技术领域
本发明属于蕨藻红素提取技术领域，具体涉及一种使用高速逆流色谱分离羽状蕨藻中蕨藻红素的方法。
背景技术
蕨藻红素广泛存在于藻类植物中，具有显著的促进或抑制植物生长，延缓果实成熟，花朵衰老，竞争性抑制增长激素，除草剂，脱叶剂等作用，除此之外蕨藻红素还被发现具有较好的抗肿瘤活性。蕨藻红素为橙红色立方晶体，熔点：319-319.5℃，分子式：C24H18N2O4，结构式：
蕨藻红素的提取方法多采用溶剂浸提法、多重溶剂重结晶法、索氏提取法等。然而，传统提取方法具有提取效率低、操作复杂、溶剂用量大、耗时长及污染严重等缺点。
微波辅助提取(Mierowave Assisted Extraetion,MAE)作为天然产物提取中一种非常有发展潜力的新型技术，具有穿透力强、效率高、溶剂用量少、提取率高、成本低等优点，已被广泛关注。微波加热可使水等极性分子在微波电磁场中快速转向及定向排列，从而产生撕裂和相互摩擦发热,这种剧烈运动可使植物细胞内部结构发生破坏，有助于有效成分的溶出，同时微波提取的副产物少，有利于提纯。与传统的提取方法相比，MAE可显著提高提取率，减少分析时间并且降低环境污染，减少甚至消除由手工操作中个体差异所产生的误差，提高分析测试的灵敏度、准确度、重现性，这些优势已经使得MAE成为较好的样品前处理方法之一。
高速逆流色谱(High-speed Counter-current Chromatography，HSCCC)是由Ito.Y.博士研制和开发的新型液液分配色谱技术，它是建立在一种特殊的流体动力学平衡的基础上，利用螺旋管的高速行星式运动产生一种不对称离心力，使互不相溶的两相溶剂不断混合，同时保留其中的一相(固定相)，利用恒流泵连续输入另一相(流动相)，此时在螺旋柱中任何一部分，两相溶剂反复进行着混合和静置的分配过程。流动相载着溶质(样品)不断穿过固定相，使样品在两相之间不断反复地进行分配，其分配频率高达每秒13次以上，由于样品中各组分在两相溶剂中的溶解度、分配能力不同，导致在螺旋管中的迁移速度也不同，因而使样品中的组分得到高效快速的分离。HSCCC不需要固体支撑体，因而避免了固体固定相不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等问题，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高，是一种理想的制备分离手段，具有适用范围广、制备量大、操作简单、高效快速等优点，广泛应用于天然产物分离纯化、生物医药、环境分析、材料、化工、海洋生物和食品等领域，并已制备出包括黄酮类、蒽醌类、皂苷类、大环内酯类、儿茶素类、多酚类、糖蛋白类、多糖类在内的数百种单体成分。
近年来，国内外应用HSCCC分离天然植物中活性物质的研究已有很多，2013年1月16日公开的公开号为CN102875506的专利申请公开了一种利用高速逆流色谱法制备西瑞香素的方法；2012年12月19日公开的公开号为CN102827242的专利申请公开了一种棱角丝瓜甙A的提纯方法，该方法亦是采用高速逆流色谱法来实现分离纯化目的的；2012年10月3日公开的公开号为CN102702289的专利申请公开了应用高速逆流色谱法从大叶白麻中纯化三种黄酮苷的方法。
然而，国内外对于羽状蕨藻的研究甚少，对于羽状蕨藻中蕨藻红素的分离纯化方法也不多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种使用高速逆流色谱分离羽状蕨藻中蕨藻红素的方法，该方法采用微波辅助法提取羽状蕨藻中的蕨藻红素，该方法具有提取效率高，操作简便，溶剂用量少且提取时间短等优点，同时采用高速逆流色谱分离羽状蕨藻中蕨藻红素，获得的蕨藻红素产品纯度高，本发明通过将微波提取与高速逆流色谱相结合，可以获得高提取率和高纯度的蕨藻红素。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来是实现的：一种使用高速逆流色谱分离羽状蕨藻中蕨藻红素的方法，包括以下步骤：
