用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102719558 A (43)申请公布日 2012.10.10 CN 102719558 A *CN102719558A* (21)申请号 201210179707.4 (22)申请日 2012.05.30 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (71)申请人 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 地址 310023 浙江省杭州市西湖区紫荆花路 38 号古荡科技园区 20 号楼 (72)发明人 陈亦磊 方国伟 徐建成 王淑一 (74)专利代理机构 浙江杭州金通专利事务所有 限公司 33100 代。

2、理人 黎双华 徐关寿 (54) 发明名称 用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒 (57) 摘要 本发明公开了用于检测丙肝病毒基因型的试 剂盒， 其特征在于它包括 ： (1)RNA 提取试剂、 逆转 录试剂、 实时荧光定量 PCR 扩增反应试剂 ； (2) 用 于扩增样本 cDNA 的 4 对引物及相应的探针。本 发明的用于检测丙肝病毒 （HCV）基因型的试剂 盒， 通过对病毒 RNA 抽提， 逆转录和实时荧光定量 PCR， 可检测出我国常见的 1、 2、 3、 6 型 HCV 病毒。 用该试剂盒所得的结果具有高准确性， 比 Sanger 测序法更加快速、 简便、 灵敏、 特异， 且降低了污染 风险和。

3、成本。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 序列表 4 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 序列表 4 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 ： (1) RNA 提取试剂、 逆转录试剂、 实时荧光定量 PCR 扩增反应试剂 ； (2) 用于扩增样本 cDNA 的 4 对引物及相应的探针 ： 其中， 检测 1 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ1 ： TTCACGGAGGCTATGACYAGG ； SEQ2 ： GGGTCA。

4、CGGGTGAGATAGTASAC ； SEQ3 ： FAM- TCATGCTCCTCCAAYGTGTCRGTCG-TAMRA ； 检测 2 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ4 ： CTCGCTGACTGAGAGACTTTACG ； SEQ5 ： ATGGTGTTCCCCATGCTAGTAGT ； SEQ6 ： FAM- ACAGGCGTTGCCGCGCCA-TAMRA ； 检测 3 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ7 ： TCACTCTGCCCGRTCGAART ； SEQ8 ： ACCTCGTTCTTCGCCATGAT ； SEQ9 ： FAM- AGGACGTTCGCTC。

5、CTTGTCCAGCA-TAMRA ； 检测 6 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ10 ： CCHATGGGCTTYTCTTACGACAC ； SEQ11 ： GGGGCYGAGTAYCTGGTCATGGC ； SEQ12 ： FAM-TGACATGTTGGTSTGCGGAGAYGA-TAMARA。 2. 如权利要求 1 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述 RNA 提取试剂包括 Trizol， 氯仿， 异 丙醇， 无水乙醇和DEPC水 ； 所述逆转录试剂包括5RT-Buffer， 100uM Primer Mix， 100U/ul ReverTra Ace逆转录酶和DEPC水 ； 所述。

6、实时荧光定量PCR试剂包括qPCR Mix， 50ROX， 扩 增引物及探针和灭菌水。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒的使用方法包括以下步 骤 ： (1) 用 RNA 提取试剂提取血清待检样本 RNA ； (2) 用逆转录试剂将步骤 (1) 中得到的 RNA 进行反转录为 cDNA ； (3) 使用 4 对引物及相应探针 （SEQ1-SEQ12） 对步骤 (2) 得到的 cDNA 进行实时荧光 定量 PCR 检测 ； PCR 检测体系为 25ul， 其中包括 12.5ul qPCR Mix， 10 uM 探针 0.4ul， 10uM 正、 反向引物各 0。

7、.8ul， 正向引物为 SEQ1、 SEQ4、 SEQ7、 SEQ10， 反向引物为 SEQ2、 SEQ5、 SEQ8、 SEQ11， 50ROX 0.5ul， cDNA 2ul， ddH2O 8ul ； 实时荧光定量 PCR 反应程序 ： 95 10min 预 变性 ； 95 15sec， 58 35sec， 39 个循环。 4. 如权利要求 3 所述的试剂盒， 其特征在于， 步骤 (1) 的具体抽取步骤如下 ： 向 200ul 血清标本加入 1ml Trizol， 混匀， 室温静止 5min ； 向步骤混合液中加入 200ul 氯仿， 混匀， 室温静止 5min， 4下 12000g 离心。

