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1、(10)申请公布号 CN 102747044 A (43)申请公布日 2012.10.24 CN 102747044 A *CN102747044A* (21)申请号 201210257793.6 (22)申请日 2012.07.24 C12N 5/20(2006.01) C12N 15/06(2006.01) C07K 16/08(2006.01) G01N 33/577(2006.01) (71)申请人 郑州后羿制药有限公司 地址 451162 河南省郑州市郑州航空港区新 港大道东侧 (72)发明人 吴红云 哈斯通拉嘎 王卫芳 孙芳 (74)专利代理机构 郑州睿信知识产权代理有限 公司 4。
2、1119 代理人 牛爱周 (54) 发明名称 一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系及其 制备方法和一种单克隆抗体及其应用 (57) 摘要 本发明涉及一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤 细胞系及其制备方法和一种单克隆抗体及其应 用， 其中抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系具体 由以下方法获得 ：（1） 用 PRV 制得抗原免疫 BALB/ c 小鼠 ；（2） 用免疫小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细 胞融合 ；（3） 经筛选获得分泌抗PRV单克隆抗体的 杂交瘤细胞。 本发明采用Sepharose4FF层析柱纯 化得到了高纯度的 PR 抗原， 保证后续阳性克隆的 筛选和抗体的产生， 确立了间接 ELISA 法。
3、快速测 定单抗的产生与效价， 通过接种 BALB/c 雌性小鼠 腹腔获取了大量 PRV 单抗， 该抗体是针对 PR 病原 的单一抗体， 具有特异性强、 纯度高、 均一性好等 优点， 可用于 PR 的诊断和治疗， 同时为其他类型 单抗的制备提供了一定的技术借鉴。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系， 其特征在于 ： 所用细胞系为 HC2 和 HC2A 株， 具体由以下方法获得 ：（1） 用 P。
4、RV 制得抗原免疫 BALB/c 小鼠 ；（2） 用免疫小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合 ；（3） 经筛选获得分泌抗 PRV 单克隆抗体的杂交瘤细胞。 2.一种如权利要求1所述的抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系的制备方法,其特征在 于 ： 包括步骤 ：（1） 用 PRV 制得抗原免疫 BALB/c 小鼠 ；（2） 用免疫小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓 瘤细胞融合 ；（3） 经筛选获得分泌抗 PRV 单克隆抗体的杂交瘤细胞。 3. 根据权利要求 2 所述的抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系的制备方法， 其特征在 于 ： 步骤 （1） 所用 PRV 用 BHK-13 细胞增殖， 采用超滤的办法进。
5、行浓缩， 采用 Sepharose 层析 柱对抗原纯化， 复合 ELISA 检测效价的可作为 PRV 单抗制备免疫原。 4. 一种如权利要求 1 所述抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系分泌的抗猪伪狂犬病病 毒单克隆抗体。 5. 根据权利要求 2 所述的抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系的制备方法， 其特征在 于 ： 小鼠淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合用 450g/L 的 PEG4000, 融合后的细胞用 HAT 选择性培 养液筛选。 6. 一种如权利要求 4 所述的单克隆抗体在用于 PRV 的鉴别方面的应用。 权 利 要 求 书 CN 102747044 A 2 1/6 页 3 一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤。
