技术领域
本专利属于荧光生物分子探针领域，涉及双核钌配合物在靶向检测癌细胞溶酶体细胞器荧光探针等相关领域中的应用。
背景技术
溶酶体是真核细胞内的一种酸性细胞器，负责细胞的消化、降解功能，溶酶体在细胞各种生命活动，包括物质代谢、细胞膜循环、细胞凋亡中发挥着重要作用(P.Saftig，J.Klμmperman，Nat.Rev.Mol.CellBiol.2009，10，623-635；G.Kroemer，M.Jaattela，Nat.Rev.Cancer2005，5，886-897；M.E.Gμicciardi，M.Leist，G.J.Gores，Oncogene2004，23，2881-2890)。如果它发生功能紊乱，会引发诸如肿瘤、炎症、矽肺等多种疾病的产生(Fehrenbacher，N.；Jaattela，M.CancerRes.2005，65，2993-2995)。溶酶体荧光探针能够实现对溶酶体的标记，标记溶酶体位置，直观地监测溶酶体在生理、病理过程中的动态变化，对于深入地理解溶酶体参与生命活动的分子机制，而且对疾病的治疗具有重要的指导意义。因此，研究、开发溶酶体荧光探针具有重要的理论意义及实际应用价值。本文中共提及三个双核钌配合物可用作溶酶体荧光探针，其中配合物Ru2已经报道于文献(Liu，P.；Liu，J.；Zhang，Y.-Q.；Wu，B.-Y.；Wang，K.-Z.J.Photochem.Photobiol.B.2015，143，89-99)，但只讨论了其细胞吸收的性质并没有研究其在细胞中的具体定位，本发明应用了细胞核、线粒体、溶酶体三种染料和三个配合物进行共同染色，在共聚焦显微镜下观察到了三个不同烷基链长的双核钌配合物定位于细胞中的溶酶体。目前具有溶酶体定位能力的双核钌配合物荧光探针还未见报道，该研究为开发双核钌配合物类溶酶体荧光探针提供了有意义的探索。
发明内容
本发明的目的是制备三种不同长度烷基链的双核钌配合物，应用了MTT法(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐比色法)和高内涵分析法探究了三个配合物对细胞的毒性，并通过荧光共聚焦方法对三种配合物进行了共定位成像研究，以Hoechst33342(三氯化氢2-(4-乙基苯基)-5-(4-甲基-1-哌嗪基)-2，5-二-1H-苯并咪唑)、Mitotrackergreen、LysoTrackergreen三种荧光探针为标准物，经过共定位分析，证实三种配合物在癌细胞中能实现对溶酶体的标记。
本发明的技术方案如下：
本发明采用的三种双核钌配合物的配体用L1，L2，L3表示，三种配合物用Ru1，Ru2，Ru3，代表，结构如下：
上述双核钌配合物的合成途径如下所示：
n＝10，[(bpy)2Ru(L1)Ru(bpy)2](ClO4)4Ru1
n＝6，[(bpy)2Ru(L2)Ru(bpy)2](ClO4)4Ru2
n＝3，[(bpy)2Ru(L3)Ru(bpy)2](ClO4)4Ru3
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
目前已经发现的大多数探针缺乏特异的靶向性，且不能提供客体分布的定量信息。迫切需要开发出具有细胞器定位功能以及能够反映客体分布的荧光探针本发明合成的三种配合物与活细胞共同培养即可进入活细胞内，进而特异性地进入细胞内的溶酶体这一细胞器，导致溶酶体的的荧光强度显著增强，进而用于癌细胞内溶酶体生理活动的监测。同时钌配合物相比于传统溶酶体荧光探针还具有光化学性质稳定、消光系数大、荧光寿命长和斯托克位移大等特点。且本发明第一次使用了高内涵分析的方法来检测配合物药物的细胞毒性，高内涵提供了一种灵敏度高、操作简便、使用安全的细胞增殖与活性检测方法，与传统的MTT实验相比具有明显的优势。