(1)将羽状蕨藻粉碎，采用微波辅助提取法提取后，获得羽状蕨藻粗提物；
(2)选取高速逆流色谱的溶剂系统；
(3)将步骤(1)获得的羽状蕨藻粗提物浓缩至膏状，用高速逆流色谱溶剂系统的下相溶解，得到高速逆流色谱分离样液；
(4)采用高速逆流色谱分离步骤(3)的高速逆流色谱分离样液，并收集各流分；
(5)将步骤(4)所得各流分与蕨藻红素标准品采用高效液相色谱分析，通过高效液相色谱的保留时间定性，收集与标准品保留时间一致的流分即为蕨藻红素产品。
在上述使用高速逆流色谱分离羽状蕨藻中蕨藻红素的方法中：
步骤(1)中将羽状蕨藻粉碎前，最好先经干燥处理。干燥处理可以采用本领域常规的干燥方式，如烘干，晾干，晒干等。
步骤(1)中采用微波辅助提取法提取时，微波辅助提取的各项参数为：提取溶剂优选为体积百分含量为80～100％的乙醇，微波温度优选为40～60℃，微波功率优选为100～300W，微波时间优选为5～15min，料液比优选为1:30～1:50g/mL。
当微波辅助提取的各项参数为以下参数时，蕨藻红素的提取效果更好，采用微波辅助提取法提取时，微波辅助提取的各项参数为：提取溶剂为体积百分含量为90％的乙醇，微波温度为50℃，微波功率为300W，微波时间为15min，料液比为1:40g/mL。
步骤(2)中高速逆流色谱的溶剂系统优选为正己烷-甲醇-水，其中正己烷-甲醇-水的体积比优选为2:1:1，正己烷-甲醇-水的体积比是经过大量的筛选试验，最终优化获得的参数。
步骤(4)中采用高速逆流色谱分离时，分离条件优选为：流速1.0～3.0mL/min，转速为800～900rpm/min(反转)，检测波长为315nm。
步骤(4)中采用高速逆流色谱分离时，以溶剂系统上相为固定相，下相为流动相。
采用高速逆流色谱分离时，固定相的保留率为76.8％。该固定相的保留率是根据体积比为2:1:1的正己烷-甲醇-水溶剂体系来确定的。
步骤(5)中高效液相色谱的条件优选为：Athena C18-WP，100A，4.6mm×150mm，3μm；流动相为甲醇-0.2％冰醋酸，二者的体积比为80:20；检测器为88232UV紫外检测仪；检测波长为315nm；流速为0.3mL/min；柱温为30℃；进样量为20μL。
采用上述高效液相色谱及参数时，蕨藻红素的保留时间在13.784min附近。
步骤(5)中蕨藻红素产品的纯度大于95％。
作为本发明的一种优选的实施方式，本发明提供的使用高速逆流色谱分离羽状蕨藻中蕨藻红素的方法，包括以下步骤：
制备步骤1：将干燥的羽状蕨藻粉碎；
制备步骤2：精确称取一定量羽状蕨藻，采用微波辅助提取法提取羽状蕨藻中蕨藻红素，得粗提物，提取条件如下：提取溶剂体积百分含量为85～95％的乙醇，调整微波温度为50～60℃，微波功率为300W，微波时间为15min，料液比1:40g/mL；
制备步骤3：选取高速逆流色谱的溶剂系统：正己烷-甲醇-水(2:1:1，v:v:v)；
制备步骤4：将步骤2得到的粗提物浓缩至膏状，用HSCCC溶剂系统的下相溶解，得溶解液，以待逆流分离；
制备步骤5：高速逆流色谱溶剂系统的上相为固定相，下相为流动相；
制备步骤6：将步骤4所得的溶解液经过高速逆流色谱分离，分离条件为：流速1.0～2.0mL/min，转速(反转)750～850rpm/min，检测波长315nm，按照出峰情况收集各流分；
制备步骤7：将步骤6所得的分离流分与蕨藻红素标准品进样高效液相色谱，HPLC条件为：Athena C18-WP,100A,4.6mm×150mm,3μm；流动相甲醇-0.2％冰醋酸(80：20，v:v)；检测器88232UV紫外检测仪；检测波长315nm；流速0.3mL/min；柱温30℃；进样量20μL；