8、 15min ； 吸取上清液移至另一离心管， 加入等体积的异丙醇， 混匀， 室温静止 10min， 4下 12000g 离心 10min ； 弃上清， 加入 75% 乙醇 1ml， 4下 12000g 离心 5min ； 弃上清， 室温干燥 5min 后加入 30ul DEPC 水， -80保存备用。 权 利 要 求 书 CN 102719558 A 2 2/2 页 3 5.如权利要求3所述的试剂盒， 其特征在于， 步骤(2)的逆转录具体步骤如下 ： 向10ul RNA 中加入 1ul 100uM Primer Mix， 将混合液至于 65， 5min 后， 冰浴 2min ； 向上述混合 液。

9、加入 4ul 5RT-Buffer， 4ul DEPC 水， 1ul 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶， 混匀， 37 60min， 95 5min， 获得 cDNA -20备用。 6. 如权利要求 3 所述的试剂盒， 其特征在于， 步骤 (3) 实时荧光定量 PCR 检测方法中， 一例样本进行 4 个 PCR 反应， 即检测是否为 1、 2、 3、 6 基因型， 4 个实时荧光定量 PCR 体系均 一致。 权 利 要 求 书 CN 102719558 A 3 1/5 页 4 用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒 技术领域 0001 本发明属生命科学和生物技术领域， 特别是一种用于。

10、检测丙肝病毒基因型的试剂 盒。 背景技术 0002 丙型肝炎病毒 （Hepatitis C Virus， HCV） 属黄病毒科， 基因组全长9.5 Kb， 它是引 发慢性肝炎， 肝硬化和肝癌的主要病因之一， 是世界范围内亟待解决的公共卫生难题。 由于 HCV 的 RNA 聚合酶缺乏校正功能， 因而其基因组序列常表现出显著异源性和高度可变性， 且 已被分为 6 个主要基因型 （1-6） 和 70 多个亚型， 而 NS5B 是常用的 HCV 分型区域。此外， 国 内外研究发现 HCV 基因型不但存在地域分布差异性， 其不同基因型与肝病严重程度， 干扰 素应答也有一定相关性。因此， HCV 基因分型。

11、检测对研究丙型肝炎传播， 诊断， 后期治疗及 疫苗研制等均有重要意义。 0003 HCV 基因型具有明显的地域差异性。欧美以 1 型为主 ； 4 型多分布于印度、 中东地 区 ； 5型局限于南非 ； 我国主要以1型为主， 2型占次席， 此外某些地区3型也有报道， 而6型 主要流行于香港和澳门及南方边境地区， 总体来看 1、 2、 3、 6 型为我国常见的 HCV 基因型。 HCV 基因型的地区分布为流行病学研究提供了帮助。通过研究基因型分布可以跟踪到人群 中 HCV 爆发的来源， 种系分析和群体遗传学的联合应用也可估算出不同基因型的存在时间 和传播速度。 0004 HCV基因型与肝病严重程度，。

12、 干扰素应答的关系。 目前不少研究发现1型HCV病毒 与肝炎慢性化进程和严重的肝病有关， 国内相关研究表明 1 型在慢性肝炎， 肝硬化和肝癌 中占绝大多， 同时表现为谷丙转氨酶含量 （ALT） 血清含量升高， 提示肝细胞有损伤， 而 3 型 HCV 与肝脏脂肪化的关系较为密切。HCV 患者主要的治疗手段是用干扰素或者与利巴韦林 联合使用。大量的临床试验表明， HCV 基因型被认为在临床治疗方面影响最大。当利巴韦 林和干扰素联合治疗时， 1型患者的治疗效果没有2、 3型的效果好。 联合治疗24周后， 只有 少量的 1 型 患者对联合治疗有持续病毒学应答， 而 2、 3 型能达到 70%。治疗 4。

