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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610439596.4 (22)申请日 2016.06.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106046110 A (43)申请公布日 2016.10.26 (73)专利权人 浙江工商大学 地址 310018 浙江省杭州市下沙高教园区 学正街18号 (72)发明人 王奎武周蔓青 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟王兵 (51)Int.Cl. C07J 71/00(2006.01) A61P 35/00(2006.。
2、01) 审查员 张建英 (54)发明名称 木栓烷型三萜3,24-环氧-2,24-二羟基- 29-木栓烷酸及其制备方法和应用 (57)摘要 本发明提供了一种木栓烷型三萜3,24-环 氧-2,24-二羟基-29-木栓烷酸及其制备方法， 本发明所述木栓烷型三萜3,24-环氧-2,24-二 羟基-29-木栓烷酸的提取、 分离、 纯化方法简单， 抑制肿瘤细胞活性明确， 具有潜在的开发为抗肿 瘤药物的价值， 该化合物化学结构经过波谱学数 据得到确认， 不存在光学异构体， 可以避免光学 异构体潜在的风险。 权利要求书2页 说明书7页 附图1页 CN 106046110 B 2017.07.07 CN 106。
3、046110 B 1.一种木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸， 其结构式如式(I)所示： 2.如权利要求1所述的式(I)所示木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷 酸的制备方法， 其特征在于， 所述的制备方法按如下步骤进行： (1)甲醇浸提： 将三花假卫矛的藤茎粉碎干燥， 加入甲醇浸提提取， 之后滤除不溶物， 滤 液减压蒸干得到甲醇浸膏； (2)乙酸乙酯萃取： 步骤(1)所得甲醇浸膏用乙酸乙酯萃取， 萃取液减压蒸干得到乙酸 乙酯浸膏； (3)一次柱层析： 用200300目柱层析硅胶对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏进行柱层析分 离， 以石油醚/乙酸乙。
4、酯体积比5： 11： 5的混合液、 乙酸乙酯为洗脱剂， 进行梯度洗脱， 收集 含目标化合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得粗品； (4)二次柱层析： 用300400目柱层析硅胶继续对步骤(3)所得粗品进行柱层析分离， 以石油醚/乙酸乙酯体积比1： 11： 4的混合液为洗脱剂， 进行梯度洗脱， 收集含目标化合物 的洗脱液， 减压蒸除溶剂得到固体物质； (5)洗涤除杂： 将步骤(4)所得固体物质用石油醚/乙酸乙酯混合溶剂进行洗涤除杂， 最 后干燥得到所述式(I)所示的木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸。 3.如权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(1)甲醇浸提的。
5、操作方法为： 将 粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎与甲醇以料液质量比1： 35混合， 常温浸提510天， 过滤得 到甲醇提取液， 滤渣重复浸提24次， 合并每次所得甲醇提取液， 减压蒸干， 得到甲醇浸膏。 4.如权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(2)乙酸乙酯萃取的操作方法 为： 将步骤(1)所得甲醇浸膏分散于510倍质量的水中， 得到悬浮液， 用等体积的乙酸乙酯 萃取3次， 合并乙酸乙酯相， 减压回收溶剂， 得到乙酸乙酯相浸膏。 5.如权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述梯度洗脱的操作方法 为： 以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5： 1、 1： 1、 1： 。