制备步骤8：根据HPLC谱图的保留时间与峰型得到蕨藻红素纯品，分离出的蕨藻红素纯度大于95％。
本发明具有如下优点：
(1)本发明首先在国内建立了羽状蕨藻中蕨藻红素的分离纯化工艺，得到95％以上纯度的蕨藻红素；
(2)本发明采用微波辅助提取法提取羽状蕨藻中蕨藻红素，相对于传统的提取方法耗时短、提取效率高，能降低环境污染且自动化高，还能减少甚至消除由手工操作中个体差异所产生的误差，能提高分析测试的灵敏度、准确度、重现性；
(3)本发明采用高速逆流色谱制备工艺，克服了传统固相载体带来的样品吸附、损失与污染的不良影响；HSCCC因其独特的分离原理，在分离不同种类物质时只需更换溶剂系统，而不是色谱柱，避免了柱效下降等问题，降低了耗材价格，易于工业推广；
(4)本发明中采用的提取溶剂选用乙醇，成本低，安全性好，污染低，易于回收；
(5)采用本发明的分离方法，可从羽状蕨藻中分离出纯度较高的蕨藻红素，该方法操作简单，适用范围广，制备量大，对环境污染小，易于工业推广，也可为其他植物中活性物质的分离纯化提供参考依据，具有很好的应用价值；
(6)本发明采用微波萃取结合高速逆流色谱法分离纯化羽状蕨藻中蕨藻红素，为之后蕨藻红素结构性质研究奠定了基础。
附图说明
图1是本发明实施例1中蕨藻红素标准品色谱图；
图2是本发明实施例1中微波提取粗提物的色谱图；
图3是本发明实施例1中高速逆流色谱分离色谱图；
图4是本发明实施例1中高速逆流色谱分离所得流分I的色谱图。
具体实施方式
实施例1
(1)精确称取20.00g干燥羽状蕨藻，采用微波辅助提取法提取羽状蕨藻中蕨藻红素，得粗提物，提取条件如下：提取溶剂90％(体积百分含量)乙醇，微波温度50℃，微波功率300W，微波时间15min，料液比1:40g/mL。
表1 单因素试验因素与水平设计
料液比为1:40～1:50g/mL时提取率并无明显增长，考虑提取成本及后续纯化难度，选择料液比为1:40g/mL。再经过下文表2中的正交试验确定本实施例的微波辅助萃取参数。
表2 正交试验因素与水平
最终确定微波温度为50℃，微波时间为15min，微波功率为300W，乙醇浓度为90％(体积百分含量)，料液比为1:40g/mL。此时，蕨藻红素提取效果好。
(2)选取高速逆流色谱的溶剂系统：正己烷-甲醇-水(2:1:1，v:v:v)。
高速逆流色谱的溶剂系统是通过以下方式获得的：
分配系数K在0.5到2之间时则可使样品实现较好的分离。分配系数K的测定方法：配备一定比例的溶剂系统(见下表3)，分层，得到上相、下相备用。精确称量2.00g羽状蕨藻粉末，用上述优化的MAE条件进行萃取，得到蕨藻粗提物。抽滤，浓缩至膏状。先用5mL下相溶解，然后加入5mL上相，充分震荡，待静置分层后，将上相有机相浓缩后用色谱纯甲醇定容到原体积，过膜，用HPLC法测定上相中目标峰面积AU；下相过膜后直接进样，测定目标峰面积为AL，则分配系数K＝AU/AL。
按照K值测定方法，得出蕨藻红素的最佳HSCCC溶剂体系为正己烷-甲醇-水(2:1:1,v:v:v)，结果如表3-7所示。由表可知，蕨藻红素的极性较小，当溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1:1:1:1,v:v:v:v)时，K值可达9.38，当溶剂体系为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(7:3:5:5,v:v:v:v)时，K值有所降低，为4.98，而0.5<K<2.0时，才能使蕨藻红素实现很好的分离，因此选取正己烷-甲醇-水(2:1:1，v:v:v)作为蕨藻红素的最佳HSCCC溶剂体系。