13、8 周后， 1 型 提高至 30%， 2、 3 型仍能保持约 70%。6 型的治疗效果没有 1， 3 型的明显。因此， 在联合治疗 前， 可先对患者进行 HCV 分型， 再进行相应的治疗， 获得最佳效果的同时也减轻患者的经济 负担。 0005 目前 HCV 分型有多种方法， 如 ： 血清学分型法、 核酸序列 Sanger 测序法、 型特异性 引物扩增分型、 型特异探针杂交分型法和限制性长度多态性分析法 （RFLP） 等。其中核酸序 列Sanger测序法是HCV分型检测的 “金标准” ， 但测序检测时间较长， 成本高， 存在样本交叉 污染的风险。通过基于 NS5B 区域设计的 4 对相关引物及探。

14、针进行 HCV 实时荧光定量 PCR 检测， 不仅可快速准确的检测我国常见的1、 2、 3、 6型HCV病毒， 同时简便的操作流程也降低 了污染风险， 为临床丙型肝炎病毒分型检测提供一种有效的方法。 发明内容 说 明 书 CN 102719558 A 4 2/5 页 5 0006 鉴于现有技术中 HCV 分型方法的不足， 本发明提供了一种实时荧光定量 PCR 检测 检测丙肝病毒 （HCV） 基因型的试剂盒， 可用于检测我国常见的 1、 2、 3、 6 型 HCV 病毒。 0007 用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒包括 ： (1) RNA 提取试剂、 逆转录试剂、 实时。

15、荧光定量 PCR 扩增反应试剂 ； (2) 用于扩增样本 cDNA 的 4 对引物及相应的探针 ： 其中， 检测 1 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ1 ： TTCACGGAGGCTATGACYAGG ； SEQ2 ： GGGTCACGGGTGAGATAGTASAC ； SEQ3 ： FAM- TCATGCTCCTCCAAYGTGTCRGTCG-TAMRA ； 检测 2 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ4 ： CTCGCTGACTGAGAGACTTTACG ； SEQ5 ： ATGGTGTTCCCCATGCTAGTAGT ； SEQ6 ： FAM- ACAGGCGTTGCCGC。

16、GCCA-TAMRA ； 检测 3 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ7 ： TCACTCTGCCCGRTCGAART ； SEQ8 ： ACCTCGTTCTTCGCCATGAT ； SEQ9 ： FAM- AGGACGTTCGCTCCTTGTCCAGCA-TAMRA ； 检测 6 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ10 ： CCHATGGGCTTYTCTTACGACAC ； SEQ11 ： GGGGCYGAGTAYCTGGTCATGGC ； SEQ12 ： FAM-TGACATGTTGGTSTGCGGAGAYGA-TAMARA。 0008 进一步地， 所述 RNA 提取试剂包括 。

17、Trizol， 氯仿， 异丙醇， 无水乙醇和 DEPC 水 ； 所 述逆转录试剂包括 5RT-Buffer， 100uM Primer Mix， 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶和 DEPC 水 ； 所述实时荧光定量 PCR 试剂包括 qPCR Mix， 50ROX， 扩增引物及探针和灭菌水。 0009 更进一步地， 所述试剂盒的使用方法包括以下步骤 ： (1) 用 RNA 提取试剂提取血清待检样本 RNA ； (2) 用逆转录试剂将步骤 (1) 中得到的 RNA 进行反转录为 cDNA ； (3) 使用 4 对引物及相应探针 （SEQ1-SEQ12） 对步骤 (2) 得到的。

18、 cDNA 进行实时荧光 定量 PCR 检测 ； PCR 检测体系为 25ul， 其中包括 12.5ul qPCR Mix， 10 uM 探针 0.4ul， 10uM 正、 反向引物各 0.8ul， 正向引物为 SEQ1、 SEQ4、 SEQ7、 SEQ10， 反向引物为 SEQ2、 SEQ5、 SEQ8、 SEQ11， 50ROX 0.5ul， cDNA 2ul， ddH2O 8ul ； 实时荧光定量 PCR 反应程序 ： 95 10min 预 变性 ； 95 15sec， 58 35sec， 39 个循环。 0010 进一步地， 步骤 (1) 的具体抽取步骤如下 ： 向 200ul 血清标。

