技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用哺乳动物细胞培养高效表达重组八 因子的工艺方法。
背景技术
天然人凝血八因子（FVIII）是一种大分子糖蛋白，由重链和轻链结合而成，总分子量 330KD，血浆中含量约0.2mg/L，以结合血管性血友病因子（VWF）的形式存在。血液凝集 反应中，活化的FVIII使FIX的酶活大大提高，催化FX的活化，并结合组成一个复合体， 催化凝集链式反应进行下去。FVIII分子的缺失或缺乏导致A型血友病，补充有活性的FVIII 是治疗A型血友病的有效措施。
重组人FVIII与天然FVIII有相同的生理，药理和免疫特征，并且有杜绝HIV，HDV， 蛋白病毒等病源传播的优点，因此，重组FVIII蛋白表达的研究成为A型血友病治疗的一 个重要趋势。世界上第一支重组人凝血八因子，即第一代的重组八因子在1990年就已经上 市。目前全球的八因子销售年达到了70亿国际单位，其中60%为基因工程重组凝血八因子。
天然FVIII总是与vWF结合成复合物而稳定存在。重组FVIII分泌至细胞的无血清培 养基时，分子很容易解体，并且被降解，表达的FVIII得不到积累。利用vWF和FVIII共 表达系统可以很好地解决重组FVIII在细胞分泌表达过程中的不稳定和容易降解等问题。 Kaufman等人的研究表明，FVIII与VWF共表达后可显著提高FVIII的表达水平。此外， 在有血清的培养条件下，血清中的VWF可以结合新生成的VIII，形成比较稳定的复合物， 达到FVIII在细胞培养液中累积的效果。
在利用细胞大规模培养来生产重组八因子过程中，为了提高八因子的表达量，利用有 血清培养基或者在哺乳动物细胞中共转染FVIII和VWF基因，稳定了八因子的表达，但这 两种方法都存在各自的局限性。对于有血清培养基来说，由于在哺乳动物细胞培养过程中， 外源添加动物血清而带来了病毒潜在污染的风险。因此，目前利用哺乳动物细胞生产蛋白 质药物中倾向于无血清培养替代有血清细胞培养。而对于VWF与FVIII基因的共表达来说， 人们在研究重组人凝血八因子表达中发现，VWF与FVIII共表达，八因子的表达量比较低， 细胞株的构建也比较复杂，筛选出的高表达八因子细胞株在无血清培养基中的表达量一般 在0.1-0.5国际单位/天/106细胞，此表达水平远远达不到产业化的要求。可见，目前急需一 种新的培养方法来表达重组八因子，能够在无血清培养条件下实现重组八因子的工业化生 产，使八因子的表达简单、高效、无病毒污染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用哺乳动物细胞培养高效表达重 组八因子的工艺方法。
本发明首先公开了一种高效表达重组人凝血八因子的方法，为将外源的血管性血友病 因子添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中，并在培养过程中控制细胞培养液中血 管性血友病因子与人凝血八因子的活性比为1～10:1。
较优的，所述表达重组人凝血八因子的细胞培养液为无血清细胞培养液。
本发明中所述表达重组人凝血八因子的细胞为单独表达重组FVIII的细胞株，VWF为 另外制备，作为分子伴侣额外添加到表达重组人凝血八因子的细胞培养液中的外源物质。
本发明提供的技术方案是将VWF按照一定的比例添加到重组八因子的细胞培养液中， 可大大提高重组八因子的表达量，这种方法为工业化八因子的生产提供了一种简单实用的 实现路径。本发明的方法不需将八因子和VWF基因共转染宿主细胞，简化了细胞株构建过 程，提高了高产细胞株筛选效率，特别适合工业化大规模生产重组人凝血八因子。
较优的，所述高效表达重组人凝血八因子的方法具体步骤如下：
1）表达细胞的准备：表达人凝血八因子的细胞株的构建或者表达人凝血八因子的冻存细胞 的复苏；
2）表达细胞的扩种培养：将步骤1）构建或复苏的人凝血八因子表达细胞接种到无血清培 养基中，振荡培养3～4天，至细胞密度达到1～2×106cells/ml，细胞传代，振荡培扩增 养至细胞密度达到1～2×106cells/ml，获得种子液；
3）细胞反应器培养：将步骤2）获得的种子液接种到细胞反应器的无血清培养基中，培养 4～7天，使细胞液的细胞密度达到1～5×106cells/ml；然后向细胞液中加入外源VWF并 对细胞液进行补料培养，获得细胞原液；所述补料培养过程中，控制细胞液中VWF活 性与FVIII活性比为1～10:1；
4）凝血八因子产品的制备：对细胞原液进行离心、过滤、纯化处理，获得重组人凝血八因 子产品。
步骤1）所述表达人凝血八因子的细胞株或者表达人凝血八因子的冻存细胞为构建的 单独表达人凝血八因子的细胞株，并且表达的FVIII包括全长FVIII的和B区有缺失的FVIII 片段。构建方法为常规分子生物学重组蛋白制备方法。
较优的，步骤2）中构建或复苏的人凝血八因子表达细胞以1～9×105cells/ml的接种量 进行接种。表达细胞的扩种培养可以将构建或复苏的人凝血八因子表达细胞接种到三角瓶 中，经过摇瓶培养、传代、摇瓶培养获得种子液。