附图说明
图1HeLa细胞在不同浓度的配合物Ru1-Ru3孵育48h后的细胞活性图
图2HeLa细胞在浓度为20微摩的配合物Ru1-Ru3孵育24小时后，用Hoechst33342染色30分钟后共聚焦图片
图3HeLa细胞在浓度为20微摩的配合物Ru1-Ru3孵育24小时后，在Mitotrackergreen染色30分钟后共聚焦图片
图4HeLa细胞在浓度为20微摩的配合物Ru1-Ru3孵育24小时后，在Lysotrackergreen染色30分钟后共聚焦图片
图5HeLa细胞在浓度为50微摩的配合物Ru1-Ru3孵育24小时后的细胞周期分布图
图6HeLa细胞在浓度为50微摩的配合物Ru1-Ru3孵育24小时后的细胞凋亡百分比图
图7HeLa细胞在浓度为10微摩和40微摩的配合物Ru1和Ru3孵育24小时后的细胞周期分布和凋亡百分比图
具体实施方式
实施例1：配体L1、L2、L3和三个钌配合物的制备
1.前体的制备：1，3-二-(4-醛基-咔唑基)丙烷、1，6-二-(4-醛基-咔唑基)己烷、1，10-二-(4-醛基-咔唑基)癸烷的合成参照文献(张玉琦，北京师范大学硕士学位论文；Zhang，Y.；Wada，T.andSasabe，H.JoμrnalofPolymerScience：PartA：PolymerChemistry.1996，34，2289-2298；Ostraμskaite，J.；Voska，V.andGrazμleviciμs，J.V.MonatsheftefürChemie.2002，133，599-607.)中方法合成。
2.1，10-邻菲罗啉-5，6-二酮的合成：综合了多种文献方法的优点，(Amouyal，E.；Homsi，A.；Chambron，J.-C.andSauvage，J.-P.J.Chem.Soc.，DaltonTrans.1990，1841-1845；Hiort，C.；Lincoln，P.andNordén，B.J.Am.Chem.Soc.1993，115，3448-3454；Paw，W.andEisenberg，R.Inorg.Chem.1997，36，2287-2293.；Calderazzo，F.；Marchetti，F.；Pampaloni，G.andPassarelli，V.J.Chem.Soc.，DaltonTrans.1999，43894396)实验之前应将一水合邻菲罗啉(10克，50毫摩)和溴化钾(10克，84毫摩)用研钵研细后到入一个装有磁子的三口瓶中，封好口后放入冰箱冻一夜，另外，要将浓硫酸(100毫升)和浓硝酸(50毫升)事先混匀，也放入冰箱中冻一夜。实验时，先将三口瓶放入冰盐浴中冻一段时间，装上冷凝管，在缓慢地沿着瓶壁加入冻好的混合酸。刚加入酸时，可以看见有少量的溴生成，当固体被酸浸没后，产生溴的速度减慢。加完酸后，将冰浴撤去，让反应体系恢复到室温，待固体完全被酸浸透后，开始用磁子搅拌，可见有部分溴生成。缓慢地加热至85℃左右反应8小时，反应时可见有大量的溴回流，溶液呈红色透明状。8小时后，撤去冷凝管，拔掉瓶塞，油浴温度维持在85℃左右，除去溴，约需一夜时间。停止加热后，趁热将橙黄色溶液到入1200毫升碎冰中，溶液呈黄绿色。用碳酸氢钠将溶液中和至pH＝5～6，如果水加得合适，到预期的pH值时，会出现大量的黄色沉淀(水少时，将出现大量的盐，造成萃取困难；水多时，虽然沉淀被溶解，但是仍然可用二氯甲烷萃取出产品)。用二氯甲烷反复萃取直至水层呈淡粉色。用少量水洗去有机层中残留的少量溴，有机层用无水硫酸钠干燥，过滤后，再将二氯甲烷蒸干。粗产品用大约800毫升无水甲醇重结晶。重结晶溶液较稀时经过缓慢冷却，可以得到较大的黄色针状晶体，过滤收集产品后，滤液大约浓缩一半，经过缓慢冷却后又析出第二份产品，滤液继续浓缩还可以析出产品。前两次析出产品的产率可达50％以上。真空干燥，得黄色固体。
