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1、(10)授权公告号 CN 102747042 B (45)授权公告日 2013.04.17 CN 102747042 B *CN102747042B* (21)申请号 201210117612.X (22)申请日 2012.04.20 CCTCC NOC201016 2010.07.13 C12N 5/20(2006.01) C07K 16/14(2006.01) G01N 33/577(2006.01) C12R 1/91(2006.01) (73)专利权人 中国农业科学院油料作物研究所 地址 430062 湖北省武汉市武昌区徐东二路 2 号 (72)发明人 李培武 李鑫 张奇 丁小霞 张文。
2、 李冉 张兆威 (74)专利代理机构 湖北武汉永嘉专利代理有限 公司 42102 代理人 乔宇 CN 101993855 A,2011.03.30, 全文 . 江涛等 . 抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的制备 及特性 . 中国预防医学杂志 .2007, 第 8 卷 ( 第 1 期 ),16-19. Daohong Zhang et al.Production of ultrasensitive generic monoclonal antibodies against major aflatoxins using a modified two-step screening procedure. An。
3、alytica Chimica Acta .2009, 第 636 卷 63-69. (54) 发明名称 杂交瘤细胞株 10G4 及其产生的抗黄曲霉毒 素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体 (57) 摘要 本发明涉及杂交瘤细胞株 10G4 及其分泌产 生的抗黄曲霉毒素总量单克隆抗体。本发明提 供的杂交瘤细胞株 10G4（CCTCC NO.C201016） 可以用于制备抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量 单克隆抗体， 并用常规非竞争酶联免疫吸附分析 （ELISA）法测得 10G4 的鼠腹水抗体的效价可达 5.12105； 本发明提供的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、。
4、 G2 总量单克隆抗体可以一致性较好地识别黄 曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2， 对黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 的 50% 抑制浓度 IC50依次为 2.09ng/mL、 2.23ng/mL、 2.19ng/mL、 3.21ng/mL， 对黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 的交叉反应率范围为 65.2%-100% ； 可应用于定量测定黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总 量。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王婷 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利。
5、 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 1/1 页 2 1. 杂交瘤细胞株 10G4， 其特征在于 ： 它保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为 CCTCC NO. C201016。 2. 抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体， 其特征在于 ： 它由保藏编号为 CCTCC NO. C201016 的杂交瘤细胞株 10G4 分泌产生。 3. 根据权利要求 2 所述的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体在黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量测定中的应用。 4. 根据权利要求 2 所述抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 。
6、总量单克隆抗体的制备方法， 步骤 如下 ： 将获得的杂交瘤细胞株10G4注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠， 收集 该小鼠的腹水， 纯化即得抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体。 权 利 要 求 书 CN 102747042 B 2 1/5 页 3 杂交瘤细胞株 10G4 及其产生的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体 技术领域 0001 本发明涉及杂交瘤细胞株 10G4 及其产生的抗黄曲霉毒素总量单克隆抗体。 背景技术 0002 黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物， 是能引起人畜 各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉。
