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1、(10)申请公布号 CN 102766594 A (43)申请公布日 2012.11.07 CN 102766594 A *CN102766594A* (21)申请号 201210179685.1 (22)申请日 2012.06.01 C12N 5/071(2010.01) C12N 15/113(2010.01) C12Q 1/02(2006.01) G01N 33/68(2006.01) (71)申请人 中国人民解放军第二军医大学 地址 200433 上海市杨浦区翔殷路 800 号 (72)发明人 朱霓 秦永文 赵仙先 袁文俊 (74)专利代理机构 上海泰能知识产权代理事务 所 31233。
2、 代理人 黄志达 谢文凯 (54) 发明名称 一种应用 miRNA 抑制内皮细胞迁移的方法 (57) 摘要 本发明涉及一种应用 miRNA 抑制炎症状态内 皮细胞迁移的方法， 包括 ： (1) 筛选 miR-155 靶基 因并通过报告基因进行验证， 利用重组血管紧张 素 II 刺激内皮细胞， 模拟动脉粥样硬化状态下 内皮细胞的炎症反应 ； (2) 利用 miR-155 模拟物 增加该 miRNA 在炎症内皮细胞的表达量 ； (3) 利 用 Western blot 法检测 miR-155 模拟物对血管 紧张素 II 诱导的 ETS-1 蛋白表达的抑制作用 ； (4) 利用单层内皮细胞划痕法对炎。
3、症状态内皮细 胞的迁移进行检测。本发明工艺简单， 成本低， 采 用 miR-155 有效的抑制了炎症内皮细胞的迁移活 性， 同时为冠心病的防治提供有效干预靶点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 序列表 1 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种应用 miRNA 抑制内皮细胞迁移的方法， 包括 ： (1)筛选miR-155靶基因并进行验证， 利用重组血管紧张素II刺激内皮细胞， 模拟动脉 粥样硬化状态下内皮细胞的炎症反应 ； (2) 利用。
4、 miR-155 模拟物增加该 miRNA 在内皮细胞的表达量 ； (3) 利用 Western blot 法检测 miR-155 模拟物对血管紧张素 II 诱导的 ETS-1 蛋白表 达的抑制作用 ； (4) 利用划痕法对内皮细胞的迁移进行检测。 2. 根据权利要求 1 所述的一种应用 miRNA 抑制内皮细胞迁移的方法， 其特征在于 ： 所 述步骤 （1） 中的重组血管紧张素 II 的浓度为 1M， 刺激时间为 6h。 3. 根据权利要求 1 所述的一种应用 miRNA 抑制内皮细胞迁移的方法， 其特征在于 ： 所 述步骤 （2） 中的 miR-155 模拟物为包含 miR-155 核酸序。
5、列 “茎 - 环” 结构的发夹状结构， 主 序列如下 ： 5 -UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3 。 权 利 要 求 书 CN 102766594 A 2 1/3 页 3 一种应用 miRNA 抑制内皮细胞迁移的方法 技术领域 0001 本发明属于 miRNA 的应用领域， 特别涉及一种应用 miRNA 抑制炎症状态内皮细胞 迁移的方法。 背景技术 0002 心血管疾病作为人类的第一杀手， 其高发病率和死亡率一直颇受世界关注。 因此， 积极探询动脉粥样硬化的发病机制将对冠心病的治疗和预后起重要作用。迄今为止， 人们 对动脉粥样硬化的发病机理仍未完全明了。一直以来， 科学界比较。
6、公认的是内皮细胞的炎 症反应学说。 但近年来有研究发现， 内皮细胞处于炎症反应状态时其迁移活性便大大提高， 这直接导致了动脉粥样硬化血管的正性重构以及促发了动脉粥样硬化斑块内的血管新生。 正性重构的动脉粥样硬化血管的特点是具有薄纤维帽、 富含血管和脂质核心的易损斑块。 易损斑块处于一种生物不稳定状态， 它的纤维帽以及斑块内丰富血管的破裂出血是引起包 括急性心肌梗死在内的急性冠状动脉综合征发生的罪魁祸首。因此， 如何抑制炎性内皮细 胞的迁移活性一直是预防和治疗动脉粥样硬化的焦点之一。 0003 血管内皮炎症发生的起始阶段， 在血管紧张素 II 等血管活性物质刺激下， 内皮 细胞发生炎性活化。活化。