6、细胞系及其制备方法和一 种单克隆抗体及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术-单克隆抗体领域,本发明涉及一种抗猪伪狂犬病病毒的杂 交瘤细胞系及其制备方法 ； 此外， 本发明还涉及该单克隆抗体的制备及其应用。 背景技术 0002 猪伪狂犬病 (Pseudorabies， PR) 是由疱疹病毒科、 a- 疱疹病毒亚科的伪狂犬病病 毒 (Pseudorabies Virus,PRV) 引起的急性传染病， 该病毒抵抗力较强， 病毒在 pH4 9 之 间保持稳定。保存在 50% 甘油盐水中的病料 , 在 0 6下经 154 天后 , 感染力仅轻度 下降 , 保存到 3 年仍具有感染力。 。在磷酸。
7、盐缓冲液和葡萄糖盐水中 10 天以上仍具有感染 性。在腐败条件下 , 病料中的病毒经 11 天失去感染力。用 0.5石炭酸处理 32 天后仍具 有感染性， 对乙醚、 氯仿等脂溶剂以及福尔马林和紫外线照射敏感。可致妊娠母猪流产、 产 死胎及胎儿干尸化。 对初生子猪则引起运动失调、 麻痹等神经症状， 病死率100%。 成年猪多 呈隐性感染， 但可引起呼吸道症状。本病一年四季都可发生， 病猪、 带毒猪及带毒鼠类是本 病的主要传染源， 病毒主要从病猪的鼻分泌物、 唾液、 乳汁和尿中排出， 有的带毒猪可持续 排毒 1 年。 0003 猪伪狂犬病最早在 1813 年发生于美国 ,1910 年证实为病毒病。。
8、目前已查明 , 本 病遍布世界各地 , 据不完全统计 , 已有 44 个国家发生 , 且疫情仍在不断扩大 , 多数动物 呈致死性感染 , 极少康复 , 猪感染本病后出现急性或亚急性临床症状 , 其症状与病毒的毒 力强弱和猪只年龄大小有关。在我国 ,1948 年从猫体中分离出伪狂犬病毒 , 此后有关于 猪、 牛、 羊、 犬、 猫、 水貂和进口狐狸等动物感染的报道 , 并陆续分离出多株伪狂犬病毒。本 病多呈地方流行 , 也有零星散发。近几年来 , 随着诊断方法的不断建立和诊断技术的不断 提高 , 病例报道数上升 , 甚至断奶仔猪出现奇痒症状 , 表明伪狂犬病在流行过程中有毒力 增强的迹象,它所引起。
9、的经济损失仅次于口蹄疫和猪瘟,每年由该病造成的经济损失可达 几十亿美元。 0004 猪伪狂犬病目前无特效治疗药物， 对感染发病猪可注射猪伪狂犬病高免血清， 它 对断奶子猪有明显疗效， 但是常规高免血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其 他蛋白质成分， 使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦， 而针对单一抗原制备而成的 单克隆抗体能提高免疫学检测和临床治疗的特异性和精确性,在兽医界,单克隆抗体试剂 盒已成为很多动物疫病等诊断和检疫的重要工具。 0005 单克隆抗体指来自一个淋巴细胞的单克隆杂交瘤细胞株所分泌的、 针对同一抗原 决定簇的抗体。基本的过程包括 ： 给小鼠注射一种抗原， 它可以被。
10、免疫系统识别， 从而诱导 小鼠的淋巴细胞产生相应抗体 ； 然后在培养基中融合小鼠的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞， 产生杂交瘤细胞， 经过筛选分离出单个杂交瘤细胞 ； 再使单个杂交瘤细胞扩增， 最后分离、 纯化抗体。1975 年， Kohler 和 Milstein 创立了杂交瘤技术制备单克隆抗体。与常规的血 清抗体的性质相比， 单抗的纯度更高， 特异性更好， 因而在实验室诊断方面有更高的应用价 说 明 书 CN 102747044 A 3 2/6 页 4 值。从 20 世纪 80 年代至今， 单抗研制一直是兽医界研究的一个热门课题， 研制成功的单抗 所针对的抗原来源和种类己覆盖了大多数常见传染病，。