较优的，步骤2）中所述细胞传代是以1:2～4的传代比例传代。
更优的，步骤2）中所述细胞传代是以1:3的传代比例传代。
较优的，步骤2）中振荡培养的条件为：转速60～150转/分钟，培养温度32～38℃。
较优的，步骤3）种子液接种到细胞反应器的接种量为5～10v/v%。
较优的，步骤3）所述补料培养的条件为：补料培养过程中控制溶氧40～80％，pH6.8～ 7.2，搅拌转速40～90转/分钟，培养温度32～38℃，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡 萄糖浓度维持在0.5～1.5g/L。
更优的，步骤3）所述补料培养的条件为：补料培养过程中控制溶氧40～80％，pH6.8～ 7.2，搅拌转速40～90转/分钟，培养温度37℃，根据葡萄糖的消耗来进行补料，使葡萄糖 浓度维持在1.0g/L。
较优的，步骤3）反应器培养得到的所述细胞原液的细胞密度为1～2×107cells/ml。
步骤4）所述重组人凝血八因子产品的制备所采用的离心、过滤、纯化处理为常规的 蛋白分离纯化步骤，获得的较高纯度的FVIII中VWF既可除去也可仍旧保留。
本发明步骤2）表达细胞的扩种培养及步骤3）细胞反应器培养均可采用现有的常规无 血清细胞培养液进行细胞培养。
本发明克服了现有技术中为了得到稳定的凝血八因子必须要在同一个细胞株中共表达 八因子和VWF的难点。本发明提出了一种有效的细胞培养途径，通过将FVIII和VWF的 含量控制在一定的优化范围内，使FVIII的表达被大量累积，并且本发明的制备工艺表达细 胞构建难度小，特别适合工业化生产重组人凝血八因子。
本发明的效果包括：1）本发明的生产方法采用的是单独表达八因子细胞株，不需要八 因子与VWF共转染细胞株，前期的细胞株构建和筛选过程简单；2）细胞培养过程添加了 VWF因子，提高了八因子的累积和稳定；3）适合工业化生产，可非常简单地提高八因子 表达量，也容易放大。
附图说明
图1：重组八因子的大规模反应器培养工艺流程
图2：凝血八因子活性检测的标准曲线图
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本 发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件， 如［美］Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社 2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例一
1.实验方法
1）将驯化为无血清培养的八因子表达细胞（八因子表达细胞的构建参考文献“凝血因子FVIII 在哺乳动物细胞中的表达研究”，王琪等，药物生物技术，2002,9（5）：251~255；细胞株无 血清驯化方法可参照细胞培养手册，如invitrogen公司产品手册附录中细胞培养操作部分）， 以9×105cells/ml接种三角摇瓶，培养温度32℃，摇瓶转速为60转/分钟；无血清培养约3 天后细胞密度达到2×106cells/ml，以1:2的比例传代，摇瓶培养，培养温度38℃，转速60 转/分钟，至细胞密度达到1～2×106cells/ml。无血清细胞培养液为商业化SIGMA公司产品 SFMII302培养液。
2）用含有不同活性重组VWF（重组VWF蛋白的制备参考文献Recombinant von Willebrand factor:Potential Therapeutic Use，BernhardE.Fischer，Journal of Thrombosis and Thrombolysis ，Volume8,Number3(1999),197-205）的培养液换液培养表达八因子的细胞（检测VWF活 性的试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司），培养24小时后，收集细胞培养液进行八因 子活性分析（见表1）。
本实施例所采用的无血清细胞培养液为商业化SIGMA公司产品SFMII302培养液。
3）八因子活性分析方法
采用人凝血因子VIII测定法（一期法），可参加中国药典三部附录XN人凝血因子VIII 测定法，具体步骤如下：
A.试剂：
⑴3.8%枸橼酸钠：取枸橼酸钠9.5g，加水溶解并稀释至250ml。
⑵咪唑缓冲液（pH7.3）：取咪唑0.68g和氯化钠1.17g，加水使溶解成100ml，加入0.1mol/L 盐酸溶液42.2ml，再加水稀释至200ml，即得。
⑶稀释液：取一体积的3.8%的枸橼酸钠加入5体积咪唑缓冲液混合，加适量20%人血 白蛋白至终浓度为1%。
⑷激活的部分凝血活酶（APTT）试剂。
⑸人凝血因子VIII缺乏血浆：为人凝血因子VIII含量低于1%的人血浆或人工基质血 浆。
