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1、(10)申请公布号 CN 102676613 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676613 A *CN102676613A* (21)申请号 201210159448.9 (22)申请日 2012.05.22 C12P 19/14(2006.01) C07H 1/06(2006.01) C07H 11/00(2006.01) C08B 37/08(2006.01) C25B 7/00(2006.01) (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号江南大学食品学院 (72)发明人 金征宇 王金鹏 张莲 徐学明 谢正军 赵建伟 周。
2、星 焦爱权 杨哪 陈晓明 田耀旗 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 32104 代理人 时旭丹 刘品超 (54) 发明名称 一种硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖的制备方法 (57) 摘要 一种硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖的制备方 法， 属于食品技术领域。 本发明以硫酸软骨素为原 料， 采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡 糖， 经G-25凝胶过滤分离、 G-10脱盐、 DEAE纤维素 52 阴离子交换色谱柱分离、 天然制备凝胶电泳分 离等， 制备得到硫酸软骨素二糖、 四糖及六糖。本 发明涉及的一种硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖的制 备方法， 首次实现了三种硫酸软骨素寡糖的同时 。
3、制备， 为单一聚合度硫酸软骨素寡糖的工业制备 提供了技术依据。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/2 页 2 1. 一种硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖的制备方法， 其特征在于， 以硫酸软骨素为原料， 采 用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡糖， 经 G-25 凝胶过滤分离、 G-10 脱盐、 DEAE 纤维 素 52 阴离子交换色谱柱分离、 天然制备凝胶电泳分离， 制备得到硫酸软骨素二糖、 四糖及 六糖 ； 具体步骤为 ： （1） 硫酸软骨素。
4、的酶法降解 将 0.2 g 硫酸软骨素溶解于 10 mL pH 5.9 的磷酸盐缓冲液中， 置于 37保温 10 min， 使其与反应温度达到一致， 后向底物溶液中加入透明质酸酶 HAase， 使其酶活为 1.4105 u/L， 以150转/分钟的振荡速度振荡反应22h-24h ； 反应结束后， 加热煮沸20min使酶失活， 4000r/min 离心 15min， 取上清液加 3 倍体积 95% 乙醇沉淀， 静置， 用 10mL 无水乙醇脱水 3 次， 真空干燥得硫酸软骨素寡糖 ； （2） 硫酸软骨素寡糖的凝胶过滤分离 将处理好的 Sephadex G-25 装成 1.6150 cm 的玻璃层。
5、析柱， 用去离子水将硫酸软骨 素寡糖配制成 40 mg/mL 的溶液， 上样量 1 mL， 用 5 倍柱体积的超纯水以 4 mL/min 流速洗 脱， 用分布收集器 Redfrac 95 定时自动收集， 4mL/ 管， 用咔唑反应检测糖醛酸含量以确定 糖的出峰位置 ； （3） G-10 脱盐 ： 收集到的样品 40旋转蒸发浓缩后经 Sephadex G-10， 1.6150 cm， 脱 盐分离以后， 浓缩样品到 50mL， 再冻干， 以捕获自由基能力为检测指标， 筛选出抗氧化活性 最高的硫酸软骨素寡糖， 作为下一步分离对象 ； （4） 硫酸软骨素寡糖的阴离子交换分离 装柱 ： 将浸泡好的DEA。