7、毒素品种较多， 目前被已发现 20 余种。黄曲霉毒素具 有污染广、 毒性强、 危害重等特点。因此， 全球至今至少有 70 个以上的国家制定了农产品及 食品中黄曲霉毒素限量标准， 很多国家更是制定了主要黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量的限 量标准。因此黄曲霉毒素总量分析方法显得尤为重要。 0003 现有黄曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、 精密仪器分析法和免疫学分析法。 其中薄层层析法是检测黄曲霉毒素最常用的检测方法， 其不需要特殊的仪器设备， 一般实 验室都可进行， 但试剂用量大、 操作繁琐、 其它组分干扰严重、 准确性差， 不能准确定量， 且 对实验人员和周围环境污染危害较大，。
8、 不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分 光光度法和高效液相色谱法， 其灵敏度高， 准确性好， 但仪器昂贵， 要求黄曲霉毒素样品纯 化程度高， 样品前处理过程繁琐， 耗时长， 对实验环境要求高， 难以实现快速检测。 近些年发 展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点， 具有特异性强、 灵敏度高、 样品前处理简单、 成本低、 对实验人员和周围环境的污染危害小、 适于现场批量检测等优点。 0004 免疫分析是利用抗原和抗体的特异性反应和抗体 （或抗原） 上标记物的生物、 物理 或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、 定量检测， 所以要研究建立针对黄曲霉毒素 总量分析方法的任何一种免疫学检测技。
9、术， 都必须先制得抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量 的抗体。事实上无论国内还是国际上研制黄曲霉毒素抗体的报道很多， 黄曲霉毒素通用抗 体也有报道， 甚至也有个别学者将黄曲霉通用抗体用来建立黄曲霉毒素总量分析方法。黄 曲霉毒素通用抗体主要强调抗体对各种黄曲霉毒素均可发生较强的特异性结合反应， 可被 用来分别建立每种黄曲霉毒素的免疫分析方法 ； 而黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量抗体则不 仅强调抗体对各种黄曲霉毒素均可发生较强的特异性结合反应， 而且还特别强调应用该抗 体建立的针对每种黄曲霉毒素的免疫分析方法的灵敏度一致性要强。 国内外现有报道的黄 曲霉毒素通用抗体通。
10、用性都是比较强的， 但针对每种黄曲霉毒素的分析灵敏度一致性却通 常都较差， 因此， 这些报道的黄曲霉毒素通用抗体并不适合用来建立黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量分析方法， 即使建立了黄曲霉毒素总量分析方法， 其定量分析的准确性也会大打折 扣。因此， 研制黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量抗体对实现黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量免 疫快速定量检测具有重要意义。 发明内容 0005 本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株 10G4 及其产生的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体。 说 明 书 CN 102747042 B 3 2/5 。
11、页 4 0006 本发明提供了杂交瘤细胞株 10G4， 该细胞株已于 2010 年 7 月 13 日保藏于中国 典型培养物保藏中心 （CCTCC） ， 保藏地址是， 中国， 武汉， 武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO. C201016， 分类命名为小鼠杂交瘤细胞10G4。 其具有序列表中SEQ ID NO.1所示的抗黄曲霉 毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中 SEQ ID NO.2 所 示的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。 0007 抗黄曲霉毒素B1、 B2、 G1、 G2总量单克隆抗体， 。