表3 不同溶剂体系的K值
以溶剂系统上相为固定相，下相为流动相。其中固定相的保留率约为76.8％，固定性保留率＝(V总-V下相)/V总。
(3)将粗提物浓缩至浸膏状，用HSCCC溶剂系统流动相溶解，进行分离，分离条件为：流速2.0mL/min，转速850rpm/min，检测波长315nm。
得到的分离流分与蕨藻红素标准品进样高效液相色谱，HPLC条件为：AthenaC18-WP，100A，4.6mm×150mm，3μm；流动相甲醇-0.2％(体积百分含量)冰醋酸(80：20，v:v)；检测器88232UV紫外检测仪；检测波长315nm；流速0.3mL/min；柱温30℃；进样量20μL。
根据蕨藻红素标准品的HPLC谱图的保留时间，蕨藻红素标准品的保留时间约在13.784min。同时，将微波提取获得的粗提物用高效液相色谱分析，其在13.784min附近也有一个较大的色谱峰I(如图2中所示)。将逆流收集的各流分(如图3中所示)，逐一进行HPLC分析，发现流分I在液相色谱保留时间为13.784附近(如图4所示)，因此，流分I为的蕨藻红素，经检测，分离出的蕨藻红素产品的纯度为98.75％。纯度根据面积归一法计算。测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各杂质峰面积及其之和占总峰面积的百分率。
实施例2
(1)精确称取20.00g羽状蕨藻，干燥后，采用微波辅助提取法提取羽状蕨藻中蕨藻红素，提取条件如下：提取溶剂95％乙醇，微波温度60℃，微波功率100W，微波时间5min，料液比1:30g/mL。
(2)选取高速逆流色谱的溶剂系统：正己烷-甲醇-水(2:1:1，v:v:v)。
以溶剂系统上相为固定相，下相为流动相。其中固定相的保留率约为76.8％。
(3)将粗提物浓缩至浸膏状，用HSCCC溶剂系统流动相溶解，进行分离，分离条件为：流速1.0mL/min，转速800rpm/min，检测波长315nm。
(4)得到的分离流分与蕨藻红素标准品进样高效液相色谱，HPLC条件为：Athena C18-WP,100A,4.6mm×150mm,3μm；流动相甲醇-0.2％冰醋酸(80：20，v:v)；检测器88232UV紫外检测仪；检测波长315nm；流速0.3mL/min；柱温30℃；进样量20μL。
(5)根据HPLC谱图的保留时间与峰型得到蕨藻红素纯品，分离出的蕨藻红素纯度为96.43％。
实施例3
(1)精确称取20.00g羽状蕨藻，采用微波辅助提取法提取羽状蕨藻中蕨藻红素。提取条件如下：提取溶剂85％乙醇，微波温度40℃，微波功率200W，微波时间10min，料液比1:50g/mL。
(2)选取高速逆流色谱的溶剂系统：正己烷-甲醇-水(2:1:1，v:v:v)。
以溶剂系统上相为固定相，下相为流动相。其中固定相的保留率约为76.8％。
(3)将粗提物浓缩至浸膏状，用HSCCC溶剂系统流动相溶解，进行分离，分离条件为：流速3.0mL/min，转速900rpm/min，检测波长315nm。
得到的分离流分与蕨藻红素标准品进样高效液相色谱，HPLC条件为：AthenaC18-WP,100A,4.6mm×150mm,3μm；流动相甲醇-0.2％冰醋酸(80：20，v:v)；检测器88232UV紫外检测仪；检测波长315nm；流速0.3mL/min；柱温30℃；进样量20μL。
根据HPLC谱图的保留时间与峰型得到蕨藻红素纯品，分离出的蕨藻红素纯度为95.29％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制。其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。