6、E纤维素52， 沿玻璃棒缓慢加入到层析柱中2cm20cm， 避免胶中 气泡产生， 如果产生气泡， 用玻璃棒轻轻搅拌， 使气泡溢出， 根据重力作用使凝胶慢慢沉降， 并保持表面平整 ； 预平衡 ： 层析柱接好恒流泵后， 用超纯水平衡柱子， 以 2mL/min 的速率洗脱 3-5 个柱体 积至基线平稳 ； 样品处理 ： 将步骤 （3） 筛选出的硫酸软骨素寡糖用超纯水溶解至10 mL， 上样到DEAE纤 维素 52 阴离子交换柱 ； 洗脱 ： 上样1mL， 用0-1mol/L NaCl梯度洗脱75min， 洗脱速率为2mL/min， 210nm紫外检 测 ； 收集各洗脱峰 ； （4） 硫酸软骨素二糖、。
7、 四糖、 六糖的天然制备凝胶电泳分离 溶液配制 ： A 液 ： 硼酸 0.1mol/L， Tris 0.1mol/L， 乙二胺四乙二酸 0.01 mol/L， 加水溶解使 pH8.3 ； 质量浓度5%的浓缩胶 ： 每100 mL浓缩胶含丙烯酰胺4.75 g、 甲叉双丙烯酰胺0.25 g， 并用盐酸调 pH 6.3 ； 每 3mL 浓缩胶加入 10% 过硫酸铵水溶液 100L， TEMED10L ； 质量浓度 35% 的分离胶 ： 每 100 mL 分离胶含丙烯酰胺 31.82 g、 甲叉双丙烯酰胺 3.18 g 和蔗糖 15 g ； 每 10mL 分离胶加入 10% 过硫酸铵水溶液 200L，。
8、 TEMED 20L ； 分离胶和浓缩胶均用 A 液配制 ； 电极缓冲液 ： 甘氨酸 1.25 mol/L， Tris 0.2 mol/L， 加水溶解使 pH 8.3 ； 上样 ： 将经 DEAE-52 阴离子交换色谱分离的洗脱峰上样 ； 权 利 要 求 书 CN 102676613 A 2 2/2 页 3 电泳条件 ： 室温， 400V， 4-5h ； 染色 ： 0.5% 甲苯胺蓝溶于 2% 乙酸溶液中， 染色 10min ； 脱色 ： 2% 乙酸脱色 ； 样品收集 ： 样品脱色后， 分别将电泳条带中含量最多组分剪下， 捣碎， 置于 1mL PBS 溶 液中震荡， 12h后离心， 取上清液，。
9、 置于4保存， 沉淀继续置于1mL PBS溶液中震荡， 重复三 次后， 将三次所得上清液过 AKTA superdex peptide 柱脱盐， 冷冻干燥即得硫酸软骨素二 糖、 四糖、 六糖。 权 利 要 求 书 CN 102676613 A 3 1/4 页 4 一种硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖的制备方法 技术领域 0001 一种硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖的制备方法， 属于食品工业技术领域。 背景技术 0002 硫酸软骨素 （CS） ， 作为糖胺聚糖的一种， 是三种最重要的糖胺聚糖之一。它由 D- 葡糖醛酸与 N- 乙酰 -D- 氨基半乳糖酸硫酸酯组成， 是广泛存在于人类和动物的喉骨、 。
10、鼻 中隔、 气管等软骨组织中的一类酸性黏多糖。高分子质量的 CS 表现出高的生物活性， 如抗 癌症、 抗动脉粥样硬化作用、 抗炎、 免疫调节、 抗氧化等， 不仅在细胞转移、 分化、 增殖、 识别 以及组织形成等生物过程中起到了重要的作用， 并已用于医药及临床的应用。但由于高分 子量， 高表观粘度、 低水溶性及复杂的结构， 大部分高分子多糖很难通过组织屏障与细胞内 部的受体结合。且由于细胞膜的选择透过性等因素， 临床应用中大部分糖胺聚糖面临生物 利用率较低的主要问题。最近几年， 低分子质量 CS 的功能特性越来越受到人们的重视。与 其它糖胺聚糖， 如透明质酸， 硫酸类肝素相比， 低分子量CS的研。
11、究相对落后。 目前国内对CS 的研究主要集中于 CS 的提取、 生理活性及衍生物等方面， 对 CS 寡糖的研究未见报道， 国际 上对 CS 寡糖的分离提纯报道也不多， 单一寡糖的研究较少。本发明涉及的一种硫酸软骨素 二糖、 四糖、 六糖的制备方法， 以硫酸软骨素为原料， 采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软 骨素寡糖， 经 G-25 凝胶过滤分离、 G-10 脱盐、 DEAE 纤维素 52 阴离子交换色谱柱分离、 天然 制备凝胶电泳分离等， 制备得到硫酸软骨素二糖、 四糖及六糖， 首次实现了三种硫酸软骨素 寡糖的同时制备， 为单一聚合度硫酸软骨素寡糖的工业制备提供了技术依据 ； 为糖类化合 物的糖。