12、它由保藏编号为CCTCC NO. C201016 的杂交瘤细胞株 10G4 分泌产生。其重链可变区具有序列表中 SEQ ID NO.3 所示的氨基酸 序列 ； 轻链可变区具有序列表中 SEQ ID NO.4 所示的氨基酸序列。 0008 本发明提供的杂交瘤细胞株 10G4 是采用两步筛选法获得的， 其具体步骤为 ： 将 BALB/c 小鼠经黄曲霉毒素完全抗原 AFB1-BSA 免疫 4-6 次后， 用 2 倍于前一次免疫剂量的 黄曲霉毒素完全抗原 AFB1-BSA 作最后一次加强免疫， 3 天后进行细胞融合， 采用 ELISA 方 法分两步进行筛选融合细胞 ： 第一步采用间接ELISA法筛选出。
13、抗黄曲霉毒素B1而不抗载体 蛋白 BSA 的阳性孔 ； 第二步采用间接竞争 ELISA 法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检 测， 用黄曲霉毒素G2作为竞争原因为国内外现有报道的黄曲霉毒素通用抗体对黄曲霉 毒素 G2 的交叉反应率往往是最小的 （ 50%） ， 选择吸光值和灵敏度均较高的孔， 采用有限 稀释法进行克隆， 克隆后 10 天左右采用同样的两步筛选法进行检测， 如此重复克隆 2-3 次 后， 最终筛选获得杂交瘤细胞株 10G4。 0009 抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体在黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量测 定中的应用。 0010 本发明提供的。
14、抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体的制备方法， 步骤如 下 ： 将获得的杂交瘤细胞株10G4注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠， 收集该 小鼠的腹水， 纯化即得抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体。 0011 按上述方案， 所述的纯化方法为辛酸 - 硫酸铵法， 具体操作为 ： 用双层滤纸过滤小 鼠腹水， 4， 12000r/min 离心 15min 以上， 吸取上清， 将所得腹水上清与 4 倍体积的醋酸盐 缓冲液混合， 搅拌下缓慢加入正辛酸， 每毫升腹水所需的正辛酸体积为 30 35 L， 室温 混合 30 60min， 4静置 2h。
15、 以上， 然后 4， 12000r/min 离心 30min 以上， 弃沉淀， 将得到 的上清液用双层滤纸过滤后， 加入1/10滤液体积的摩尔浓度为0.1mol/L 和pH值为7.4的 磷酸盐缓冲液， 用 2 mol/L 的氢氧化钠溶液调节该混合液的 pH 值至 7.4， 4 预冷， 缓慢加 入硫酸铵至硫酸铵终浓度为 0.277g/mL， 4静置 2h 以上， 然后 4， 12000r/min 离心 30min 以上， 弃上清， 将所得沉淀用原腹水体积 1/10 的 0.01mol/L 磷酸盐缓冲液重悬， 装入透析 袋， 对纯水透析， 将充分透析好的蛋白溶液置 -70冰箱冷冻， 之后用冷冻干燥。
16、机冻干， 收集 冻干粉， 即得纯化好的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体， 将抗体置 -20冰箱中 备用 ； 0012 所述的醋酸盐缓冲液为 0.29g 醋酸钠， 0.141mL 醋酸加水定容至 100mL 所得 ； 所述 的 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲液为 0.8g 氯化钠， 0.29g 十二水磷酸氢二钠， 0.02g 氯化钾， 磷酸 二氢钾 0.02g， 加水定容至 100mL 所得。 0013 本发明的有益效果在于 ： 0014 (1) 本发明提供的杂交瘤细胞株 10G4 可以用于制备抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体。用常规非竞争酶联。
17、免疫吸附分析 （ELISA） 法测得 10G4 的鼠腹水抗体的 说 明 书 CN 102747042 B 4 3/5 页 5 效价可达 5.12105。 0015 (2) 本发明提供的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体可以一致性较好 地识别黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2， 对黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 的 50% 抑制浓度 IC50依次为 2.09ng/mL、 2.23ng/mL、 2.19ng/mL、 3.21ng/mL， 对黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 的交叉反应率 范围为 65.2%-100%。 0016 (3) 本发明提供的抗。