19、本加入 1ml Trizol， 混匀， 室温静止 5min ； 向步骤混合液中加入 200ul 氯仿， 混匀， 室温静止 5min， 4下 12000g 离心 15min ； 吸取上清液移至另一离心管， 加入等体积的异丙醇， 混匀， 室温静止 10min， 4下 12000g 离心 10min ； 弃上清， 加入 75% 乙醇 1ml， 4下 12000g 离心 5min ； 弃上清， 室温干燥 5min 后加入 30ul DEPC 水， -80保存备用。 说 明 书 CN 102719558 A 5 3/5 页 6 0011 步骤 (2) 的逆转录具体步骤如下 ： 向 10ul RNA 中加。

20、入 1ul 100uM Primer Mix， 将 混合液至于 65， 5min 后， 冰浴 2min ； 向上述混合液加入 4ul 5RT-Buffer， 4ul DEPC 水， 1ul 100U/ul ReverTra Ace 逆转录酶， 混匀， 37 60min， 95 5min， 获得 cDNA -20备 用。 0012 步骤 (3) 实时荧光定量 PCR 检测方法中， 一例样本进行 4 个 PCR 反应， 即检测是否 为 1、 2、 3、 6 基因型， 4 个实时荧光定量 PCR 体系均一致。 0013 根据实时荧光定量 PCR 检测结果， 可以对血清样本中的 HCV 亚型进行鉴定。。

21、具体 方法为 ： 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品的最高点， 且阴性质控品无扩增 曲线 ； 样本的 4 个实时荧光定量 PCR 反应体系中， 如某个反应体系产生扩增曲线， 且 Ct 值 38， 则样本为该型的病毒， 无明显扩增曲线的表示样本不是该 4 类型别的病毒。 0014 有益效果 ： 本发明的用于检测丙肝病毒 （HCV） 基因型的试剂盒， 通过对病毒 RNA 抽 提， 逆转录和实时荧光定量 PCR， 可检测出我国常见的的 1、 2、 3、 6 型 HCV 病毒。用该试剂盒 所得的结果具有高准确性， 比 Sanger 测序法更加快速、 简便、 灵敏、 特异， 且降低了污染风 险和。

22、成本。 0015 附图说明 0016 图 1 是样本 A 实时荧光定量 PCR 检测结果。由图可知， 该样本只有 1 型反应体系 产生扩增曲线， 因此样本 A 为 1 型 HCV 病毒。 0017 图 2 是样本 B 实时荧光定量 PCR 检测结果。该样本只有 2 型反应体系产生扩增曲 线， 因此样本 B 为 2 型 HCV 病毒。 0018 图 3 是样本 C 实时荧光定量 PCR 检测结果。该样本只有 3 型反应体系产生扩增曲 线， 因此样本 B 为 3 型 HCV 病毒。 0019 图 4 是样本 D 实时荧光定量 PCR 检测结果。该样本只有 6 型反应体系产生扩增曲 线， 因此样本 。

23、B 为 6 型 HCV 病毒。 0020 图 58 是样本 A、 B、 C、 D 的测序图谱。目的是为验证图 14 的结果， 对上述 A、 B、 C、 D样本进行Sanger测序， 并将测序结果输入NCBI的Genotpying模块 （http:/www.ncbi. nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi） ， 最终发现测序分型结果与实时荧光 定量 PCR 检测结果一致。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应当注意的是， 实施例中未说明的常规 条件和方法， 通常按照所属领域实验人员常规采用方法 ： 譬如， 奥斯柏。

24、和金斯顿主编的 精 编分子生物学实验指南 第四版， 或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。 0022 实施例 1 用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒， 包括 ： (i) RNA 提取试剂 ： Trizol， 氯仿， 异丙醇， 无水乙醇， DEPC 水 ； (ii) 逆转录试剂 ： 5RT-Buffer， 100uM Primer Mix， 100U/ul ReverTra Ace 逆转录 酶， DEPC 水 ； 说 明 书 CN 102719558 A 6 4/5 页 7 (iii) 实时荧光定量 PCR 试剂 ： qPCR Mix， 50ROX， 用于扩增样本 cDNA 的 4 对引物及 相应的探。

