醇链的构型改变为4,5顺 式双键鞘氨醇链。 0007 所述的一种 -半乳糖神经酰胺新异构体， 其特征在于其酰基链上带一个或多个顺 说明书 1/4 页 3 CN 104497065 B 3 式双键。 0008 所述的一种 -半乳糖神经酰胺新异构体的用途， 其特征在于其能够被NKT细胞所 识别并起刺激产生细胞因子。 0009 所述的用途， 其特征在于其优先诱导Th1细胞因子。 0010 所述的用途， 其特征在于其在肿瘤免疫治疗的用途。 0011 本发明 -糖基神经酰胺新异构体结构见图2。 重点在鞘氨醇链的构型改变为4,5顺 式双键鞘氨醇链， 改变酰胺。
10、链具有不同饱和度， -糖基神经酰胺新异构体表现新的免疫活 性偏好。 免疫活性实验利用鼠源NKT-杂交瘤细胞和鼠源脾脏淋巴细胞体外检测， 其中化合 物1b， 1c在杂交瘤细胞实验中与对照物KRN7000免疫活性相当， 显示其有免疫活性， 进一步 做免疫实验， -糖基神经酰胺新异构体可显示诱导偏向， 即在鼠源脾脏淋巴细胞实验中显 示优先诱导Th1细胞因子； 第三步的鼠源体内实验， -糖基神经酰胺新异构体仍然显示优先 诱导Th1细胞因子； 从其诱导的细胞因子偏好看， -半乳糖神经酰胺新异构体1b， 1c具肿瘤 免疫治疗的应用潜力。 0012 本发明具体方案如下： 0013 作为NKT诱导剂， -半乳。
11、糖神经酰胺新异构体 （1a-1c） 最初的体外生物活性测定 中， 1a， 1b， 1c对鼠源NKT细胞杂种瘤2H4和2Cl2都能诱导产生白介素-2 (IL-2)。 1a， 1b， 1c在 对鼠源NKT细胞杂种瘤2H4的实验中， 与KRN7000的活性相当； 在对鼠源NKT细胞杂种瘤2Cl2 的实验中1a， 1b， 1c明显比KRN7000活性高； 两个实验都表明， 酰胺链带双键有利于活性提 高。（见图3, 4） 0014 在对鼠源脾脏淋巴细胞体外刺激实验中， 能考察 -糖基神经酰胺新异构体 （1b, 1c） 的诱导偏好。 化合物1b和1c在2.5 g/mL和5 g/mL浓度下能够诱导培养的脾细。
12、胞产生的 IFN-g。 有趣的是， 我们发现1c在5 g/mL的浓度诱导IFN-g是a-GalCer在100ng/mL浓度下刺 激的两倍量 （如图5） 。 相反， 通过化合物1b和1c刺激后， Th2型的 IL-4分泌量却相当的低。 数 据很好地表明化合物1b和1c能够被NKT细胞所识别并起刺激作用， 生物活性明显体现在优 先诱导Th1细胞因子。 -半乳糖神经酰胺新异构体1b， 1c是新的NKT刺激剂， 并且化合物1b和 1c对NKT细胞的诱导具有明显的选择性； 从鼠NKT杂交瘤细胞 （图3， 4） 、 鼠源初级脾细胞测试 （图5） 和鼠的体内测试 （图6） ， -半乳糖神经酰胺新异构体的活性。
13、是一致的， 即免疫活性顺 序1c1b1a， 可见在胺酰链上带两个顺式双键比带一个顺式双键利于提高免疫生物活 性， 带一个顺式双键比饱和的酰胺链活性高； 有文献研究神经酰胺的酰基链上顺式双键数 目与活性的关系， 再增加顺式双键数目没能使活性增加明显。 0015 从图1可见， 当酰胺链都含顺式双键的20碳长链时， 鞘氨醇链是植物鞘氨醇 (化合 物d） ， 或是4， 5反式双键的鞘氨醇 （化合物e） ， 两化合物d, e经过生物测试都是NKT细胞优势 诱导Th2型细胞因子。 而我们的实验结果表明只是在 -GalCer类似物鞘氨醇链4， 5位改为顺 式， NKT细胞优势诱导就不是Th2型细胞因子， 而。