18、黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体可应用于定量测定 黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量。 具体实施方式 0017 实施例 1 ： 杂交瘤细胞株 10G4 的制备 0018 1. 动物免疫 0019 购买 6 周龄 BALB/c 小鼠 6 只， 免疫市售的黄曲霉毒素 B1 完全抗原 AFB1-BSA。第 一次免疫将黄曲霉毒素 B1 完全抗原与等量福氏完全佐剂乳化后， 于小鼠颈背部皮下多点 注射。 第二次免疫于4周后进行， 采用福氏不完全佐剂与等量黄曲霉毒素B1完全抗原乳化， 于小鼠腹腔注射。第三次免疫与第二次免疫间隔 4 周， 免疫方式与其相同， 第四次免疫于第。
19、 三次免疫3周后进行， 免疫方式与第二次免疫相同， 同样为腹腔注射。 4次免疫剂量相同， 均 为每鼠 50g。前 3 次每次免疫后 8 天， 尾静脉采血， 分离血清， 采用间接 ELISA 法监测小鼠 血清效价。第 4 次免疫后 8 天， 尾静脉采血， 分离血清， 采用间接 ELISA 法监测小鼠血清效 价， 并用间接竞争 ELISA 法测定小鼠血清灵敏度， 选择效价、 灵敏度均相对较高的血清对应 的小鼠进行最后一次加强免疫， 免疫剂量为之前的2倍。 黄曲霉毒素B1完全抗原AFB1-BSA 购于 Sigma-Aldrich 公司。 0020 2. 细胞融合 0021 于最后一次加强免疫 3 天。
20、后， 采用 50%（重量百分数） 的聚乙二醇即 PEG（分子量 为 1450） 作融合剂， 按常规方法进行细胞融合， 具体步骤 ： 无菌条件下杀死免疫小鼠， 分离 脾细胞， 与鼠源骨髓瘤细胞 SP2/0 以 5 1 的个数比混合， 用 RPMI-1640 基础培养液洗混合 细胞， 用 50%PEG 融合， 融合 1 分钟， 然后加满 RPMI-1640 基础培养液， 离心， 移去上清， 小鼠 脾细胞和鼠源骨髓瘤细胞 SP2/0 形成的融合细胞用 72mLRPMI-1640 基础培养液重悬， 将重 悬起来的细胞滴加到 96 孔细胞培养板内， 2 滴 / 孔， 置 37二氧化碳培养箱培养， 所述的。
21、 RPMI-1640 基础培养液为含有 20%（体积百分数） 胎牛血清， 2%（重量百分数） 生长因子和 1% （重量百分数） 次黄嘌呤 - 氨基蝶呤 - 胸腺嘧啶核苷即 HAT。上述 SP2/0 购于上海泛柯生物 科技有限公司 ； RPMI-1640基础培养液购于Hyclone公司 ； 1%次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧 啶核苷即 HAT 购于 Sigma-Aldrich 公司。 0022 3. 细胞株的筛选及克隆 0023 待细胞融合后第12天左右， 细胞集落长到占孔底1/2大小， 培养液变黄， 即可进行 抗体检测。采用 ELISA 方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行筛选， 筛选分两步进行， 。
22、第一 步采用间接 ELISA 法筛选出抗黄曲霉毒素 B1 而不抗载体蛋白 BSA 的阳性孔 ； 第二步采用 间接竞争 ELISA 法对第一步筛选出的阳性孔进行检测， 用黄曲霉毒素 G2 作为竞争原， 选择 吸光值和灵敏度均较高的孔 （吸光值较高指竞争原为 0 的孔即阳性对照孔的最终测定值较 高， 灵敏度较高指抑制率为 50% 时的竞争原浓度亦即 IC50值较小） ， 采用有限稀释法进行克 说 明 书 CN 102747042 B 5 4/5 页 6 隆， 克隆后10天左右采用同样的两步法进行检测， 如此重复克隆2-3次后， 获得杂交瘤细胞 株 10G4。 0024 实施例 2 ： 抗黄曲霉毒素。
23、 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体杂交瘤细胞株系 10G4 抗体 可变区序列测定 0025 （1） 提取总 RNA ： 采用天根公司的总 RNA 提取试剂盒并按照说明书提取可产生杂交 瘤细胞株系 10G4 的总 RNA ； 0026 （2）合成 cDNA ： 以步骤 1 获得的总 RNA 为模板， oligo (dT) 15为引物， 按照 SuperScriptTM-2 反转录酶说明书进行反转录， 合成cDNA第一链 ； 引物oligo (dT) 15 由 Invitrogen 购得 ； 0027 （3） PCR 法克隆可变区基因 ： 根据 GENEBANK 中小鼠抗体基因序列的保。
24、守位点设计 引物， 以cDNA为模版扩增抗体轻、 重链可变区基因。 PCR程序为 ： 94 30s、 55 1min、 72 1min ， 扩增 30 个循环， 最后 72延伸 10min。PCR 产物经过 1 （重量百分数） 的琼脂糖 凝胶电泳分离后， 用试剂盒纯化回收DNA片段， 连接到载体pMD18-T中， 转化大肠杆菌DH5 感受态细胞， 挑取阳性克隆， 送至上海桑尼生物科技有限公司进行测序。 其中引物的序列分 别为 ： 重链可变区引物为5，-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CWG G-3，（22mer） 和5，-TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT 。
