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1、(10)申请公布号 CN 103275962 A (43)申请公布日 2013.09.04 CN 103275962 A *CN103275962A* (21)申请号 201310218324.8 (22)申请日 2013.06.04 C12N 11/10(2006.01) C12N 11/04(2006.01) (71)申请人 国家粮食局科学研究院 地址 100037 北京市西城区百万庄大街 11 号 (72)发明人 綦文涛 梁新晓 贠婷婷 李爱科 付亭亭 赵明久 候义江 (74)专利代理机构 北京正理专利代理有限公司 11257 代理人 赵晓丹 (54) 发明名称 一种微生物发酵前包被微胶。
2、囊的制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种微生物发酵前包被微胶囊 的制备方法。 该方法包括囊材溶液的配制， 水相混 合液的配制， 油相混合液的配制， 沉降剂的配制， 微胶囊的制备及包被后培养等步骤。通过该方法 可以制得直径为 100-400 微米的微胶囊， 且该微 胶囊具有球形度高、 产率高、 分散性好等特点。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103275962 A CN 103275962 A *CN103275962A* 。
3、1/1 页 2 1. 一种微生物发酵前包被微胶囊的制备方法， 其特征在于， 该方法包括下述步骤 ： （1） 囊材溶液的配制 ： 配制浓度为 10g/L-20g/L 的海藻酸钠溶液， 灭菌备用 ； （2）水相混合液的配制 ： 向所述海藻酸钠溶液中添加碳酸钙， 至碳酸钙的浓度为 10-15g/L， 混合均匀后， 再加入对数生长期的微生物种子液， 至微生物的密度为 106cfu/ml， 然后加入大分子生物活性物质， 至大分子生物活性物质的浓度为 8g/L-10g/L， 充分混匀作 为水相 ； （3） 油相混合液的配制 ： 向液体石蜡中添加司盘 80， 作为油相， 所述司盘 80 的体积百分 含量为 。
4、0.1%-0.3% ； （4） 沉降剂的配制 ： 配制浓度为 0.1-0.3mol/L 的氯化钙溶液， 灭菌备用 ； （5）生物微胶囊的制备 ： 在 400 500rpm 的搅拌速度下， 按照水相与油相体积 比为 1:3-5 的比例， 向油相中缓慢加入水相， 搅拌 2-5min， 然后逐滴加入冰醋酸， 固定 化 10-15min， 停止搅拌， 其中冰醋酸与油相体积比为 1:500-600， 再按与水相体积比为 1:10-20 的比例， 向反应体系中加入沉降剂， 微胶囊缓慢沉降， 分离微胶囊， 用清水清洗 1 2 次， 得到直径为 100-400 微米的微胶囊 ； （6） 包被后培养 ： 将制备。
5、的微胶囊接入发酵液中， 培养至对数生长末期， 过滤分离微胶 囊即得含有大分子生物活性物质和微生物的微胶囊湿产品 ； （7） 微胶囊产品干燥 ： 按质量百分比为 10% 的量向微胶囊湿产品中加入淀粉， 搅拌均 匀， 45干燥 3 小时， 得到微胶囊干产品。 2. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 所述大分子生物活性物质为蛋白质、 多肽或黄酮类。 3. 根据权利要求 2 所述的制备方法， 其特征在于， 所述蛋白质为大豆分离蛋白或大豆 浓缩蛋白 ； 所述多肽为大豆多肽 ； 所述黄酮类为大豆异黄酮。 4. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 所述微生物为益生菌。 5. 根。