25、针 （SEQ1-SEQ12） 10uM， 灭菌水， 其中 ： 检测 1 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ1 ： TTCACGGAGGCTATGACYAGG ； SEQ2 ： GGGTCACGGGTGAGATAGTASAC ； SEQ3 ： FAM- TCATGCTCCTCCAAYGTGTCRGTCG-TAMRA ； 检测 2 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ4 ： CTCGCTGACTGAGAGACTTTACG ； SEQ5 ： ATGGTGTTCCCCATGCTAGTAGT ； SEQ6 ： FAM- ACAGGCGTTGCCGCGCCA-TAMRA ； 检测 3 型 HCV。

26、 病毒的引物及探针 ： SEQ7 ： TCACTCTGCCCGRTCGAART ； SEQ8 ： ACCTCGTTCTTCGCCATGAT ； SEQ9 ： FAM- AGGACGTTCGCTCCTTGTCCAGCA-TAMRA ； 检测 6 型 HCV 病毒的引物及探针 ： SEQ10 ： CCHATGGGCTTYTCTTACGACAC ； SEQ11 ： GGGGCYGAGTAYCTGGTCATGGC ； SEQ12 ： FAM-TGACATGTTGGTSTGCGGAGAYGA-TAMARA。 0023 所述试剂盒的使用方法包括以下步骤 ： (1) 用 RNA 提取试剂提取血清待检样本 R。

27、NA ； (2) 用逆转录试剂将步骤 (1) 中得到的 RNA 进行反转录为 cDNA ； (3) 使用 4 对引物及相应探针 （SEQ1-SEQ12） 对步骤 (2) 得到的 cDNA 进行实时荧光 定量 PCR 检测 ； PCR 检测体系为 25ul， 其中包括 12.5ul qPCR Mix， 10 uM 探针 0.4ul， 10uM 正、 反向引物各 0.8ul， 正向引物为 SEQ1、 SEQ4、 SEQ7、 SEQ10， 反向引物为 SEQ2、 SEQ5、 SEQ8、 SEQ11， 50ROX 0.5ul， cDNA 2ul， ddH2O 8ul ； 实时荧光定量 PCR 反应程序。

28、 ： 95 10min 预 变性 ； 95 15sec， 58 35sec， 39 个循环。 0024 根据实时荧光定量 PCR 检测结果， 可以对血清样本中的 HCV 亚型进行鉴定。具体 方法为 ： 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品的最高点， 且阴性质控品无扩增 曲线 ； 样本的 4 个实时荧光定量 PCR 反应体系中， 如某个反应体系产生扩增曲线， 且 Ct 值 38， 则样本为该型的病毒， 无明显扩增曲线的表示样本不是该 4 类型别的病毒。 0025 本发明基于 NS5B 区域设计 4 对引物及相应的探针用于扩增样本 cDNA。通过几百 例临床受检样本用本试剂盒中的引物及探针 。

29、（SEQ1-SEQ12） 进行实时荧光定量 PCR， 发现其 具有较高的扩增稳定性、 特异性、 灵敏度 ； 同时使用 Sanger 测序法对相同的受检样本进行 测序， 结果两类方法的检测结果完全一致， 说明本试剂盒具有极高的检测准确性。 0026 实施例 2 ： 检测方法 1. 丙肝 HCV RNA 的抽取 1.1 向 200ul 血清标本加入 1ml Trizol， 混匀， 室温静止 5min ； 1.2 向步骤 1.1 混合液中加入 200ul 氯仿， 混匀， 室温静止 5min， 4下 12000g 离心 15min ； 说 明 书 CN 102719558 A 7 5/5 页 8 1.。

30、3 吸取上清液移至另一离心管， 加入等体积的异丙醇， 混匀， 室温静止 10min， 4下 12000g 离心 10min ； 1.4 弃上清， 加入 75% 乙醇 1ml， 4下 12000g 离心 5min ； 1.5 弃上清， 室温干燥 5min 后加入 30ul DEPC 水， -80保存备用。 0027 2. 将步骤 1 中的所得 RNA 用随机引物逆转录为 cDNA， 再使用 4 对引物及探针 （SEQ1-SEQ12） 对得到的 cDNA 进行实时荧光定量 PCR 检测。 0028 其中逆转录的具体方法 ： 向 10ul RNA 中加入 1ul 100uM Primer Mix， 。