6、3、 1： 5的混合液、 乙酸乙酯为洗脱剂， 进行 梯度洗脱， 洗脱剂的流速为57mL/min， 每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为300400min， 收 集含目标化合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得粗品。 6.如权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 所述梯度洗脱的操作方法 为： 以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为1： 1、 1： 2、 1： 3、 1： 4的混合液为洗脱剂， 进行梯度洗脱， 洗脱剂的流速为34mL/min， 每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为5070min， 收集含目标化合 物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得到固体物质。 7.如权利要求2所述的制备方法， 其特征在于， 所述步骤(。
7、5)洗涤除杂的操作方法为： 在 离心管中加入所述固体物质， 再加入固体物质的质量23倍的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂， 权利要求书 1/2 页 2 CN 106046110 B 2 40KHz超声10s， 离心， 去除上清液， 重复洗涤3次， 最后干燥得到产物； 所述的石油醚/乙酸乙 酯混合溶剂中， 石油醚与乙酸乙酯的体积比为1： 1。 8.如权利要求1所述的木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸在制备抗 肿瘤活性药物中的应用。 9.如权利要求8所述的木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸在制备抗 人乳腺癌或人肝癌药物中的应用。 权利要求书 2/2 。
8、页 3 CN 106046110 B 3 木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸及其制 备方法和应用 (一)技术领域 0001 本发明涉及一种木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸及其制备 方法和应用。 (二)背景技术 0002 卫矛科植物中的巧茶属(Catha Benth.)、 南蛇藤属(Celastrus L.)、 十齿花属 (Dipentodon Dunn)、 卫矛属(Euonymus I.)、 沟瓣属(Glyptopetalum Thw.)、 美登木属 (Maytenus Molina)、 假卫矛属(Microtropis wall.ex。
9、 Mcissa)、 核子木属(Perrottetia H.B.K.)、 雷公藤属(Tripterygium Hook.F.)的某些植物在我国作为药用植物和民间药用 植物。 传统中医认为其具有清热、 祛风、 除湿、 活血、 解毒、 消肿的功效， 常用于治疗风湿积累 的风湿性关节炎、 腰腿痛、 筋骨痛、 牙痛、 闭经、 痢疾、 跌打损伤、 肠风痔漏、 毒蛇咬伤、 疮疡、 痈疖等症； 现代药理研究表明本科植物具有抗炎、 抗菌、 抗病毒、 抗生育、 昆虫拒食及毒杀等 活性， 目前多用于治疗风湿性及类风湿性关节炎、 血液病及皮肤病， 也用作农用杀虫剂。 0003 因此对该类植物进行系统、 科学的研究， 。
10、探明其有效成分及作用机理， 发现一些结 构新颖的活性成分， 将对更深层开发利用卫矛科药用植物的食疗保健产品、 开发治疗药物 及临床应用产生重要意义。 0004 三花假卫矛(学名： Microtropis triflora)是卫矛科假卫矛属(Microtropis Wall.ex Meissn.)植物， 灌木， 高2.55米， 是中国的特有植物。 分布于中国大陆的云南、 贵 州、 四川、 湖北等地， 生长于海拔13002100米的地区， 一般生长在林中以及山坡林缘。 0005 本发明以三花假卫矛植物藤茎为研究对象， 进行提取、 分离、 纯化、 结构鉴定得到 3,24-环氧-2 ,24-二羟基-2。
11、9-木栓烷酸， 属于木栓烷型三萜化合物， 该化合物具有一定程 度的抗肿瘤活性。 (三)发明内容 0006 本发明旨在提供一种木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸及其 制备方法和应用。 0007 为实现上述目的， 本发明采用如下技术方案： 0008 一种木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸， 其结构式如式(I)所 示： 说明书 1/7 页 4 CN 106046110 B 4 0009 0010 一种式(I)所示的木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸的制备方 法， 所述的制备方法按如下步骤进行： 0011 (1)甲醇浸。