12、库的建立及糖类药物的筛选提供重要的分离手段 ； 可为临床药物的生产提供一定的 依据。 发明内容 0003 本发明的目的在于提供一种硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖的制备方法。 0004 本发明的技术方案 ： 一种硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖的制备方法， 以硫酸软骨素 为原料， 采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡糖， 经 G-25 凝胶过滤分离、 G-10 脱盐、 DEAE 纤维素 52 阴离子交换色谱柱分离、 天然制备凝胶电泳分离等， 制备得到硫酸软骨素二 糖、 四糖及六糖。步骤为 ： （1） 硫酸软骨素的酶法降解 将 0.2 g 硫酸软骨素溶解于 10 mL pH 5.9 的磷酸盐缓冲液。
13、中， 置于 37保温 10 min， 使其与反应温度达到一致， 后向底物溶液中加入透明质酸酶 HAase， 使其酶活为 1.4105 u/L， 以150转/分钟的振荡速度振荡反应22h-24h ； 反应结束后， 加热煮沸20min使酶失活， 4000r/min 离心 15min， 取上清液加 3 倍体积 95% 乙醇沉淀， 静置， 用 10mL 无水乙醇脱水 3 次， 真空干燥得硫酸软骨素寡糖 ； （2） 硫酸软骨素寡糖的凝胶过滤分离 将处理好的 Sephadex G-25 装成 1.6150 cm 的玻璃层析柱， 用去离子水将硫酸软骨 说 明 书 CN 102676613 A 4 2/4 页。
14、 5 素寡糖配制成 40 mg/mL 的溶液， 上样量 1 mL， 用 5 倍柱体积的超纯水以 4 mL/min 流速洗 脱， 用分布收集器 Redfrac95 定时自动收集， 4mL/ 管， 用咔唑反应检测糖醛酸含量以确定糖 的出峰位置 ； （3） G-10 脱盐 ： 收集到的样品 40旋转蒸发浓缩后经 Sephadex G-10， 1.6150 cm， 脱 盐分离以后， 浓缩样品到约 50mL， 再冻干， 以捕获自由基能力为检测指标， 筛选出抗氧化活 性最高的硫酸软骨素寡糖， 作为下一步分离对象 ； （4） 硫酸软骨素寡糖的阴离子交换分离 装柱 ： 将浸泡好的DEAE纤维素52， 沿玻璃棒。
15、缓慢加入到层析柱中2cm20cm， 避免胶中 气泡产生 （如果产生气泡， 可用玻璃棒轻轻搅拌， 使气泡溢出） ， 根据重力作用使凝胶慢慢沉 降， 并保持表面平整 ； 预平衡 ： 层析柱接好恒流泵后， 用超纯水平衡柱子， 以 2mL/min 的速率洗脱 3-5 个柱体 积至基线平稳 ； 样品处理 ： 将步骤 （3） 筛选出的硫酸软骨素寡糖用超纯水溶解至10 mL， 上样到DEAE纤 维素 52 阴离子交换柱 ； 洗脱 ： 上样1mL， 用0-1mol/L NaCl梯度洗脱75min， 洗脱速率为2mL/min， 210nm紫外检 测 ； 收集各洗脱峰 ； （4） 硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖的。
16、天然制备凝胶电泳分离 溶液配制 ： A液 ： 硼酸0.1mol/L， Tris 0.1mol/L， 乙二胺四乙二酸0.01 mol/L， 加水溶解使pH8.3。 0005 质量浓度5%的浓缩胶 ： 每100 mL浓缩胶含丙烯酰胺4.75 g、 甲叉双丙烯酰胺0.25 g， 并用盐酸调 pH 6.3 ； 每 3mL 浓缩胶加入 10% 过硫酸铵水溶液 100L， TEMED10L。 0006 质量浓度 35% 的分离胶 ： 每 100 mL 分离胶含丙烯酰胺 31.82 g、 甲叉双丙烯酰胺 3.18 g 和蔗糖 15 g。每 10mL 分离胶加入 10% 过硫酸铵水溶液 200L， TEMED。