⑹0.05mol/L氯化钙溶液：取氯化钙（CaCl2·2H2O）147g，加水溶解并稀释至1000ml， 配制成1mol/L的氯化钙贮存液，用前用水稀释20倍，配制成0.05mol/L氯化钙溶液。
B.人凝血因子VIII标准液的制备：
用人凝血因子VIII缺乏血浆将标准品（人凝血因子VIII标准品，购自法国Stago公司） 稀释成每1ml含1IU凝血因子VIII，再用稀释液分别进行10倍、20倍、40倍和80倍稀释， 置冰浴待用。
C.待测样品溶液的制备：
用人凝血因子Ⅷ缺乏血浆将待检测样品稀释成每1ml含1IU凝血因子Ⅷ，再用稀释液 进行10倍和20倍或40倍稀释，置冰浴待用。
D.样品的检测：
⑴取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml，置37℃水浴保温一定时间（一般4min），加入凝 血因子Ⅷ缺乏血浆0.1ml、不同稀释度的人凝血因子Ⅷ标准溶液0.1ml，混匀，置37℃水浴 保温一定时间（一般5min），加已预热至37℃0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。 将标准溶液人凝血因子Ⅷ效价（IU/ml）的对数对其相应的凝固时间（秒）的对数进行直线 回归处理，求出直线回归方程，回归的线性曲线如图2所示。
⑵取激活的部分凝血活酶试剂0.1ml，置37℃水浴保温一定时间（一般4min），加入凝 血因子Ⅷ缺乏血浆0.1ml、待测样品溶液0.1ml，混匀，置37℃水浴保温一定时间（一般5min）， 加已预热至37℃0.05mol/L氯化钙溶液0.1ml，记录凝固时间。
⑶计算待测样品溶液人凝血因子Ⅷ效价，再乘以稀释倍数，即为待测样品人凝血因子 Ⅷ效价（IU/ml）。
表1不同添加量的VWF对八因子活性的影响
检测结果见表1，检测结果显示在不同添加VWF浓度的培养中，细胞生长密度基本一 致，相互误差不超过15%，但八因子活性却因为VWF的添加得到了100-300%的提高。说 明外源VWF的添加大大提高了重组人凝血八因子的表达。而且，我们也发现VWF的添加 量在5IU时（即VWF与八因子活性比为2:1时），效果最为明显。优化的VWF添加浓度还 需要依据不同细胞密度，收获节奏等进行优化。
实施例二
1）表达人凝血八因子的细胞株的构建
表达人凝血八因子的细胞株的制备方法同实施例1。
2）八因子表达细胞扩种培养
以1×105cells/ml接种三角摇瓶，37℃无血清培养约4天后细胞密度达到1～ 2×106cells/ml；以1：3传代比例传代，37℃继续摇瓶培养至细胞密度达到1～2×106cells/ml， 获得种子液；摇瓶转速为150转/分钟。
3）八因子表达细胞反应器培养
以10%接种量在细胞反应器的无血清培养基中接种种子液后，上罐培养至细胞密度约 2×106cells/ml，然后对细胞液进行补料培养；补料培养阶段，通过八因子活性分析方法检测 不同培养时间的细胞培养液中八因子的活性，按照VWF与FVIII的活性比为3:1的比例向 细胞培养液中加入VWF（VWF的制备方法和活性检测同实施例1）；并且补料培养阶段控 制细胞液溶氧40%，pH7.2，搅拌转速90转/分钟，培养温度37℃，根据细胞生长密度和葡 萄糖消耗情况，葡萄糖浓度维持在1g/L，逐渐补料。补料培养10天至细胞密度达到1～2×10 7cells/ml，获得细胞原液，作为实验组；并且每天细胞台盼兰染色计数活细胞数应达到95% 以上。
4）对细胞原液进行蛋白离心、过滤、纯化处理，获得纯化的凝血八因子。
人凝血八因子蛋白活性分析方法见实施例一，采用人凝血因子VIII测定法（一期法）， 可参加中国药典三部附录X N人凝血因子VIII测定法。
实验过程设置对照组，对照组的培养基与实验组一致，只是对照组的无血清细胞培养 液中不添加VWF。对照实验在反应器中的细胞达到5.0×106cells/ml时开始进行。此时时间 以0小时计，每天定时取样分析，连续分析4天。所得的实验结果如下，
表2八因子活性随时间变化的影响
由表2可知，当补料培养阶段控制VWF与八因子的活性比为3:1时，添加VWF的实 验组的八因子随培养时间的延长八因子活性明显增强，并且各时间点的分析结果显示与未 添加VWF的对照组相比，VWF的加入能显著增强八因子的活性，使八因子得到高效表达。 通过本发明方法获得的重组人凝血八因子的表达量最高可达10~20国际单位/天/106细胞。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应 当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出 若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更 动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术 对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范 围内。