7、的内皮细胞主要表现为 ETS-1 等转录因子的激活以启动下游 血管新生和炎性基因 FLT1， VCAM1， MCP1 等的表达。其中 ETS-1 属于 E26 转化特异序列 (E26Transformation-specifc Sequence,ETS)转录因子家族。 该家族成员表达谱广泛并且 含有相同的 ETS 功能域， 该功能域能够识别并特异结合于含有 GGA(A/T) 序列的启动 / 增强 区的基因， 从而调控下游基因的转录。大量研究表明， 转录因子 ETS-1 在内皮细胞的激活直 接导致了内皮细胞的迁移活性增高并较易于形成新生血管。Zhan 等运用 ETS-1 敲除的小 鼠模型研究发现。
8、， 该模型采用血管紧张素 -II 刺激后内皮募集炎性细胞的能力以及血管重 构的程度大大降低， 这与 ETS-1 下游基因 VCAM-1,MCP-1,PAI-1 和 p21CIP 的表达抑制相关。 因此血管紧张素-II的促炎症血管的新生和血管重构作用主要是通过转录因子ETS-1引起 的。 0004 MicroRNA 是一类由多细胞动物或植物基因的内含子、 miRNA 独立转录单位或基因 簇编码的 19 25 个核苷酸 （nucleotide,nt） 大小的内源性单链 RNA， 它们在转录后水平沉 默靶基因的翻译从而对生物体基因表达起到精细调节的作用。如果 miRNA 与靶 mRNA 的 3 非翻。
9、译区 (3 UTR) 匹配完全或接近完全， 则该复合体降解靶 mRNA ； 若两者序列部分匹配则 通过抑制靶 mRNA 的翻译来沉默特定基因的表达。现已明确， 它们在进化上有高度保守性， 对诸如心血管疾病、 肿瘤、 干细胞分化和自我更新等生理病理过程起重要的调控作用。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是提供一种应用 miRNA 抑制内皮细胞迁移的方法， 该 方法工艺简单， 成本低， 采用 miR-155 有效的抑制了炎症细胞的迁移， 从而达到预防心血管 疾病的目的。 说 明 书 CN 102766594 A 3 2/3 页 4 0006 本发明的一种应用 miRNA 抑制炎症内皮细。
10、胞迁移的方法， 包括 ： 0007 (1)筛选miR-155靶基因并进行验证， 利用重组血管紧张素II刺激内皮细胞， 模拟 动脉粥样硬化状态下内皮细胞的炎症反应 ； 0008 (2) 利用 miR-155 模拟物增加该 miRNA 在内皮细胞的表达量 ； 0009 (3) 利用 Western blot 法检测 miR-155 模拟物对血管紧张素 II 诱导的 ETS-1 蛋 白表达的抑制作用 ； 0010 (4) 利用划痕法对内皮细胞的迁移进行检测。 0011 所述步骤 （1） 中的重组血管紧张素 II 的浓度为 1M， 刺激时间为 6h。 0012 所述步骤 （2） 中的 miR-155 。
11、模拟物为包含 miR-155 核酸序列 “茎 - 环” 结构的发夹 状结构， 主序列如下 ： 5 -UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3 。 0013 有益效果 0014 本发明工艺简单， 成本低， 采用 miR-155 有效的抑制了炎症细胞的迁移， 从而达到 预防心血管疾病的目的。 附图说明 0015 图 1 为计算机软件分析显示 ETS-1 的 3 非翻译区存在两个 miR-155 的作用靶点 ； 0016 图 2 为 miR-155 能够抑制携带 ETS-1 靶序列萤光素酶的相对活性 ； 0017 图 3 为 miR-155 能够抑制血管紧张素 II 诱导的 ETS-1 在。
12、蛋白质水平的表达 ； 0018 图 4 为 miR-155 有效减少血管紧张素 II 诱导的炎性内皮细胞的迁移。 具体实施方式 0019 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明讲授的内容之后， 本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。 0020 实施例 1 0021 1.miR-155 靶基因的筛选方法 0022 运用 TargetScan、 PicTar 等软件检索 miR-155 可能的靶基因， 发现 ETS-1 基因的 3 非翻。