14、为Th1型细胞因子。 可见顺式的双键改变了 鞘氨醇链的空间走向， 直接影响到其与CD1d的结合的稳定性， 进而影响到NKT产生细胞因子 的类型。 也进一步说明， 过去的结论即当酰胺链含顺式双键的长链时NKT细胞优势诱导Th2 型细胞因子， 是不全面的； 当 -GalCer类似物鞘氨醇链有细微的差别， 虽 -GalCer类似物酰 胺链含顺式双键的长链但优势诱导是Th1型细胞因子。 可初步预测顺式双键在鞘氨醇链上 是影响到NKT产生细胞因子的类型的决定性因素。 因为细胞因子Th1免疫反应激活特定的其 说明书 2/4 页 4 CN 104497065 B 4 他免疫细胞 （B细胞、 T细胞、 巨噬细。
15、胞等） 来起抗肿瘤、 抗菌功能， 化合物1b、 1c具肿瘤免疫治 疗的应用潜力。 0016 本发明的有益效果如下： 0017 （1） 扩展了 -半乳糖神经酰胺新异构体， 系统研究了4,5顺式双键鞘氨醇链衍生物 的免疫活性；（2） 发现顺式双键对 -半乳糖神经酰胺新异构体的免疫活性影响， 即在鞘氨醇 链4,5顺式双键情况下， 改变酰胺链具有不同饱和度的顺式双键；（3） 新发明克服原来技术 中KRN7000同时产生相互对抗的Th1和Th2型免疫反应， 对NKT细胞的诱导具有明显的选择 性， 即优先NKT的Th1细胞因子；（4） 新发明克服原来技术中KRN7000另一缺点是过度刺激； （5） 从鼠源。
16、NKT杂交瘤细胞测试、 鼠源初级脾细胞测试到活鼠的体内测试， -半乳糖神经酰 胺新异构体的活性是一致， 即优先诱导NKT的Th1细胞因子； 特别是经过体内实验后结果还 是很突出， 为进一步把 -半乳糖神经酰胺新异构体用于免疫治疗提供了可靠的基础；（6） 过 去的结论即当酰胺链含顺式双键的长链时NKT细胞优势诱导Th2型细胞因子， 是不全面的； 当 -GalCer类似物鞘氨醇链有细微的差别， 虽 -GalCer类似物酰胺链含顺式双键的长链但 优势诱导是Th1型细胞因子。 可初步预测顺式双键在鞘氨醇链上是影响到NKT产生细胞因子 的类型的决定性因素。（7） 由于 -半乳糖神经酰胺新异构体优先诱导N。
17、KT的Th1细胞因子， 免 疫反应激活特定的其他免疫细胞 （B细胞、 T细胞、 巨噬细胞等） 来起抗肿瘤、 抗菌功能， 可明 确确定 -半乳糖神经酰胺新异构体1c具肿瘤免疫治疗的应用潜力。 附图说明 0018 图1是已报道的 -半乳糖神经酰胺异构体的结构和优势诱导细胞因子情况图； 0019 图2 是本发明的 -半乳糖神经酰胺新异构体 （1a-1c） 结构图； 0020 图3 是 -半乳糖神经酰胺新异构体对鼠源NKT杂化瘤细胞2H4的活性测试图； 0021 图4 是 -半乳糖神经酰胺新异构体对鼠源NKT杂化瘤细胞2Cl2的活性测试图； 0022 图5是 -半乳糖基神经酰胺新异构体对鼠源脾细胞的细。
18、胞因子诱导图； 0023 图6 是 -半乳糖基神经酰胺新异构体在小鼠体内细胞因子诱导图。 具体实施方式 0024 下面结合具体实施例对本发明的技术方案作详细说明： 0025 实施例1 0026 -半乳糖神经酰胺新异构体对鼠源NKT杂交瘤细胞2H4和2Cl2免疫活性检测 0027 实验 0028 1） 细胞的培养 0029 鼠源NKT杂化瘤和A20-CD1d细胞株是由Mitchell Kronenberg提供的 （拉霍亚过敏 反应与免疫学研究所， 拉荷亚， 美国） 。 细胞株保存在含有10%胎牛血清， 2mM丙酮酸钠， 2nM L-谷氨酸盐和50 M 2-巯基乙醇的RPM1640培养基中。 00。