6、据权利要求 4 所述的制备方法， 其特征在于， 所述益生菌为酵母菌、 乳酸菌或双歧 杆菌。 6. 根据权利要求 1 所述的制备方法， 其特征在于， 灭菌的条件为 115， 灭菌 20min。 权 利 要 求 书 CN 103275962 A 2 1/5 页 3 一种微生物发酵前包被微胶囊的制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种微生物发酵前包被微胶囊的制备方法， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 微胶囊化技术在保护生物活性分子、 组织和细胞以对抗不利环境方面取得了较好 的成效。微胶囊技术尽管早已广泛应用于医药、 化工、 食品等领域， 但在益生菌的实际生产 中， 微囊化产品的生产尤其是。
7、工业化仍存在瓶颈， 主要体现在微胶囊的球形度、 单分散性、 得率和产品干燥几个方面上。目前生物微胶囊生产方法和设备， 除挤压喷雾法的设备比较 成熟， 可以满足工业化生产的需要外， 其他几种方法无论是生产成本、 工作效率， 还是机械 化自动化程度都不能达到要求。而目前喷挤压雾法存在的问题是产品粒径过大， 球形度和 单分散性都很差， 产品得率低等， 因此极大限制了其推广应用。而目前基于乳化凝胶化基 础上的微胶囊制备方法也同样存在产率低、 形态差、 单分散性不好和成本高等问题， 尤其在 用于包被微生物细胞时， 产品不但产率低、 粘连严重、 形态差、 成本高， 而且微生物在制备过 程中活性损失较大， 。
8、造成最终产品微生物活性和密度都不高， 很难达到实际应用的要求。 此 外， 目前所有微生物发酵前包被微胶囊普遍存在产品不易干燥的问题， 干燥后产品粘连严 重， 难以得到具有良好分散性的微胶囊产品， 造成产品得率极低， 质量很差， 不适合推广应 用。因此， 探讨新的适用工业化生产的方法， 寻找适合的产品成形和干燥方法， 是益生菌等 低抗逆性生物微胶囊化包被实现工业化生产亟待解决的问题。 0003 本发明基于乳化凝胶化原理， 采用将生物大分子物质和益生菌细胞协同包被的微 囊化方法， 用具有良好生物相容性的天然材料和温和工艺生产微胶囊产品， 产品采用混合 淀粉高温干燥的方法进行干燥， 最终得到可以实际。
9、应用的多功能生物微胶囊产品。产品具 有球形度好、 单分散性好、 产率高、 无粘连等特点， 能满足实际生产和使用需要。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种高球形度、 高产率、 高分散型、 具有工业化生 产潜力的生物微胶囊制备方法。该方法基于乳化凝胶化的原理制备微胶囊， 克服了现有技 术中挤压喷雾法制备微胶囊粒径大、 球形度差、 产率低的缺点 ； 采用水相中添加生物大分子 的方法， 解决了目前乳化凝胶化法制备微胶囊粒径不能控制， 单分散性差和粘连严重的问 题 ； 采用混合淀粉干燥湿微胶囊产品的方法， 克服了目前生物微胶囊干燥后粘连严重， 分散 性差的问题。该技术既可用于微生物的发。
10、酵前包被， 也可用于微生物的发酵后包被。 0005 为了解决上述技术问题， 本发明采取的技术方案为 ： 0006 一种微生物发酵前包被微胶囊的制备方法， 该方法包括下述步骤 ： 0007 （1） 囊材溶液的配制 ： 配制浓度为 10g/L-20g/L 的海藻酸钠溶液， 灭菌备用 ； 0008 （2） 水相混合液的配制 ： 向所述海藻酸钠溶液中添加碳酸钙， 至碳酸钙的浓度为 10-15g/L， 混合均匀后， 再加入对数生长期的微生物种子液， 至微生物的密度为 106cfu/ml， 然后加入大分子生物活性物质， 至大分子生物活性物质的浓度为 8g/L-10g/L， 充分混匀作 说 明 书 CN 1。
11、03275962 A 3 2/5 页 4 为水相 ； 0009 (3)油相混合液的配制 ： 向液体石蜡中添加司盘80， 作为油相， 所述司盘80的体积 百分含量为 0.1%-0.3% ； 0010 （4） 沉降剂的配制 ： 配制浓度为 0.1-0.3mol/L 的氯化钙溶液， 灭菌备用 ； 0011 （5）生物微胶囊的制备 ： 在 400 500rpm 的搅拌速度下， 按照水相与油相体 积比为 1:3-5 的比例， 向油相中缓慢加入水相， 搅拌 2-5min， 然后逐滴加入冰醋酸， 固定 化 10-15min， 停止搅拌， 其中冰醋酸与油相体积比为 1:500-600， 再按与水相体积比为 1。
