技术领域
本发明涉及一种从红花鹿蹄草提取物中分离纯化梅笠草素的方法，属于植物次生代谢产 物分离纯化领域。
背景技术
红花鹿蹄草（PyrolaincarnataFisch.）为鹿蹄草科鹿蹄草属多年生常绿草本，主要分布在 我国的东北、内蒙古、新疆、河北、山西等省份，在朝鲜、日本、蒙古等国家也有分布。红 花鹿蹄草全草供药用，具有祛风湿、强筋骨、解毒、止血等功效。通过对鹿蹄草科鹿蹄草属 的药理研究，证明其具有抗菌、抗病毒、抗炎的作用。鹿蹄草属植物对心脑血管系统的作用 表现为有明显的扩张血管作用，通过cAMP含量的增高,增加离体四肢、耳、冠状动脉与脑 部血流量，还能增加心肌营养性血流量，降低脑血管阻力。鹿蹄草属植物还具有止咳、平喘、 祛痰的作用，对急慢性气管炎，肺结核也有疗效。鹿蹄草属植物的药性平缓，应用于临床未 见任何不良反应，是一种安全有效的药物。在临床上鹿蹄草属植物主要被用于治疗心血管疾 病、慢性痢疾等细菌感染以及椎动脉型颈椎病等。
梅笠草素即3,7-二甲基-1,4-萘醌，为鹿蹄草属植物所特有的次生代谢物，在临床上应用 于对心动过缓和心力衰竭等症状的改善和缓解。梅笠草素是鹿蹄草属植物的一种主要抗菌消 炎的活性成份，其对金黄色葡萄球菌、伤寒杆菌、志贺氏菌、福式痢疾杆菌等固紫色染色阳 性及阴性菌都有较强的抑制效果。
现有的从鹿蹄草中提取梅笠草素的方法，如申请号为CN102241578的中国专利，通过将 鹿蹄草粉碎，用乙醇作为夹带剂，利用超临界CO2萃取技术进行萃取，在采用柱层析对萃取 物进行纯化分离。此方法对设备的要求较高，其萃取过程在高压力下进行给工业化带来一定 的难度，并且成本较高。
本发明是一种简便安全经济高效地分离纯化梅笠草素的方法。本发明旨在建立一种通过 多种现代分离技术手段相结合的方法，实现简单快速、损失少且绿色环保的分离纯化梅笠草 素的目的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以新鲜或干燥的红花鹿蹄草全株为原料，通过匀浆诱导、酶 水解、负压空化提取技术、超声波震荡絮凝技术、液固萃取技术、中压正相硅胶柱层析分离 技术及低温析晶和重结晶技术，从而快速、大量获得梅笠草素单体。该方法分离纯化工艺简 单易行，操作安全，产品得率高，纯度高，适用于工业应用。本发明目的是通过以下方案来 实现的：
将新鲜或干燥的红花鹿蹄草进行匀浆诱导、酶水解，然后采用负压空化提取技术进行提 取，将诱导和酶水解及负压空化提取液浓缩后加入到30-50°C温水中，通过超声波振荡、静 止絮凝，所得絮凝物经液固萃取和一次中压正相硅胶柱层析后得到梅笠草素粗品，经过低温 析晶和重结晶得到纯度均大于95%的单体。
上述梅笠草素单体的提取纯化方法，其特征在于，取一定量新鲜或干燥的红花鹿蹄草原 料进行匀浆诱导，匀浆诱导所用的溶剂为水，温度30-50°C，体积为固体质量的3-8倍，连续 匀浆诱导3次，每次5-10分钟。将匀浆诱导后的浆液用柠檬酸、冰醋酸或盐酸中的一种调pH 为3.0-6.0作为缓冲液，取0.1-2%固形物重量的纤维素酶、果胶酶、葡萄糖苷酶的任意两种组 合的复合酶，将复合酶放入缓冲液中，在40-60°C水浴中激活5-15分钟，将激活后的复合酶 缓冲液加入匀浆诱导浆液中，用酶对其进行水解，酶水解温度为30-50°C，酶解2-5小时。将 匀浆诱导和酶水解后的固形物用70-90%乙醇进行负压空化提取，所选负压为0.03-0.08MPa， 固液比为1:10-1:30（g：mL），室温提取1-5次，每次提取30-90分钟。将红花鹿蹄草诱导和 酶水解及负压空化提取物浓缩后加入到30-50°C的温水中，体积为提取物体积的3-8倍，置 于超声波振荡提取器中30-60KHz条件下振荡絮凝10-25分钟，静止15-30分钟，超声波的 作用使得粘稠絮凝物中包含的极性较大的杂质逐渐溶出，得到粘稠絮凝物。对絮凝物进行液 固萃取，萃取所用的溶剂与提取物质量的比为5-20:1（mL:g），萃取次数为5-10次，所用溶 剂为石油醚、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷或二氯甲烷中的一种，将有机相回收后可得目标 固形物，浓缩萃取液至干。预先称取质量为提取物质量10-20倍300-400目的硅胶，采用湿 法装柱，所用溶剂为石油醚或正己烷。将所得萃取液浓缩至干，所得固形物用有机溶剂溶解， 加入与浸膏质量比为1.2:1(w/w)的硅胶拌匀、减压旋干，装入预先装好的硅胶柱中。先后以 10BV石油醚或正己烷、5-50BV石油醚或正己烷:乙酸乙酯或氯仿为80:1-15:1、甲醇连续中压 洗脱，收集洗脱液，每份150-250mL，用硅胶薄层层析检测洗脱液成分，合并相同部分，展 开剂为石油醚或正己烷：乙酸乙酯或三氯甲烷=30:1-10:1，紫外波长为254nm和365nm。得 到梅笠草素溶液，低温析晶得到粗品，重结晶后得到纯品。