13、译区 (3 UTR) 含有 2 个 miR-155 的靶位点 ( 附图 1)。选定内皮细胞炎症相关的 ETS-1 作为候选基因。 0023 2报告基因验证 ETS-1 是 miR-155 的靶基因 0024 构建 pGL3-ETS1-3 UTR 重组质粒， 与 miR-155 模拟物共转染工具细胞 293T， 转染 24h 后冻融细胞一次， 用专用裂解液裂解细胞， 每孔 100l， 吹打均匀， 充分裂解后样品备 用。采用 Promega 公司的萤光素酶检测试剂盒， 在 1.5ml 离心管中加入 LARII 50l 和裂 解液5l混匀， 酶标仪检测萤火虫萤光素酶 ； 加入50l Stop&Glo。
14、溶液灭活萤火虫萤光素 酶， 酶标仪检测海肾萤光素酶。结果显示， 转染从 10-60nM 到不同浓度的 miR- 对照对萤光 素的表达均无影响。而转染 10， 30， 60nM 不同浓度的 miR-155 模拟物后萤光素的表达分别 下降了约 20%， 40% 和 50% 左右 ( 见附图 2)。 0025 3利用 Western blot 法检测 miR-155 模拟物对血管紧张素 II 诱导的 ETS-1 蛋 说 明 书 CN 102766594 A 4 3/3 页 5 白表达的抑制作用 0026 miR-155 模拟物或 miR- 对照各 40nM 与转染试剂混合， 内皮细胞按 1105/m。
15、l 密度 接种于 12 孔板进行转染。24h 后换液， 继续培养 24h。换无生长因子的内皮细胞培养液继 续培养细胞12h对其进行饥饿干预。 更换上述步骤中的培养液， 加入重组血管紧张素II， 使 其在培养液中的浓度为 1M， 刺激内皮细胞 6h。收集细胞蛋白样品进行电泳。电泳时， 按 每孔 20g 蛋白上样量等量上样。以 150V 电泳 1.5h， 100V 电压下转膜 1h。将膜放入自封 袋中， 加入 5脱脂奶粉 /TBST， 完全浸泡膜并封口， 于室温下振荡封闭 1h。加入 TBST 稀释 后的抗血管紧张素1型受体或对照GAPDH抗体一抗(抗血管紧张素1型受体抗体按1 ： 1000 稀释。
16、， 抗 GAPDH 抗体按 1 ： 1000 稀释 )， 4振荡孵育过夜。吸净一抗， TBST 漂洗膜 5min3 ； 加入稀释后的二抗 ( 均为 1 ： 5000 稀释 )， 水平摇床室温孵育 1h。吸净二抗， TBST 漂洗膜， 5min3， 等体积混合 ECL（AB 液） ， 充分覆盖湿润 NC 膜表面， 静置 1min ； 于暗室中用保鲜膜 将 NC 膜封好， 将 X 光片平放于 NC 膜上显影并记录数据。结果可见， 在血管紧张素 II 的刺 激下， 炎症内皮细胞 ETS-1 蛋白的表达量明显升高。然而增加了 miR-155 模拟物在炎症内 皮细胞的表达量后， 血管紧张素 II 诱导的。
17、 ETS-1 蛋白的表达量明显下降。( 见附图 3) 0027 4炎症内皮细胞的迁移实验 0028 采用 “划痕法” 对炎症内皮细胞的迁移活性进行研究。内皮细胞转染 miR-155 模拟 物或 miR- 对照各 40nM， 按 1105/ml 密度接种于 12 孔板， 做 3 复孔， 24h 后换液， 继续培养 24h， 总共 48h。换无生长因子的内皮细胞培养液继续培养细胞 12h 对其进行饥饿干预。此 时细胞应布满培养板底， 形成单层细胞。用 1ml 灭菌蓝色枪头匀速匀力的向一个方向划单 层内皮细胞， 每孔平行的划 3 次， 形成 3 条无细胞划痕区。PBS 清洗细胞 2 次， 加入无生长。
18、因 子的内皮细胞培养液。 在倒置显微镜下用记号笔在培养板底部为细胞划痕边缘做记号并拍 摄照片。加入血管紧张素 II 重组蛋白， 使其浓度为 1M， 刺激内皮细胞 12h 后在倒置显微 镜下观察划痕两侧的距离变化并拍照。用 Image-pro plus 6.0 软件计算刺激前后划痕两 侧的距离。结果发现， 在血管紧张素 II 的刺激下， 转染 miR- 对照的炎症内皮细胞迁移活性 大大增加， 划痕愈合率达 65% 左右。而运用 miR-155 模拟物增加炎症内皮细胞 miR-155 的 表达量能够明显抑制内皮细胞向划痕区的迁移， 划痕愈合率为 20% 左右。( 见附图 4) 说 明 书 CN 102766594 A 5 1/1 页 6 0001 序 列 表 CN 102766594 A 6 1/2 页 7 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102766594 A 7 2/2 页 8 图 4 说 明 书 附 图 CN 102766594 A 8 。