12、提： 将三花假卫矛的藤茎粉碎干燥， 加入甲醇浸提提取， 之后滤除不溶 物， 滤液减压蒸干得到甲醇浸膏； 0012 步骤(1)中， 所述甲醇浸提提取的具体操作方法为： 将粉碎干燥后的三花假卫矛藤 茎与甲醇以料液质量比1： 35混合， 常温(2030)浸提510天， 过滤得到甲醇提取液， 滤渣重复浸提24次， 合并每次所得甲醇提取液， 减压蒸干， 得到甲醇浸膏。 0013 (2)乙酸乙酯萃取： 步骤(1)所得甲醇浸膏用乙酸乙酯萃取， 萃取液减压蒸干得到 乙酸乙酯浸膏； 0014 步骤(2)中， 所述乙酸乙酯萃取的具体操作方法为： 将步骤(1)所得甲醇浸膏分散 于510倍质量的水中， 得到悬浮液， 。
13、用等体积的乙酸乙酯萃取3次， 合并乙酸乙酯相， 减压 回收溶剂， 得到乙酸乙酯相浸膏。 0015 (3)一次柱层析： 用200300目柱层析硅胶对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏进行柱层 析分离， 以石油醚/乙酸乙酯体积比5： 11： 5的混合液和乙酸乙酯(纯)为洗脱剂， 进行梯度 洗脱， 收集含目标化合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得粗品； 0016 步骤(3)中， 所述梯度洗脱的具体操作方法为： 以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为 5： 1、 1： 1、 1： 3、 1： 5的混合液、 乙酸乙酯(纯)为洗脱剂， 进行梯度洗脱， 洗脱剂的流速为5 7mL/min， 每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为300400。
14、min， 收集含目标化合物的洗脱液， 减压 蒸除溶剂得粗品。 0017 (4)二次柱层析： 用300400目柱层析硅胶继续对步骤(3)所得粗品进行柱层析分 离， 以石油醚/乙酸乙酯体积比1： 11： 4的混合液为洗脱剂， 进行梯度洗脱， 收集含目标化 合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得到固体物质； 0018 步骤(4)中， 所述梯度洗脱的具体操作方法为： 以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为 1： 1、 1： 2、 1： 3、 1： 4的混合液为洗脱剂， 进行梯度洗脱， 洗脱剂的流速为34mL/min， 每种梯 度的洗脱剂的洗脱时间为5070min， 收集含目标化合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得到固体 物。
15、质。 0019 (5)洗涤除杂： 将步骤(4)所得固体物质用石油醚/乙酸乙酯混合溶剂进行洗涤除 杂， 最后干燥得到所述式(I)所示的木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸； 0020 步骤(5)所述的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂中， 石油醚与乙酸乙酯的体积比为1： 1； 所述洗涤除杂的具体操作方法为： 在离心管中加入所述固体物质， 再加入固体物质的质量2 3倍的石油醚/乙酸乙酯混合溶剂， 40KHz超声10s， 离心， 去除上清液， 重复洗涤3次， 最后 说明书 2/7 页 5 CN 106046110 B 5 干燥得到产物。 0021 本发明所述步骤(3)、 (4)的柱层。
16、析过程中， 可通过薄层层析(TLC)检测收集含目标 化合物(木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸)的洗脱液； 所述的目标化合 物用TLC检测时， 以石油醚： 乙酸乙酯1： 2为展开剂， 其Rf值为0.5。 0022 经实验证明， 本发明所述木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸在 制备抗肿瘤活性药物中有应用前景。 0023 本发明所述的木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸与DDP对照组 相比较， 高浓度时对人乳腺癌Bcap37细胞及人肝癌SMMC7721细胞具有显著的体外增殖抑制 作用， 且对SMMC7721细胞的抑制。
17、作用强于Bcap37细胞。 这提示该化合物具有潜在的抗肿瘤 活性。 0024 本发明的有益效果在于： 本发明所述木栓烷型三萜3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29- 木栓烷酸的提取、 分离、 纯化方法简单， 抑制肿瘤细胞活性明确， 具有潜在的开发为抗肿瘤 药物的价值， 该化合物化学结构经过波谱学数据得到确认， 不存在光学异构体， 可以避免光 学异构体潜在的风险。 (四)附图说明 0025 图1为实施例5中DDP、 木栓烷型三萜(I)对两种癌细胞的半致死浓度(IC50)； 0026 图2为实施例5中木栓烷型三萜(I)对两种癌细胞的生长抑制率。 (五)具体实施方式 0027 下面通过具体实施例对。