31、将混合液至 于65， 5min后， 冰浴2min。 向上述混合液加入4ul 5*RT-Buffer， 4ul DEPC水， 1ul 100U/ ul ReverTra Ace 逆转录酶， 混匀， 37 60min， 95 5min， 获得 cDNA -20备用。 0029 其中实时荧光定量 PCR 检测的具体方法 ： 一例样本需进行 4 个反应， 即检测是否 为 1、 2、 3、 6 基因型。4 个实时荧光定量 PCR 体系均一致， 具体如下 ： 总体系为 25ul， 12.5ul qPCR Mix， 0.4ul 10uM 探针 （SEQ3、 SEQ6、 SEQ9） ， 10uM 正反向引物各。

32、 0.8ul（正向引物 ： SEQ1、 SEQ4、 SEQ7、 SEQ10 ； 反向引物 ： SEQ2、 SEQ5、 SEQ8、 SEQ11） ， 0.5ul 50*ROX， cDNA 2ul， ddH2O 8ul。 0030 实时荧光定量PCR反应程序 ： 95 10min 预变性 ； 95 15sec， 58 35sec， 39个 循环。 0031 3. 结果分析， 具体方法为 ： 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品的最 高点， 且阴性质控品无扩增曲线 ； 样本的 4 个实时荧光定量 PCR 反应体系中， 如某个反应体 系产生扩增曲线， 且Ct值38， 则样本为该型的病毒， 无明显。

33、扩增曲线的表示样本不是该4 类型别的病毒。 0032 图 1 是样本 A 实时荧光定量 PCR 检测结果。由图可知， 该样本只有 1 型反应体系 产生扩增曲线， 因此样本 A 为 1 型 HCV 病毒。 0033 图 2 是样本 B 实时荧光定量 PCR 检测结果。该样本只有 2 型反应体系产生扩增曲 线， 因此样本 B 为 2 型 HCV 病毒。 0034 图 3 是样本 C 实时荧光定量 PCR 检测结果。该样本只有 3 型反应体系产生扩增曲 线， 因此样本 B 为 3 型 HCV 病毒。 0035 图 4 是样本 D 实时荧光定量 PCR 检测结果。该样本只有 6 型反应体系产生扩增曲 。

34、线， 因此样本 B 为 6 型 HCV 病毒。 0036 图 58 是样本 A、 B、 C、 D 的测序图谱。目的是为验证图 14 的结果， 对上述 A、 B、 C、 D样本进行Sanger测序， 并将测序结果输入NCBI的Genotpying模块 （http:/www.ncbi. nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi） ， 最终发现测序分型结果与实时荧光 定量 PCR 检测结果一致。 说 明 书 CN 102719558 A 8 1/4 页 9 SEQUENCE LISTING 杭州艾迪康医学检验中心有限公司 用于检测丙肝病毒基因型的试剂盒。

35、 12 PatentIn version 3.3 1 21 DNA 人工序列 1 ttcacggagg ctatgacyag g 21 2 23 DNA 人工序列 2 gggtcacggg tgagatagta sac 23 3 25 DNA 人工序列 3 tcatgctcct ccaaygtgtc rgtcg 25 序 列 表 CN 102719558 A 9 2/4 页 10 4 23 DNA 人工序列 4 ctcgctgact gagagacttt acg 23 5 23 DNA 人工序列 5 atggtgttcc ccatgctagt agt 23 6 18 DNA 人工序列 6 ac。

36、aggcgttg ccgcgcca 18 7 20 DNA 人工序列 7 tcactctgcc cgrtcgaart 20 8 20 序 列 表 CN 102719558 A 10 3/4 页 11 DNA 人工序列 8 acctcgttct tcgccatgat 20 9 24 DNA 人工序列 9 aggacgttcg ctccttgtcc agca 24 10 23 DNA 人工序列 10 cchatgggct tytcttacga cac 23 11 23 DNA 人工序列 11 ggggcygagt ayctggtcat ggc 23 12 24 DNA 人工序列 序 列 表 CN 102719558 A 11 4/4 页 12 12 tgacatgttg gtstgcggag ayga 24 序 列 表 CN 102719558 A 12 1/4 页 13 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102719558 A 13 2/4 页 14 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102719558 A 14 3/4 页 15 图 5 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102719558 A 15 4/4 页 16 图 8 说 明 书 附 图 CN 102719558 A 16 。