3.L1的合成：参照文献合成方法(Liu，P.；Liu，J.；Zhang，Y.-Q.；Wu，B.-Y.；Wang，K.-Z.J.Photochem.Photobiol.B.2015，143，89-99)，邻菲罗啉-5，6-二酮(0.085g，0.40毫摩)、1，10-二-(4-醛基-咔唑基)癸烷(0.11克，0.20毫摩)、乙酸铵(0.62克，8.10毫摩)于20毫升乙醇中，氮气保护下回流12小时。反应完毕，冷却，倒入30毫升水中，静置，过滤，水洗。所得固体用N，N-二甲基甲酰胺/乙醚重结晶，得黄色固体0.18g，产率98％。
4.L2的合成：参照文献合成方法(Liu，P.；Liu，J.；Zhang，Y.-Q.；Wu，B.-Y.；Wang，K.-Z.J.Photochem.Photobiol.B.2015，143，89-99)，称取0.2133g(1毫摩)邻菲罗啉-5，6-二酮、1.5799g(20毫摩)醋酸铵于20毫升冰醋酸中，氮气保护下微热溶解，溶液呈黄色透明状，迅速加入0.2355g(0.5毫摩)1，6-二-(2，2’二醛基-咔唑基)己烷，溶解后溶液呈红色透明，100℃下搅拌加热12h。反应几分钟后，瓶壁上出现黄色固体.反应完毕，有大量固体生成，冷至室温，倒入50毫升水中(pH＝3)，加氨水(25％)调至pH＝7，此时有大量黄色固体生成，离心分离，得到的固体分别用水、乙醇、二氯甲烷各洗三次，最后减压抽滤得黄色固体，产率70％。
5.L3的合成：参照文献合成方法(Liu，P.；Liu，J.；Zhang，Y.-Q.；Wu，B.-Y.；Wang，K.-Z.J.Photochem.Photobiol.B.2015，143，89-99)，将邻菲罗啉-5，6-二酮(0.084克，0.40毫摩)、1，3-二-(4-醛基-咔唑基)丙烷(0.082克，0.19毫摩)、乙酸铵(0.77克，10.02毫摩)溶于20毫升乙醇中，氮气保护下回流13小时。反应完毕，冷却，倒入30毫升水中，静置，过滤，水洗。用80毫升N，N-二甲基甲酰胺溶解所得固体，过滤。滤液浓缩，用N，N-二甲基甲酰胺/乙醚重结晶。将所得黄色固体溶解在尽量少的N，N-二甲基甲酰胺中，用薄层层析分离(展开剂：二氯甲烷/甲醇＝3/2，体积比)，用N，N-二甲基甲酰胺冲洗所得的硅胶，将所得的N，N-二甲基甲酰胺溶液浓缩，然后再用N，N-二甲基甲酰胺/乙醚重结晶，得黄色固体0.071g，产率37％。
6.双核钌配合物Ru1的合成：L1(0.081克，0.090毫摩)、二水合二(2，2-联吡啶)二氯化钌Ru(bpy)2Cl2·2H2O(0.094克，0.18毫摩)于5毫升乙二醇中，氮气保护下140℃下搅拌反应14小时，反应溶液由最初的紫色变成深红棕色，冷却，过滤。往滤液中边摇晃边逐滴加入高氯酸钠水溶液(一水合高氯酸钠约为1.4毫摩)，析出深红色沉淀。静置，抽滤。沉淀用乙腈/乙醚重结晶，固体用乙腈溶解，用柱层析分离(展开剂：饱和硝酸钾溶液/水/乙腈＝1/4/35，体积比)，收集主要的红色带，旋蒸除去大部分乙腈，加水使析出的盐溶解，然后滴加入高氯酸钠水溶液(一水合高氯酸钠约为1.4毫摩)，析出红色沉淀。抽滤，将所得固体用乙腈/乙醚扩散重结晶，得红色固体0.11g，产率55％。