25、CCC TTG GCC CC-3，（32mer） 其中 S、 M、 R 和 W 为简并碱基， M=A/C， R=A/G， S=C/G， W=A/T， 轻链可变区引物为 5，-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC -3，（24mer） 和 5，-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3，（24mer） 。 0028 得到的基因序列结果 ： 重链可变区编码基因序列长 356bp， 序列如 SEQ ID NO:1 所 示， 根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的重链可变区由 118 个氨基酸组成， 序列如 SEQ ID NO:3 所示。
26、。轻链可变区编码基因序列长 332bp， 序列如 SEQ ID NO:2 所示， 根据所获得的基因序列推导出该基因序列所编码的轻链可变区由 110 个氨基酸组成， 序列 如 SEQ ID NO:4 所示。 0029 实施例 3 ： 抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体的制备纯化、 亚型和特性鉴 定 0030 将实施例 2 获得的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体杂交瘤细胞株系 10G4 注射预先用福氏不完全佐剂处理过的 BALB/c 小鼠， 收集该小鼠的腹水， 采用辛酸 - 硫 酸铵法纯化抗体， 具体操作为 ： 用双层滤纸过滤小鼠腹水， 4， 12。
27、000r/min 离心 15min， 吸 取上清， 将所得腹水上清与 4 倍体积的醋酸盐缓冲液混合， 搅拌下缓慢加入正辛酸， 每毫升 腹水所需的正辛酸体积为 33 L， 室温混合 30min， 4静置 2h， 然后 4， 12000r/min 离 心 30min， 弃沉淀， 将得到的上清液用双层滤纸过滤后， 加入 1/10 滤液体积的摩尔浓度为 0.1mol/L 和 pH 值为 7.4 的磷酸盐缓冲液， 用 2 mol/L 的氢氧化钠溶液调节该混合液的 pH 值至 7.4， 4 预冷， 缓慢加入硫酸铵至硫酸铵终浓度为 0.277g/mL， 4静置 2h， 然后 4， 12000r/min 离心。
28、 30min， 弃上清， 将所得沉淀用原腹水体积 1/10 的 0.01mol/L 磷酸盐缓冲 液重悬， 装入透析袋， 对纯水透析， 将充分透析好的蛋白溶液置 -70冰箱冷冻， 之后用冷冻 干燥机冻干， 收集冻干粉， 即得纯化好的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体， 将 抗体置 -20冰箱中备用 ； 所述的醋酸盐缓冲液为 0.29g 醋酸钠， 0.141mL 醋酸加水定容至 100mL 所得 ； 所述的 0.1mol/L 的磷酸盐缓冲液为 0.8g 氯化钠， 0.29g 十二水磷酸氢二钠， 0.02g 氯化钾， 磷酸二氢钾 0.02g， 加水定容至 100mL 所得。 。
29、说 明 书 CN 102747042 B 6 5/5 页 7 0031 用市售亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株 10G4 分泌的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体的亚型为 IgG1。 0032 用常规非竞争酶联免疫吸附分析 （ELISA） 法测得 10G4 的鼠腹水抗体的效价可达 5.12105， 即鼠腹水抗体稀释 5.12105倍时的溶液测定结果为阳性。用常规间接竞争 ELISA法鉴定其对黄曲霉毒素B1、 B2、 G1、 G2总量的灵敏度50%抑制浓度IC50依次为2.09ng/ mL、 2.23ng/mL、 2.19ng/mL、 3.21ng/mL， 对黄曲霉毒素 B。
30、1、 B2、 G1、 G2 的交叉反应率范围为 65.2%-100%。 0033 实施例 4 ： 黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体 10G4 的应用。 0034 将实施例 3 中获得的黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 共 4 条标准曲线平均化处理获得 一条新的定量分析曲线作为黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量分析曲线， 并用于检测 5 份花生 实际样品黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量， 同时采用 GB/T 18979-2003 高效液相色谱标准方 法进行检测比对， 结果显示两种方法一致性比较理想， 详细结果 ： 0035 样 品 1 ：。
31、 基 于 抗 体 10G4 的 总 量 ELISA 方 法 检 测 结 果 为 0.23ng/mL， GB/T 18979-2003 高效液相色谱标准方法检测结果为 0.2ng/mL ； 0036 样 品 2 ： 基 于 抗 体 10G4 的 总 量 ELISA 方 法 检 测 结 果 为 1.47ng/mL， GB/T 18979-2003 高效液相色谱标准方法检测结果为 1.2ng/mL ； 0037 样 品 3 ： 基 于 抗 体 10G4 的 总 量 ELISA 方 法 检 测 结 果 为 0.88ng/mL， GB/T 18979-2003 高效液相色谱标准方法检测结果为 1.1 n。