12、:10-20 的比例， 向反应体系中加入沉降剂， 微胶囊缓慢沉降， 分离微胶囊， 用清水清洗 1 2 次， 得到直径为 100-400 微米的微胶囊 ； 0012 （6） 包被后培养 ： 将制备的微胶囊接入发酵液中， 培养至对数生长末期， 过滤分离 微胶囊即得含有大分子生物活性物质和微生物的微胶囊湿产品 ； 0013 （7） 微胶囊产品干燥 ： 按质量百分比为 10% 的量向微胶囊湿产品中加入淀粉， 搅拌 均匀， 45干燥 3 小时， 得到微胶囊干产品。 0014 进一步地， 所述大分子生物活性物质为蛋白质、 多肽或黄酮类。优选地， 所述蛋白 质为大豆分离蛋白或大豆浓缩蛋白 ； 所述多肽为大豆。
13、多肽 ； 所述黄酮类为大豆异黄酮。 0015 进一步地， 本发明方法中所述微生物为益生菌。优选为酵母菌、 乳酸菌或双歧杆 菌。 0016 进一步地， 上述方法中灭菌的条件为 115， 灭菌 20min。 0017 本发明的有益效果 ： 0018 本发明采用基于乳化凝胶化原理对益生菌进行微胶囊包被。其优势表现在 ： 水 相中同时加入生物大分子和益生菌， 改变了水相的粘度， 使其与油相混合时， 更容易形成稳 定的乳化体系 ； 且生物大分子的加入量会影响水相的粘度， 从而使水相在油相中分散时所 形成的油包水体系的粒径大小也不同， 通过控制大分子生物活性物质的加入量从而最终控 制微胶囊粒径的大小。这是。
14、以前乳化凝胶化法制备微胶囊不能解决的问题。 0019 以往无论是基于挤压喷雾法还是基于乳化凝胶化法制备的微胶囊， 其单分散性 都很差， 本发明通过加入大分子生物活性物质的方法， 改变了水相的流动性， 制备的微胶囊 具有很好的单分散性。 0020 生物大分子物质对微生物细胞具有保护作用， 提高了微胶囊制备过程微生物细 胞的活性， 保证了包被后发酵过程的顺利进行。 0021 采用海藻酸盐为壁材的微胶囊产品存在一个共性问题是， 由于其材料本身粘度 较大， 脱离水后， 微胶囊之间很容易粘连在一起， 干燥后粘连更加严重， 几乎得不到单个的 胶囊。因此本发明采用混合淀粉干燥的方法， 不但有效解决的上述问题。
15、， 而且成本低廉， 产 品的最终形态和色泽都得到很大改观。 0022 工艺和设备简单， 易于工业化生产。 附图说明 0023 图 1A 挤压喷雾法制备发酵前包被酵母菌微胶囊产品示意图 0024 图 1B 本发明方法制备发酵前包被酵母菌微胶囊产品示意图。 0025 图 2 激光粒度仪测定微胶囊粒径及分散情况。 说 明 书 CN 103275962 A 4 3/5 页 5 0026 图 3 实施例 2 制得的包被大豆肽和酵母菌微胶囊湿产品示意图。 0027 图 4 实施例 3 中添加淀粉制得的微胶囊干产品示意图。 0028 图 5 实施例 3 中不添加淀粉制得的微胶囊干产品示意图。 0029 图 。
16、6 实施例 4 中制得的包被大豆分离蛋白和乳酸菌微胶囊湿产品示意图。 0030 图 7 实施例 4 中制得的包被大豆分离蛋白和乳酸菌微胶囊干产品示意图。 具体实施方式 0031 下面结合具体实施例， 进步阐述本发明。但这些实施例仅限于说明本发明而不 用于限制本发明的保护范围。 0032 以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。 0033 以下实施例中所用材料、 试剂等如无特别说明均可从商业途径得到。 0034 实施例 1 ： 挤压喷雾法和本发明方法制备发酵前包被酵母菌微胶囊的比较 0035 1、 酵母菌种子液的培养 ： 采用对数生长期菌体作为包被用种子液 ； 0036 2、 囊材溶液的。
17、配制 ： 在不断搅拌下分批将海藻酸钠加入蒸馏水， 搅拌制成为透明 胶液， 配制成浓度为 15g/L 的海藻酸钠溶液， 115灭菌 20 分钟， 备用 ； 0037 3、 水相混合液的配制 ： 称取 0.3g CaCO3于烧杯中， 加 2ml 无菌水搅拌充分后灭菌， 然后加入步骤 （2） 配制的海藻酸钠溶液至 20ml， 混合均匀， 加入对数生长期的酵母菌种子 液， 至密度为 106cfu/ml 左右， 加入 0.2g 大豆肽后， 再次充分混匀作为水相。 0038 4、 油相混合液的配制 ： 向 100ml 液体石蜡中加入 Span80， 作为油相， 所述 Span80 的体积百分含量为 0.1。