17、 20L。 0007 分离胶和浓缩胶均用 A 液配制。 0008 电极缓冲液 ： 甘氨酸 1.25 mol/L， Tris 0.2 mol/L， 加水溶解使 pH 8.3。 0009 上样 ： 将经 DEAE-52 阴离子交换色谱分离的洗脱峰上样。 0010 电泳条件 ： 室温， 400V， 4-5h。 0011 染色 ： 0.5% 甲苯胺蓝溶于 2% 乙酸溶液中， 染色 10min。 0012 脱色 ： 2% 乙酸脱色。 0013 样品收集 ： 样品脱色后， 分别将电泳条带中含量最多组分剪下， 捣碎， 置于1mL PBS 溶液中震荡。12h 后离心， 取上清液， 置于 4保存。沉淀继续置于 。
18、1mL PBS 溶液中震荡。重 复三次后， 将三次所得上清液过AKTA superdex peptide柱脱盐， 冷冻干燥即得硫酸软骨素 二糖、 四糖、 六糖。 0014 本发明的有益效果 ： 本发明方法首次实现了硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖三种硫酸 软骨素寡糖的制备， 首次实现了三种硫酸软骨素寡糖的同时制备， 为单一聚合度硫酸软骨 素寡糖的工业制备提供了技术依据。 附图说明 0015 图 1 ： 硫酸软骨素寡糖的 DEAE 纤维素 52 层析图。 说 明 书 CN 102676613 A 5 3/4 页 6 0016 图 2 ： 硫酸软骨素寡糖的制备 PAGE 电泳图。A 为图 1 中 A。
19、 峰的 PAGE 电泳图， B 为 图 1 中 B 峰的 PAGE 电泳图， C 为图 1 中 C 峰的 PAGE 电泳图 ； 图中画圈部分为提供下一步经 凝胶过滤色谱柱进行分子量鉴定的组分 a、 b、 c。 0017 图 3 ： 硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖分子量测定图。a 为图 2 中组分 a（硫酸软骨素 二糖） 分子量测定图、 b 为图 2 中组分 b（硫酸软骨素四糖） 分子量测定图、 c 为图 2 中组分 c（硫酸软骨素六糖） 分子量测定图。 具体实施方式 0018 实施例 1 1、 酶法降解制备硫酸软骨素寡糖 将 0.2 g 硫酸软骨素溶解于 10 mL pH 5.9 的磷酸盐缓冲。
20、液中， 置于 37保温 10 min， 使其与反应温度达到一致， 后向底物溶液中加入透明质酸酶 （HAase， 来自牛睾丸） ， 使其酶 活为 1.4105 u/L， 150 转 / 分钟振荡反应 22h。反应结束后， 加热煮沸 20min 使酶失活， 4000r/min 离心 15min， 取上清液加 3 倍体积 95% 乙醇沉淀， 静置， 用 10mL 无水乙醇脱水 3 次， 真空干燥得硫酸软骨素低聚糖 A， 并测定所得降解产物的总抗氧化活性 （TOA） 。 0019 2、 总抗氧化活性的测定 据总抗氧化能力 （TOA） 测定试剂盒说明书测定。 0020 测定原理 ： 机体中有许多抗氧化物。
21、质， 能使 Fe3+还原成 Fe2+， 后者可与菲啉类物质 形成稳固的络合物， 通过比色可测出其抗氧化能力的高低。 0021 在 37时， 每分钟每毫升溶液使反应体系的吸光度 （OD） 值每增加 0.01， 为一个总 抗氧化能力单位。 0022 3、 硫酸软骨素寡糖的凝胶过滤分离 将处理好的 Sephadex G-25 装成 1.6150 cm 的玻璃层析柱， 用去离子水将 o-CS 配制 成 40 mg/mL 的溶液， 上样量 1 mL， 用 5 倍柱体积的超纯水以 4 mL/min 流速洗脱， 用分布收 集器 (Redfrac95) 定时自动收集， 4mL/ 管， 用咔唑反应检测糖醛酸含量。
22、以确定糖的出峰位 置。收集到的样品 40旋转蒸发浓缩后经 Sephadex G-10 （1.6150 cm） 脱盐。分离以后 浓缩样品到一定的体积再冻干。以总抗氧化活性 （TOA） 为检测指标筛选出抗氧化活性最高 的低分子量 CS 作为下一步分离对象。 0023 4、 咔唑反应检测糖醛酸含量 咔唑试液的配制 ： 咔唑 0.0625g， 加无水乙醇 50mL， 震荡使溶解， 即得。 0024 硼砂硫酸液 ： 四硼酸钠 2.385g， 溶于浓硫酸 500mL， 即得。 0025 标准曲线的制作 ： CS 标准品 500mg 溶于 10mL 水中。精密量取 CS 标准液 0.0mL， 0.1mL， 。