19、30 2） NKT杂交瘤细胞测定 0031 通过A20-CD1d识别糖脂递呈NKT 杂化瘤2H4分泌IL-2。 -GalCer和需要测试的药 物溶在DMSO （二甲基甲酰胺） 中， 浓度为1mg/mL， 并用细胞培养液稀释到所需浓度， 然后加到 A20-CD1d 细胞 （105个） 中培养16h， 然后用培养液洗涤A20-CD1d 细胞， 并和2H4 杂化瘤细 说明书 3/4 页 5 CN 104497065 B 5 胞 (5104 cells)混合。 最后在混合物 （200 L） 培养24h， 然后释放的IL-2 （pg/mL） 通过酶 联免疫吸附测定。 (上海依科赛生物制品有限公司， 上海。
20、， 中国)。 0032 NKT 杂化瘤2Cl2按照同样的方法， 释放的IL-2 （pg/mL） 通过酶联免疫吸附测定。 0033 结果见图3、 图4。 (对NKT杂交瘤细胞释放的IL-2 （pg/mL） 进行酶联免疫吸附测定。 杂交瘤细胞在1 g/mL的 -半乳糖神经酰胺新异构体和100ng/mL 的 GalCer培养24h。 数据 为三次实验的平均值。 ) 0034 实施例2 0035 -半乳糖基神经酰胺新异构体对鼠源脾脏淋巴细胞体外刺激 0036 为了进一步分析新合成的NKT诱导剂在Th1和Th2的诱导选择性， 在一定浓度所测 的新合成的分子或空白情况下培养鼠源脾脏淋巴细胞， 数天刺激后收。
21、集细胞培养上清， ELISA检测上清中IFN-r （Th1细胞因子） 和IL-4 （Th2细胞因子） 含量。 0037 1） 鼠源脾脏淋巴细胞体外测试 0038 C57BL/6鼠源脾脏淋巴细胞 （5105） 在含0.1 g/mL的 -GalCer， 需测一定浓度化 合物， 或DMSO空白96-孔 U底盘中培养五天， 培养基为含有10%的FCS （胎小牛血清） ， L-谷氨 酸盐， 2-巯基乙醇， 青霉素和链霉素的RPMI1640培养基。 温度为37 C， 含二氧化碳5%。 并在培 养的第二天加入25 IU/mL mIL-2 PeproTech （生长因子） 。 收集五天后无细胞的上层液用作 细。
22、胞因子测定， 并且IFN- 和 IL-4的值通过酶联免疫吸附测定。 0039 2） 鼠源脾脏淋巴细胞体外测试结果。 0040 见图5。 (一定浓度的样品在五天孵化后酶联免疫吸附测定培养上清液的IFN-和 IL-4。 数据是取三次实验的平均值。 ) 0041 实施例3 0042 -半乳糖神经酰胺新异构体的C57BL / 6小鼠体内免疫实验 0043 1） -半乳糖神经酰胺新异构体的小鼠体内实验 0044 -半乳糖神经酰胺新异构体1 g和参考物 -GalCer 1 g溶于200 L PBS （即磷酸缓 冲盐溶液） 腹腔注射C57BL / 6小鼠。 2次血清收集点(2 h和24小时)， 对IFN 和。
23、IL-4 ELISA测定。 0045 2） -半乳糖神经酰胺新异构体的小鼠体内实验结果。 0046 见图6。（数据为三次实验的平均值。 ) 0047 （项目资助： 国家自然科学基金30870553； 国家国际科技合作项目2010DFA34370； 浙江省国际科技合作专项2013C14012。 ） 0048 以上所述仅为本发明的较佳实施例， 并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和 原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等， 均包含在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 104497065 B 6 图1 说明书附图 1/4 页 7 CN 104497065 B 7 图2 图3 说明书附图 2/4 页 8 CN 104497065 B 8 图4 图5 说明书附图 3/4 页 9 CN 104497065 B 9 图6 说明书附图 4/4 页 10 CN 104497065 B 10 。