11、 尤其是在病毒方面， 单抗在病毒抗 原结构的定位、 中和表位分析、 免疫学诊断和抗病毒治疗方面已得到或正在进行广泛的应 用。 0006 李富强等人在 中国兽医杂志 2000 年 ( 第 26 卷 ) 第 10 期第 8-10 页发表了 分 泌抗猪伪狂犬病病毒 ( 北京株 ) 单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立 ， 报道了用纯化的猪伪 狂犬病病毒免疫 Balb/c 小鼠， 取脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合， 经间接 ELISA 筛选， 3 次 有限稀释法克隆， 获得了 2 株能稳定分泌抗伪狂犬病病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株 1H7 和 3B5。经鉴定 1H7 和 3B5 均为 IgG1 亚类、 K。
12、appa 型轻链， 细胞培养液上清及腹水效价分别为 1:1024、 1:1024 和 1:108、 1:107 ； 1H7、 3B5 单克隆抗体不与猪繁殖 - 呼吸综合征病毒、 猪瘟 病毒、 猪细小病毒发生交叉反应， 显示良好的特异性。 0007 黄红亮等人在 中国兽医学报 2004 年 5 月第 24 卷第 3 期第 243-245 页发表文章 抗伪狂犬病病毒gG蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 ， 报道了以大肠杆菌表达的猪伪狂犬病 病毒 (PRV)gG 蛋白为抗原， 免疫 BALB/c 小鼠， 经细胞融合、 克隆后， 获得了 IF6、 2B9 两株稳 定分泌抗伪狂犬病病毒 gG 蛋白单克隆抗体的。
13、杂交瘤细胞。经间接 ELISA 鉴定， 1F6、 2B9 分 别属于 IgGz、 IgG 亚类， 效价高。其与猪伪狂犬病病毒 Ea 株感染细胞的间接免疫荧光试验 结果表明， 1F6、 2B9 确实为伪狂犬病病毒 gG 蛋白的单抗， 所得单抗与牛传染性鼻气管炎病 毒 (IBRV)、 猪细小病毒 (PPV)、 猪繁殖与呼吸道综合征病毒 (PRRSV) 之间无交叉反应。 0008 郭丽静在其硕士毕业论文 猪伪狂犬病毒 gD 和 gE 基因的原核表达及单克隆抗体 的研制 中记述了分离、 鉴定猪伪狂犬病病毒 (JS 株 ) 并探索了猪体内病毒核酸的分布规 律 ； 利用大肠杆菌表达系统表达了PRVgD和g。
14、E蛋白 ； 并研制出针对PRV的特异性好、 效价高 的单克隆抗体， 为建立特异性强、 敏感性高、 简便、 快速的 PRV 诊断方法提供了条件。 0009 吕蔚在其硕士毕业论文 伪狂犬病毒闽 A 株单克隆抗体的制备及初步鉴定 中记 述了伪狂犬病毒闽A株单克隆抗体的制备过程。 其中， 用PK-15细胞培养的伪狂犬病毒闽A 株 (PRV-FA) 经差速离心和蔗糖密度梯度离心， 纯化抗原 ； 同时制备伪狂犬病毒细胞培养物 和鸡胚培养物， 用伪狂犬鸡胚培养物作为免疫原来免疫 BALB/c 小鼠， 而用纯度更高的伪狂 犬病毒的细胞培养物作为间接 ELISA 的包被抗原建立间接 ELISA， 用来筛选融合后。
15、的杂交 瘤细胞， 尽可能的避免非特异性蛋白对筛选的干扰， 降低假阳性的几率， 提高阳性株筛选的 效率和准确性。取免疫 BALB/c 小鼠的脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合应用间接 ELISA 筛 选， 经过 3 次有限稀释法克隆， 获得了两株能稳定分泌抗伪狂犬病毒蛋白的单克隆抗体杂 交瘤细胞株， 命名为 4G9E9， 1H9C9， 随后对这两株单克隆抗体杂交瘤细胞株进行鉴定， 经鉴 定这两株杂交瘤细胞株均为 IgG1 亚类， 4G9E9 和 1H9C9 杂交瘤细胞培养上清及小鼠腹水单 克隆抗体的 ELISA 效价分别为 1:6400 和 1:12800 以及 1:25600 和 1:102。
16、400。两株单克隆 抗体与猪繁殖呼吸综合征病毒、 猪瘟病毒、 乙脑病毒、 细小病毒均不发生交叉反应， 显示了 良好的特异性。连续培养 15 代， 2 株杂交瘤细胞株仍能稳定分泌抗体且效价不变。腹水经 硫酸铵沉淀法处理后， 测得纯化后其蛋白含量为 2.412mg/mL。这两株单克隆抗体杂交瘤细 胞株的获得为下一步建立针对 PRV 的快速诊断方法的建立奠定基础。 0010 而以上常规 PRV 单抗制备多用原核表达的重组蛋白或培养的全病毒作为免疫原 , 但是重组蛋白存在复性困难 , 缺乏空间构象表位的缺点 , 全病毒存在不易纯化的缺点。常 说 明 书 CN 102747044 A 4 3/6 页 5。