23、0.2mL， 0.3mL， 0.4mL， 0.5mL， 置于具塞试管中， 各加水至 1mL 摇匀， 冷却至 4左右。后振摇下缓缓加入硼 砂硫酸液 5mL， 将试管置于沸水浴中加热 10min， 置常温水中冷却至室温。精密加入咔唑试 液0.2mL， 混匀， 置沸水浴中再加热15min， 冷却至室温。 在波长530nm处测定吸光度A， 以吸 光度 A 对浓度 C 作图绘制标准曲线。 0026 5、 硫酸软骨素寡糖的阴离子交换分离 装柱 ： 将浸泡好的DEAE纤维素52， 沿玻璃棒缓慢加入到层析柱中 （2cm20cm） ， 避免胶 说 明 书 CN 102676613 A 6 4/4 页 7 中气泡。
24、产生 （如果产生气泡， 可用玻璃棒轻轻搅拌， 使气泡溢出） 。根据重力作用使凝胶慢慢 沉降， 并保持表面平整。 0027 预平衡 ： 层析柱接好恒流泵后， 用超纯水平衡柱子， 以 2mL/min 的速率洗脱 3-5 个 柱体积至基线平稳。 0028 样品处理 ： 经凝胶过滤分离筛选出的抗氧化活性最高的组分冻干粉用超纯水溶解 至 10mL， 上 DEAE 纤维素 52 阴离子交换柱进行进一步分离。 0029 洗脱 ： 上样1mL， 用0-1mol/L NaCl梯度洗脱75min， 洗脱速率为2mL/min， 210nm紫 外检测 ； 收集各洗脱峰 （图 1） 。 0030 6、 硫酸软骨素二糖、。
25、 四糖、 六糖的天然制备电泳分离 溶液配制 ： A液 ： 硼酸0.1mol/L， Tris 0.1mol/L， 乙二胺四乙二酸0.01 mol/L， 加水溶解使pH8.3。 0031 5% 浓缩胶 ： 每 100 mL 浓缩胶含丙烯酰胺 4.75 g、 甲叉双丙烯酰胺 0.25 g， 并用盐 酸调 pH 6.3。每 3mL 浓缩胶加入 10% 过硫酸铵水溶液 100L， TEMED10L。 0032 35% 分离胶 ： 每 100 mL 分离胶含丙烯酰胺 31.82 g、 甲叉双丙烯酰胺 3.18 g 和蔗 糖 15 g。每 10mL 分离胶加入 10% 过硫酸铵水溶液 200L， TEMED。
26、20L。 0033 分离胶和浓缩胶均用 A 液配制。 0034 电极缓冲液 ： 甘氨酸 1.25 mol/L， Tris 0.2 mol/L， 加水溶解使 pH 8.3。 0035 上样 ： 将经 DEAE-52 阴离子交换色谱分离的洗脱峰上样。 0036 电泳条件 ： 室温， 400V， 4-5h。 0037 染色 ： 0.5% 甲苯胺蓝溶于 2% 乙酸溶液中， 染色 10min。 0038 脱色 ： 2% 乙酸脱色。 0039 样品收集 ： 样品脱色后， 分别将电泳条带中含量最多组分剪下， 捣碎， 置于1ml PBS 溶液中震荡。12h 后离心， 取上清液， 置于 4保存。沉淀继续置于 1。
27、ml PBS 溶液中震荡。重 复三次后， 将三次所得上清液过AKTA superdex peptide柱脱盐， 冷冻干燥即得硫酸软骨素 二糖、 四糖、 六糖 （图 2） 。 0040 7、 硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖的分子量的测定 采用高效凝胶过滤色谱 （HPGPC） 法测定分离所得硫酸软骨素二糖、 四糖、 六糖 （图 3） 。 色谱柱 ： UltrahydrogelLinear 300mm7.8mmid2 ； 流动相 ： 0.1mol/L NaNO3； 流速 ： 0.9 mL/min ； 柱温 ： 45 ； 检测器 ： 2410 示差折光检测器。 说 明 书 CN 102676613 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102676613 A 8 2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 102676613 A 9 。