18、%。 0039 5、 沉降剂的配制 ： 配制浓度为 0.2mol/L 的氯化钙溶液， 115灭菌 20min， 4冰箱 保存备用。 0040 6、 生物微胶囊的制备 ： 0041 （1） 本发明方法 ： 在400500rpm的搅拌速度下， 按照水相与油相体积比为1:5的 比例， 向油相中缓慢加入水相， 搅拌 2min， 然后逐滴加入冰醋酸， 固定化 10min， 停止搅拌， 其中冰醋酸与油相的体积比为 1:500， 再按照与水相体积比为 1:10 的比例， 向反应体系中 加入沉降剂， 微胶囊缓慢沉降， 分离微胶囊， 用清水清洗 1 2 次， 得微胶囊直径为 100-400 微米。 0042 （。
19、2） 挤压喷雾法 ： 将处于对数生长期的酵母菌混入海藻酸钠溶液中， 酵母菌密度 106cfu/ml 左右密度， 将海藻酸钠和酵母菌混合液用高压空气经喷头挤压进入 CaCl2溶液 中， 固化反应 15 分钟。分离微胶囊， 用清水清洗 1 2 次。 0043 7、 包被后培养 ： 将两种工艺制备的酵母菌微胶囊接入发酵液中， 培养至对数生长 末期， 过滤分离微胶囊即得微囊化益生菌湿产品， 如图 1A 和图 1B 所示。其中， 图 1A 所示， 挤压喷雾法发酵前包被酵母菌微胶囊球形度差， 粘连严重， 经计算得产品得率为 78%。图 1B 所示， 本发明方法发酵前包被酵母菌微胶囊球形度好， 不存在粘连，。
20、 产品得率为 96%。此外， 经激光粒度仪测定微胶囊粒径和单分散性 （CV 值） 如图 2 所示。其中单分散系数 CV=（/ d） 100%， 其中 d 为微胶囊平均直径， 为标准偏差 = （di-d） 21/2/n， di 为第 i 个微 胶囊， n 为微胶囊个数。CV 值越小， 微胶囊单分散性越好。本发明方法制备发酵前包被酵母 菌微胶囊粒径约为 200m， CV=30.1% 单分散性好 ； 挤压喷雾法制备发酵前包被酵母菌微胶 说 明 书 CN 103275962 A 5 4/5 页 6 囊粒径大于 1000m， CV=65%， 单分散性差。 0044 实施例 2 ： 含有大豆肽和酵母菌微胶。
21、囊的制备 0045 1、 酵母菌种子液培养 ： 采用对数生长期菌体作为包被用种子液 ； 0046 2、 囊材溶液的配制及灭菌 ： 在不断搅拌下分批将海藻酸钠加入蒸馏水， 搅拌制成 为透明胶液， 配制成浓度为 10g/L 的海藻酸钠溶液， 115下灭菌 20 分钟， 备用 ； 0047 3、 水相混合液的配制 ： 称取 0.3g CaCO3于烧杯中， 加 2ml 无菌水水搅拌充分灭菌， 然后加入步骤 （2） 配制的海藻酸钠溶液至 20ml， 混合均匀， 加入对数生长期的酵母菌种子 液， 至密度为 106cfu/ml 左右， 加入 0.16g 大豆肽后， 再次充分混匀作为水相。 0048 4、 油。
22、相混合液的配制 ： 100ml液体石蜡中加入Span80， 作为油相， 所述Span80的体 积百分含量为 0.3%。 0049 5、 沉降剂的配制 ： 配制浓度为 0.1mol/L 的氯化钙溶液， 115灭菌 20 分钟， 备用。 0050 6、 生物微胶囊的制备 ： 在 400 500rpm 的搅拌速度下， 按照水相与油相体积比 为 1:3 的比例， 向油相中缓慢加入水相， 保持转速， 搅拌 5min， 然后逐滴加入冰醋酸， 固定化 15min， 停止搅拌， 其中冰醋酸与油相的体积比为 1:600， 再按照与水相体积比为 1:20 的比 例， 向反应体系中加入沉降剂， 微胶囊缓慢沉降， 分。
23、离微胶囊， 用清水清洗 1 2 次， 得微胶 囊直径为 100-400 微米， 微胶囊得率为 95%， CV=21%。分离后收集油相用于下一批微胶囊制 备。 0051 7、 包被后培养 ： 将包有酵母菌细胞的微胶囊接入发酵液中， 培养至对数生长末期， 过滤分离微胶囊即得微囊化益生菌湿产品， 得产品如图 3 所示。 0052 实施例 3 ： 含有大豆肽和酵母菌微胶囊干产品的制备 0053 采用实例 2 所得湿微胶囊产品进行两种方法干燥 ： 0054 （1） 按质量百分比 10% 的量向微胶囊湿产品中加入淀粉， 搅拌均匀， 45干燥 3 小 时， 得微囊化益生菌干产品。如图 4 所示。 0055 。