32、g/mL ； 0038 样品4 ： 基于抗体10G4的总量ELISA方法检测结果为阴性， GB/T 18979-2003高效 液相色谱标准方法检测结果为阴性 ； 0039 样 品 5 ： 基 于 抗 体 10G4 的 总 量 ELISA 方 法 检 测 结 果 为 0.92ng/mL， GB/T 18979-2003 高效液相色谱标准方法检测结果为 0.8ng/mL。 说 明 书 CN 102747042 B 7 1/2 页 8 序列表 110 中国农业科学院油料作物研究所 120 杂交瘤细胞株 10G4 及其产生的抗黄曲霉毒素 B1、 B2、 G1、 G2 总量单克隆抗体 160 4 210。
33、 1 211 356bp 212 DNA 213 小鼠 400 1 aggtgcagct gcaggagtca gggggaggct tagtgaagcc tggagggtcc 50 ctgaaactct cctgtgcagc ctcaggattc actctcagta gtaatgacat 100 gtcttgggtt cgccagacac cggagaagag gctggagtgg gtcgcaagta 150 ttagtagagg tggtaggtac acctactatc cagacagtgt gaaggggcga 200 ttcaccatct ccagagacaa agccaagaa。
34、c accctgtatc tgcaaatgaa 250 cagtctgagg tctgaggata cggccatgta ttattgtgca agacactatg 300 gtagctactg gtacttcgat gtctggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 350 tcctca 356 210 2 211 332bp 212 DNA 213 小鼠 400 2 ccgtttgatt tccagcttgg tgccccctcc gaacgtgtaa gctccctaat 50 gtgctgacag taataggttg cagcatcctc ctcctccaca ggat。
35、ggatgt 100 tgagggtgaa gtctgtccca gacccactgc cactgaacct ggcagggacc 150 ccagattcta ggttggatac aagatagatg aggagtctgg gtggctgtcc 200 tggtttctgt tggttccagt gcatataact atagccagat gtactgacac 250 ttttgctggc cctgtatgag atggtggccc tctgccccag agatacagct 300 aaggaagctg gagactgggt gagctcaatg tc 332 210 3 211 118。
36、 序 列 表 CN 102747042 B 8 2/2 页 9 212 PRT 213 小鼠 400 3 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser 1 5 10 15 20 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser Ser Asn Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro 25 30 35 40 Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Arg Gly Gly Arg Ty。
37、r Thr Tyr Tyr Pro 45 50 55 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg His Tyr Gly 85 90 95 100 Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 105 110 115 2。
38、10 4 211 110 212 PRT 213 小鼠 400 4 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr 1 5 10 15 20 Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn 25 30 35 40 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser 45 50 55 60 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg 85 90 95 100 Ser Glu Gly Ala Pro Ser Trp Lys Ser Asn 105 110 序 列 表 CN 102747042 B 9 。