17、 规全病毒工业化纯化多用凝胶过滤纯化方法 , 此法不能完全去除来源病毒培养过程中的 血清蛋白和细胞宿主蛋白,如需获得进一步纯化的病毒则需进行密度梯度离心等处理,尽 管如此 , 如在病毒样品中混有其它物理性质相似的抗原 , 则仍不能将其去除。 发明内容 0011 本发明的目的之一是提供一种抗猪伪狂犬病的杂交瘤细胞系， 该单克隆抗体可特 异性的与 PRV 结合， 能准确快速诊断 PR。 0012 本发明的目的之二是提供一种抗猪伪狂犬病的杂交瘤细胞系的制备方法。 0013 本发明的目的之三是提供一种单克隆抗体及其在定性检测 PR 中的应用。 0014 为了实现上述目的， 本发明技术方案采用了一种抗猪。
18、伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞 系， 具体由以下方法获得 ：（1） 用 PRV 制得抗原免疫 BALB/c 小鼠 ；（2） 用免疫小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合 ；（3） 经筛选获得分泌抗 PRV 单克隆抗体的杂交瘤细胞。 0015 还包括 ： 阳性克隆的筛选 ； 阳性克隆的稳定化培养 ； 单克隆抗体腹水的制备和纯 化及单抗的检测。 0016 本发明的技术方案还采用了一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系的制备方法 , 包括步骤 ：（1） 用 PRV 制得抗原免疫 BALB/c 小鼠 ；（2） 用免疫小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤 细胞融合 ；（3） 经筛选获得分泌抗 PRV 单克隆抗体的杂。
19、交瘤细胞。 0017 步骤 （1） 所用 PRV 用 BHK-13 细胞增殖， 采用超滤的办法进行浓缩， 采用 Sepharose 层析柱对抗原纯化， 复合 ELISA 检测效价的可作为 PRV 单抗制备免疫原。 0018 另外， 本发明的技术方案还采用了一种抗猪伪狂犬病病毒的杂交瘤细胞系分泌的 抗猪伪狂犬病病毒单克隆抗体。 0019 小鼠淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合用 450g/L 的 PEG4000, 融合后的细胞用 HAT 选择 性培养液筛选。 0020 阳性克隆的稳定化培养采用有限稀释法， 用荧光显微镜观察。 0021 本发明还提供了一种单克隆抗体在用于 PRV 的鉴别方面的应用。 002。
20、2 本发明采用 PRV 为免疫原， 免疫 8-12 周龄 BALB/c 雌性小鼠， 取免疫小鼠脾细胞和 SP2/0 进行细胞融合 , 再经药物筛选和亚克隆筛等步骤选出能稳定分泌抗猪伪狂犬病抗体 的杂交瘤细胞株， 经间接 ELISA 法和间接免疫荧光法鉴定 , 证实所分泌的单克隆抗体能特 异结合 PR。其中， 本实验所用免疫小鼠脾细胞和 SP2/0 均为实本验室保存， BALB/c 雌性小 鼠购自于河南省食品药品检验所。 0023 本发明的提供上述单克隆的制备方法包括以下步骤 ： 0024 1） 制备较高效价的 PR 为免疫原 ； 0025 2） 用 PR 免疫 8-12 周龄 BALB/c 雌。
21、性小鼠， 取其脾脏细胞， 通过体外与小鼠骨髓瘤 细胞融合 ； 0026 3） 用间接免疫荧光法筛选阳性克隆 ； 0027 4） 用有限稀释法亚克隆阳性杂交瘤细胞得到稳定分泌抗猪伪狂犬病单克隆抗体 的杂交瘤细胞 ； 0028 5） 单克隆抗体腹水的制备和纯化 0029 本试验用 CNB r 活化的 Saphrose4FF 和 RV 单抗制成反相亲和层析柱进行 RV 抗原 说 明 书 CN 102747044 A 5 4/6 页 6 纯化 , 由于 RV 单抗高度的特异性和亲和性 , 可纯化出高纯度的 RV 抗原。 0030 本发明采用 Sepharose4FF 层析柱纯化得到了高纯度的 PR 抗。