24、（2） 将微胶囊分离， 45干燥 3 小时， 得微囊化益生菌干产品， 如图 5 所示。 0056 由图 4 可见， 本发明干燥方法所得微胶囊干产品成细小颗粒状， 微胶囊间无粘连 现象， 微胶囊很好的保持了湿状态下的形态， 呈球形的微胶囊干产品得率近 100%， 且产品保 持了很好的色泽。由图 5 可见， 用目前常用的微胶囊干燥方法， 得干微胶囊产品粘连现象非 常严重， 由于多个微胶囊之间的粘连， 造成干产品多成不规则片状结构， 失去了微胶囊产品 的优势和意义， 呈球形的微胶囊干产品得率仅 20% 左右。 0057 实施例 4 ： 含有大豆分离蛋白和乳酸菌微胶囊的制备 0058 1、 乳酸菌种子。
25、液培养 ： 采用对数生长期菌体作为包被用种子液 ； 0059 2、 囊材溶液的配制及灭菌 ： 在不断搅拌下分批将海藻酸钠加入蒸馏水， 搅拌制成 为透明胶液， 配制成浓度为 20g/L 的海藻酸钠溶液， 115下灭菌 20 分钟， 备用 ； 0060 3、 水相混合液的配制 ： 称取 0.2g CaCO3于烧杯中， 加 2ml 无菌水搅拌充分后灭菌， 然后加入步骤 （2） 配制的海藻酸钠溶液至 20ml， 混合均匀， 加入对数生长期的酵母菌种子 液， 至密度为 106cfu/ml 左右， 加入 0.2g 大豆分离蛋白后， 再次充分混匀作为水相。 0061 4、 油相混合液的配制 ： 100ml 。
26、液体石蜡中加入 Span80 作为油相， 所述 Span80 的体 积百分含量为 0.2%。 0062 5、 沉降剂的配制 ： 配制浓度为 0.3mol/L 的氯化钙溶液， 115灭菌 20 分钟， 备用。 说 明 书 CN 103275962 A 6 5/5 页 7 0063 6、 生物微胶囊的制备 ： 在 400 500rpm 的搅拌速度下， 按照水相与油相体积比 为 1:4 的比例， 向油相中缓慢加入水相， 保持转速， 搅拌 5min， 然后逐滴加入冰醋酸， 固定化 10min， 停止搅拌， 其中冰醋酸与油相的体积比为 1:500， 再按照与水相体积比为 1:15 的比 例， 向反应体系。
27、中加入沉降剂， 微胶囊缓慢沉降， 分离微胶囊， 用清水清洗 1 2 次， 得微胶 囊直径为 100-400 微米， 微胶囊得率为 96.1%， CV=23%。 0064 7、 包被后培养 ： 将包有乳酸菌细胞的微胶囊接入发酵液中， 培养至对数生长末期， 过滤分离微胶囊即得微囊化益生菌湿产品， 得产品如图 6 所示。 0065 8、 按质量百分比 10% 的量向微胶囊湿产品中加入淀粉， 搅拌均匀， 45干燥 3 小 时， 得微囊化益生菌干产品。如图 7 所示。 0066 显然， 本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例， 而并非是对 本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说， 在上述说明的基础上还可 以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发 明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。 说 明 书 CN 103275962 A 7 1/4 页 8 图 1A 图 1B 说 明 书 附 图 CN 103275962 A 8 2/4 页 9 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 103275962 A 9 3/4 页 10 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 103275962 A 10 4/4 页 11 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 103275962 A 11 。