18、本发明作进一步的说明， 但本发明的保护范围并不仅限于 此。 0028 实施例1： 3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸的制备 0029 (1)甲醇浸提： 将粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎1000g与甲醇3000mL混合， 常温浸 提10天， 过滤得到甲醇提取液， 滤渣重复浸提3次， 合并每次所得甲醇提取液， 减压蒸干， 得 到甲醇浸膏112g。 0030 (2)乙酸乙酯萃取： 将步骤(1)所得甲醇浸膏112g分散于水1000mL中， 得到悬浮液， 用等体积的乙酸乙酯萃取3次， 合并乙酸乙酯相， 减压回收溶剂， 得到乙酸乙酯浸膏39g。 0031 (3)一次柱层析： 用200300目柱。
19、层析硅胶300g对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏39g 进行柱层析分离， 以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5： 1、 1： 1、 1： 3、 1： 5的混合液、 乙酸乙酯 (纯)为洗脱剂， 进行梯度洗脱， 洗脱剂的流速为7mL/min， 每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为 300min， 收集含目标化合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得粗品1.6g； 0032 (4)二次柱层析： 用300400目柱层析硅胶150g继续对步骤(3)所得粗品1.6g进行 柱层析分离， 以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为1： 1、 1： 2、 1： 3、 1： 4的混合液为洗脱剂， 进行 梯度洗脱， 洗脱剂的流速为4mL/min， 每种。
20、梯度的洗脱剂的洗脱时间为50min， 收集含目标化 合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得到固体物质0.22g； 0033 (5)洗涤除杂： 在离心管中加入步骤(4)所得固体物质0.22g， 再加入石油醚/乙酸 乙酯体积比1： 1的混合溶剂0.5mL， 40KHz超声10s， 离心， 去除上清液， 重复洗涤3次， 最后干 燥得到产物3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸0.18g。 说明书 3/7 页 6 CN 106046110 B 6 0034 实施例2： 3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸的制备 0035 (1)甲醇浸提： 将粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎500g与甲醇2。
21、000mL混合， 常温浸提 7天， 过滤得到甲醇提取液， 滤渣重复浸提2次， 合并每次所得甲醇提取液， 减压蒸干， 得到甲 醇浸膏60g。 0036 (2)乙酸乙酯萃取： 将步骤(1)所得甲醇浸膏60g分散于水300mL中， 得到悬浮液， 用 等体积的乙酸乙酯萃取3次， 合并乙酸乙酯相， 减压回收溶剂， 得到乙酸乙酯浸膏22g。 0037 (3)一次柱层析： 用200300目柱层析硅胶300g对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏22g 进行柱层析分离， 以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5： 1、 1： 1、 1： 3、 1： 5的混合液、 乙酸乙酯 (纯)为洗脱剂， 进行梯度洗脱， 洗脱剂的流速为5mL。
22、/min， 每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为 400min， 收集含目标化合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得粗品0.75g； 0038 (4)二次柱层析： 用300400目柱层析硅胶75g继续对步骤(3)所得粗品0.75g进行 柱层析分离， 以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为1： 1、 1： 2、 1： 3、 1： 4的混合液为洗脱剂， 进行 梯度洗脱， 洗脱剂的流速为3mL/min， 每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为70min， 收集含目标化 合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得到固体物质0.10g； 0039 (5)洗涤除杂： 在离心管中加入步骤(4)所得固体物质0.10g， 再加入石油醚/乙酸 乙酯体积比1：。