22、原， 保证后续阳性克 隆的筛选和抗体的产生， 确立了间接 ELISA 法快速测定单抗的产生与效价， 通过接种 BALB/ c 雌性小鼠腹腔获取了大量 PRV 单抗， 该抗体是针对 PR 病原的单一抗体， 具有特异性强、 纯 度高、 均一性好等优点， 可用于 PR 的诊断和治疗， 同时为其他类型单抗的制备提供了一定 的技术借鉴。 附图说明 0031 图 1 是间接免疫荧光试验结果 ； A: 单抗 HC2 与 PRV 感染的 BHK-13 细胞 ； B: 单抗 HC2A 与 PRV 感染的 BHK-13 细胞 ； C: 正常的 BHK-13 细胞。 具体实施方式 0032 下面结合具体实施例对本发。
23、明做具体的说明。 0033 本发明所用病原菌、 细胞、 实验动物、 生化试剂有 ： PRVYA 株、 HCV、 PPV、 SE、 PRRSV 由 郑州市畜牧局分离、 鉴定并保存 ； NP 和骨髓瘤细胞 SP2/0 由实验室提供 ； BALB/C 小鼠购自 河南农业大学牧医工程学院动物房 ； HAT 选择性培养基、 弗氏完全佐剂、 弗氏不完全佐剂、 FITC 标记的山羊抗小鼠抗体、 购自 Sigma 公司 ； 小牛血清购自 GIBCO 公司 ； BCA 蛋白定量试 剂盒购于 H iTrap Protein G HP ； 其他生物试剂均购自于 TaKaRa 公司。 0034 1. 制备较高效价的 。
24、PR 为免疫原 0035 伪狂犬病毒悬液接种到已长成单层的 BHK-13 细胞上 ,35培养 5 6d 后 , 每 隔 3d 连续收取培养液上清 ( 病毒悬液 )3 次。将收集的病毒悬液浓缩 40 倍 , 并加入 终浓度为 1/3000 的甲醛灭活病毒。将灭活的病毒悬液离心 30m in 去沉淀 , 上清通过 Sepharose4FF 层析柱进行纯化。具体纯化方法如下 ： 选择 BPG200/750 的层析柱按常规方 法活化 Sephrose4FF 粉 ； 洗涤 , 平衡后 , 加入纯化单抗室温偶联 3h; 洗涤 , 装柱。平衡缓 冲液平衡柱子后开始循环上样 , 样品体积 50mL, 上样 1。
25、h 后平衡缓冲液洗涤柱子 , 收集峰 值时流出的杂蛋白。甘氨酸缓冲液进行洗脱 , 峰值时流出液用含中和缓冲液的管接收。洗 脱完毕 , 平衡缓冲液平衡柱子 , 层析柱凝胶存于 20% 的乙醇、 0.02%NaN3 中 ,4保存。洗 脱液透析浓缩后 , 用 BCA 蛋白定量试剂盒测定病毒蛋白含量 , 经单克隆抗体的间接 ELISA 检测及 SDS PAGE 凝胶电泳鉴定其纯度。 0036 2. 免疫 BALB/c 小鼠 0037 用50ul PR自制抗原溶于100ul PBS， 与100ul完全弗氏佐剂混匀， 皮下注射小鼠。 之后每隔 3 周， 用 25ug PR 抗原溶于 100ul PBS， 。
26、与 100ul 不完全弗氏佐剂混匀， 皮下注射。 作 4 次增强免疫后， 隔 3 周进行抗原冲击 ： 25ug 抗原溶于 150ul PBS， 腹腔注射。3d 后， 取 脾细胞。 0038 3. 用免疫小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合 0039 将免疫小鼠的脾细胞与 SP2 骨髓瘤细胞同 37预温的 1ml450g/L 的 PEG4000 融 合 , 融合后的细胞用 RPMI-1640 不完全培养液 ( 含体积分数为 20% 的小牛血清和体积分数 为 1% 的选择培养基 HAT) 重悬后接种于加有小鼠腹腔巨噬细胞饲养细胞的 96 孔板内 , 在 HAT 选择性培养液中培养 , 观察杂交。
27、瘤细胞生长情况， 待其长至孔底面积 1/10 以上时吸出 说 明 书 CN 102747044 A 6 5/6 页 7 上清供抗体检测。 0040 4. 间接 ELISA 筛选阳性克隆 0041 将 FR 按照 1107TCID50 的病毒量接种于 BHK-21 细胞 , 未接毒的 BHK-21 细胞作 为阴性对照 , 培养 10h 后 , 用 37mg/L 多聚甲醛固定 10min, 充分洗涤后 , 加入 NH4Cl 作用 10min, 充分洗涤 , 吸干残液 ; 加入单抗 37作用 1h, 充分洗涤 ;FITC 标记的山羊抗小鼠 抗体作为二抗作用 1h 后 , 充分洗涤 , 用荧光显微镜观。