上述负压空化是以负压为动力，利用气泡产生的空化效应、湍流效应而产生的高速传质 液固提取工艺。所谓空化，一般是指液体内部局部压力降低时，液体内部或液固交界面上蒸 汽或气体的空化（空泡）的形成、发展和溃灭的过程。但溃灭发生在固体表面附近时，由于 空泡瞬间溃灭产生极高的瞬时压强，极高的压强反复作用，从而破坏固体表面。
上述红花鹿蹄草中梅笠草素的提纯方法所用硅胶为300-400目。硅胶柱流动相包括石油 醚、正己烷：乙酸乙酯、氯仿的不同比例梯度。
重结晶所用的溶剂为石油醚、正己烷、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷和甲醇中的两种， 以30:1-10:1的比例混合，温度为-4-20°C。
本发明的优点：
1.本发明采用负压空化提取技术进行提取，利用负压空化气泡产生强烈的空化效应和机 械振动，造成样品细胞壁快速破裂，加速了胞内物质向外释放、扩散和溶解，从而促 进提取。
2.本发明采用先进的匀浆诱导、酶水解、超声波震荡絮凝技术、中压正相硅胶柱层析分 离技术及低温析晶和重结晶技术用于梅笠草素的提取分离，所得产品得率高，纯度高。
3.与传统的提取方法相比，本发明操作条件温和，提取温度低，提取率高，周期短，耗 能低，降低了生产成本，。
4.设备简单方法易行，可大规模投入生产。
具体实施方案
实施例1
以干燥的红花鹿蹄草为原料，称取1000g，加入5倍体积40°C的温水连续诱导3次，每次诱 导5分钟，用冰醋酸将匀浆诱导好的浆液调pH为4.5。取0.3%的固形物重量的纤维素酶和葡 萄糖苷酶组成的复合酶，溶于pH为4.5的缓冲溶液中，在45oC水浴中激活10分钟。然后与 匀浆液混匀，在40°C下酶解4小时，诱导液分离后的固形物使用70%的乙醇提取，以0.05MPa 负压为动力，固液比为1:15g/mL，提取三次，每次提取40分钟。将诱导和酶水解液及负压 空化提取液合并浓缩至干后将固体物质加入45°C温水3L，置于超声波提取器中50KHz条件 下振荡絮凝15分钟，静止20分钟，取粘稠絮凝物。用5L石油醚进行液固萃取，，萃取次数 为8次，浓缩萃取液至干。将固形物用少量乙酸乙酯溶解，称取提取物质量1.2倍的300-400 目硅胶均匀拌样，45°C减压蒸干。预先称取提取物质量10倍的300-400目硅胶，采用石油醚 湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱层析柱内，先后以5BV石油醚、10BV石油醚： 乙酸乙酯=80:1、10BV石油醚：乙酸乙酯=50:1、甲醇连续中压洗脱，收集流份并用TLC监 测，浓缩得到梅笠草素粗品。以石油醚：乙酸乙酯=3:1的混合溶剂在15oC下重结晶，得到 化合物为梅笠草素62mg，纯度为96.7%。
实施例2
以新鲜的红花鹿蹄草为原料，称取2000g，初步粉碎，加入8倍体积45°C的温水连续诱导5 次，每次诱导10分钟，用柠檬酸将匀浆诱导好的浆液调pH为4。取0.5%的固形物重量的果 胶酶和葡萄糖苷酶组成的复合酶，溶于pH为4的缓冲溶液中，在45oC水浴中激活10分钟； 然后与匀浆液混匀，在45oC下酶解3小时。诱导液分离后的固形物使用75%的乙醇提取，以 0.07MPa负压为动力，固液比为1:10g/mL，提取四次，每次提取50分钟。将诱导和酶水解液 及乙醇提取液合并浓缩至干后的固体物质中加入45oC温水3L，置于超声波提取器中60KHz 条件下振荡絮凝15分钟，静止25分钟，取粘稠絮凝物。用6L正己烷进行液固萃取，浓缩 萃取液至干。将浓缩至干后所得固形物用少量乙酸乙酯溶解，称取提取物质量1.2倍的300-400 目硅胶均匀拌样，45°C减压蒸干。预先称取提取物质量12倍的300-400目硅胶，采用正己烷 湿法装柱，最后将拌好样品的硅胶装入中压柱层析柱内，先后以5BV正己烷、10BV正己烷： 乙酸乙酯=80:1、10BV正己烷：乙酸乙酯=50:1、甲醇连续中压洗脱，收集流份并用TLC监 测，浓缩得到梅笠草素粗品，以正己烷：乙酸乙酯=5:1的混合溶剂在10oC下重结晶，得到化 合物为梅笠草素121mg，纯度为96.5%。
附图说明：
图1梅笠草素分子结构式
图2梅笠草素提取分离流程图