23、 1的混合溶剂0.2mL， 40KHz超声10s， 离心， 去除上清液， 重复洗涤3次， 最后干 燥得到产物3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸0.08g。 0040 实施例3： 3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸的制备 0041 (1)甲醇浸提： 将粉碎干燥后的三花假卫矛藤茎1000g与甲醇4000mL混合， 常温浸 提5天， 过滤得到甲醇提取液， 滤渣重复浸提4次， 合并每次所得甲醇提取液， 减压蒸干， 得到 甲醇浸膏119g。 0042 (2)乙酸乙酯萃取： 将步骤(1)所得甲醇浸膏119g分散于水800mL中， 得到悬浮液， 用等体积的乙酸乙酯萃取3次， 。
24、合并乙酸乙酯相， 减压回收溶剂， 得到乙酸乙酯浸膏41g。 0043 (3)一次柱层析： 用200300目柱层析硅胶300g对步骤(2)所得乙酸乙酯浸膏41g 进行柱层析分离， 以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为5： 1、 1： 1、 1： 3、 1： 5的混合液、 乙酸乙酯 (纯)为洗脱剂， 进行梯度洗脱， 洗脱剂的流速为6mL/min， 每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为 350min， 收集含目标化合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得粗品1.7g； 0044 (4)二次柱层析： 用300400目柱层析硅胶150g继续对步骤(3)所得粗品1.7g进行 柱层析分离， 以石油醚/乙酸乙酯体积比分别为1： 1、。
25、 1： 2、 1： 3、 1： 4的混合液为洗脱剂， 进行 梯度洗脱， 洗脱剂的流速为3mL/min， 每种梯度的洗脱剂的洗脱时间为65min， 收集含目标化 合物的洗脱液， 减压蒸除溶剂得到固体物质0.24g； 0045 (5)洗涤除杂： 在离心管中加入步骤(4)所得固体物质0.24g， 再加入石油醚/乙酸 乙酯体积比1： 1的混合溶剂0.5mL， 40KHz超声10s， 离心， 去除上清液， 重复洗涤3次， 最后干 燥得到产物3,24-环氧-2 ,24-二羟基-29-木栓烷酸0.20g。 0046 实施例4： 化合物测试 0047 表1： 实验所用仪器 0048 说明书 4/7 页 7 C。
26、N 106046110 B 7 0049 0050 试剂： 核磁共振使用氘代DMSO(二甲亚砜)试剂， 质谱使用德国默克(Merck)色谱纯 试剂。 0051 对实施例1、 实施例2或实施例3制得的木栓烷型三萜化合物(I)进行理化性质和波 谱学分析， m.p.297-299， ESI-MS测定值m/z:487M-H-， 结合NMR数据确定其分子式为 C30H48O5， 分子量为488， 不饱和度为7。 0052 表2： 所得木栓烷型三萜化合物(I)的NMR数据 说明书 5/7 页 8 CN 106046110 B 8 0053 0054 0055 实施例5： 抗肿瘤活性测试 0056 我们对实。
27、施例1制得的木栓烷型三萜(I)进行了体外抗肿瘤活性测试。 0057 方法： 取对数生长期肿瘤细胞， 调整细胞悬液浓度， 每孔100 L细胞悬液接种于96 孔细胞培养板中， 接种24h后给药(100 L/孔)， 分别设细胞对照组以及4个浓度受试药物组。 继续培养72h后每孔加入100 L MTT(1mg/mL， 以DMEM培养液溶解)， 37孵育2h， 弃去各孔内 液体后加入150 L酸化异丙醇(含0.04mol/L HCl)， 避光放置30min， DG3022A型酶联免疫检 说明书 6/7 页 9 CN 106046110 B 9 测仪测定570nm处吸光度， 计算各受试药物对肿瘤细胞的增殖抑制率， 以孙瑞元教授编写的 NDST计算机程序计算各受试药物的半数抑制浓度(IC50)。 0058 结果： 实施例1所制得的木栓烷型三萜与DDP对照组相比较， 高浓度时对人乳腺癌 Bcap37细胞及人肝癌SMMC7721细胞具有显著的体外增殖抑制作用， 其中对SMMC7721细胞的 抑制作用强于Bcap37细胞。 这提示该化合物是潜在的抗肿瘤活性的药物(如图1、 2所示)。 说明书 7/7 页 10 CN 106046110 B 10 图1 图2 说明书附图 1/1 页 11 CN 106046110 B 11 。