28、察信号荧光。在荧光显微镜下可以 观察到 PRV 感染的 BHK-13 细胞的表面发出绿色荧光 , 而正常未被感染的 BHK-13 细胞无反 应， 不呈现任何颜色 , 表明单抗腹水能结合 PRV 感染的细胞 , 而对未感染 PRV 的细胞无反 应。 0042 5. 阳性杂交瘤细胞克隆 0043 通过间接 ELISA 法检测为阳性的融合细胞经过三次克隆， 获得两株分泌抗 PRV 杂 交瘤细胞， 分别命名为 HC2 和 HC2A。用培养液吹打起这两个阳性培养孔的杂交瘤细胞后 , 取 100 个左右的杂交瘤细胞加入 10mL 细胞培养液中 , 混合均匀后 , 滴加到铺有饲养细胞 的 96 孔板内 , 。
29、每孔 100uL。选取只有一个杂交瘤细胞的培养孔 , 待杂交瘤细胞长满该孔 底 2/3 以上时 , 取其上清液用间接 ELISA 检测是否有目的单克隆抗体 （由小鼠脾细胞和骨 髓瘤细胞融合的杂交瘤细胞分泌的仅能与 PRV 抗原特异结合的抗体） 存在。 0044 6. 单克隆抗体腹水的制备 0045 对 10 周龄左右的 BALB/c 雌性小鼠腹腔注射降脂烷 ,0.5mL/ 只 , 一周后腹腔接种 1106个生长良好的杂交瘤细胞 , 约 10d 后 , 小鼠腹腔明显增大时 , 采集腹水 , 离心过滤 后用 Sepharose 柱纯化 , 经低速超膜离心浓缩后 , 加 500mL/L 甘油分装 ,。
30、-70保存备用。 0046 本发明是建立间接 ELISA 筛选阳性克隆的方法为 ： 0047 取纯化病毒抗原稀释成 0.5、 1、 2、 5、 10、 15、 20、 25ug/ml， 与不同稀释度阳性血清、 阴性血清 ( 健康小鼠 ) 方阵滴定， 羊抗鼠 HRP 标记二抗暂以 1 10000 稀释， 确定出抗原包 被浓度与血清稀释倍数。然后确定出酶标二抗稀释倍数。筛选时同一孔内杂交瘤细胞培 养上清 100 微升加于 PRV 包被板， 100 微升加入正常细胞培养物包被板孔内 ( 包被浓度同 PRV)。当细胞上清 OD 值与阴性对照比值大于 2 则该孔判为阳性。 0048 7. 结果评定 00。
31、49 1 间接免疫荧光试验结果 0050 在加入 HC2、 HC2A 单抗的 PRV 感染的 BHK-13 细胞中均可见特异性荧光 , 而正常 BHK-13 细胞无特异性荧光 ( 见图 1)。表明这 2 株单抗均能够与 PR 特异性结合。 0051 2 单克隆抗体效价测定 0052 将已建株的 HC2/HC2A 杂交瘤细胞扩大培养 , 待细胞近乎长满时停止换液 , 继续 培养直至大部分细胞濒临死亡 , 吸取培养液 ,1000r/min 离心 10min, 收集上清 , 以健康 小鼠血清作阴性对照测 ELISA 效价 , 效价测定 HC2、 HC2A 杂交瘤细胞培养液上清效价均为 1 1024;。
32、 腹水效价分别为 1 108 腹水效价明显高于上清。 0053 3 单克隆抗体特异性鉴定 0054 应用间接 ELISA 测定单克隆抗体与猪瘟病毒 (HCV)、 猪细小病毒 (PPV)、 猪丹毒 （SE） 、 猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 的交叉反应。各病毒包被浓度同 PRV,HC2、 HC2A 均 以培养液上清与抗原作用 , 健鼠血清作为阴性对照。 说 明 书 CN 102747044 A 7 6/6 页 8 0055 表 1 抗 PRV 单克隆抗体特异性鉴定 0056 0057 经鉴定2个阳性孔内杂交瘤细胞,有限稀释法克隆后,所得的HC2、 HC2A具有稳定 分泌高效价抗体的能力。
33、 , 它们产生的抗体单一 , 不与 HCV、 PPV、 SE、 PRRSV 产生交叉反应 , 具有良好的特异性。 0058 单克隆抗体应用 0059 1） 鉴于本发明单抗特异性强、 灵敏度高的特点可以作为实验室诊断 PR 病的重要 工具， 为该病的早期预防做好准备， 同时对于已感染的病猪起到治疗作用 ； 0060 2） 可以对筛选出来的 HC2、 HC2A 阳性融合细胞株分别进行标准化生产， 短时期内 能得到大量的单抗 ； 0061 3） 通过制得的 PRV 单抗可以纯化对应 PRV 抗原， 得到的高纯度抗原又可以精确检 测对应抗体效价。 说 明 书 CN 102747044 A 8 1/1 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102747044 A 9 。