7.双核钌配合物Ru2的合成：参照文献合成方法(Liu，P.；Liu，J.；Zhang，Y.-Q.；Wu，B.-Y.；Wang，K.-Z.J.Photochem.Photobiol.B.2015，143，89-99)合成。0.0104克(0.2毫摩)Ru(bpy)2Cl2·2H2O、0.0852g(0.1毫摩)配体L2和5毫升乙二醇混合，N2气保护下110℃搅拌加热12h，然后冷却抽滤，滤液中滴加1，4-二氧六环，出现油状物，倾出上层清夜，油状物用乙醇溶解，再加入1，4-二氧六环析出沉淀，该沉淀用乙醇/1，4-二氧六环重结晶，最后得到深红色固体，产率69％。
8.双核钌配合物Ru3的合成：L3(0.073克，0.090毫摩)、Ru(bpy)2Cl2·2H2O(0.094克，0.18毫摩)于5毫升乙二醇中，氮气保护下140℃下搅拌反应14小时，反应溶液由最初的紫色变成深红棕色，冷却，过滤。往滤液中边摇晃边逐滴加入高氯酸钠水溶液(一水合高氯酸钠约为2.0毫摩)，析出深红色沉淀。静置，抽滤。沉淀用乙腈/乙醚重结晶，固体用乙腈溶解，用柱层析分离(展开剂：饱和硝酸钾溶液/水/乙腈＝1/4/35，体积比)，收集主要的红色带，旋蒸除去大部分乙腈，加水使析出的盐溶解，然后滴加入高氯酸钠水溶液(一水合高氯酸钠约为2.0毫摩)，析出红色沉淀。抽滤，将所得固体用乙腈/乙醚扩散重结晶，得红色固体0.10克，产率52％。
实施例2：三个钌配合物的细胞毒性实验
取处于指数生长期状态较好宫颈癌HeLa细胞，用培养基制成细胞悬液后，以细胞计数板计数，按照1104个细胞/孔接种于96孔板，进行传代培养。细胞传代24小时后，将原培养基吸出，加入含有不同浓度钌配合物(10-80微摩)的培养基100微升/孔，阳性对照组加入含有不同浓度顺铂配合物的培养基100微升/孔，阴性对照组加入新鲜培养基100微升/孔。将96孔板放入37℃的相对湿度95％，5％二氧化碳培养箱孵育24小时。待配合物作用24小时后，弃去旧培养基，避光加入100微升含MTT的培养基(5毫克/毫升MTT∶培养基＝1∶10)；孵育4小时，然后加DMSO裂解液15分钟；酶标仪测光密度OD490吸光度值。根据OD值计算出不同浓度配合物对HeLa细胞的抑制率，通过origin对其进行线性拟合，读取抑制率为50％所对应的配合物浓度，即为IC50值。三个配合物的IC50值分别为：13.85，＞100，46.72微摩/升，顺铂的IC50值为6.84微摩/升。
实施例3：三个配合物在HeLa细胞内的荧光共聚焦定位实验
将细胞接种于20平方毫米的荧光共聚焦显微镜用培养皿中，细胞密度为1.0104个/孔，加入固定浓度钌配合物(20微摩)的培养基，放入37℃的相对湿度95％，5％二氧化碳培养箱孵育24小时，将原培养基吸出，用pH＝7.4的磷酸盐冲洗溶液三次，用浓度为10微摩的溶酶体染料LysoGreen染色2小时，100纳摩线粒体染料Mito-TrackerGreen染色30分钟，5微克/毫升的细胞核染料Hoechst33342染色30分钟，在配置Ar/Kr离子发射器的ZEISSLSM700共聚焦显微镜下用488纳米激发配合物成像。
实施例4：三个配合物的高内涵分析
取处于指数生长期状态较好细胞接种于96孔板，细胞密度为1.0105个/孔，将原培养基吸出，加入含有固定浓度钌配合物(50微摩)的培养基100微升/孔，将96孔板放入37℃的相对湿度95％，5％二氧化碳培养箱孵育24小时，将原培养基吸出，用pH＝7.4的PBS冲洗三次，用浓度为10毫克/毫升Hoechst33342和10毫克/毫升的碘化丙啶PI染色20分钟，用ImageXpressMicrosystem进行成像并分析。发现三种配合物对HeLa细胞的凋亡的影响结果与MTT法一致，另外还得出了三种配合物对细胞生长周期的影响。