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1、(10)申请公布号 CN 102605042 A (43)申请公布日 2012.07.25 CN 102605042 A *CN102605042A* (21)申请号 201110022691.1 (22)申请日 2011.01.20 C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 上海生物芯片有限公司 地址 201203 上海市浦东新区李冰路 151 号 (72)发明人 刘寒梢 孟宪欣 张伟 张春秀 肖华胜 (74)专利代理机构 上海浦一知识产权代理有限 公司 31211 代理人 高月红 (54) 发明名称 miR-378生物标志物在胃癌检测、 诊断中的应 用 (57) 摘要 本发明公。
2、开了一种 miR-378 生物标志物在胃 癌检测、 诊断中的应用， 该 miR-378 生物标志物的 miRNA 序列如 SEQ ID NO.1 所示 ； 其检测的方法， 包括 ： 1) 收集人血清样本 ； 2) 提取血清中总 RNA ； 3) 对 miR-378 生物标志物进行反转录和实时定 量 PCR 反应， 以 U6snRNA 作为内参， 计算 miR-378 生物标志物的 PCR 相对定量值 ； 4) 当样本中的 miR-378 生物标志物的 PCR 相对定量值小于或等 于2.9时， 则认为是非胃癌样本， 大于2.9时， 则认 为是胃癌样本。 利用该生物标志物可以简单、 快捷 地进行胃。
3、癌检测、 诊断， 以便更好的治疗。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一种用于胃癌检测的 miRNA 生物标志物， 其特征在于 ： 所述 miRNA 生物标志物是如 SEQ ID NO.1 所示 miRNA 序列的 miR-378。 2.如权利要求1所述的用于胃癌检测的miRNA生物标志物， 其特征在于 ： 所述miR-378 在胃癌患者血清中的特异性表达上调。 3. 如权利要求 1 或 2 所述的 miR-378 生物标志。
4、物还应用于胃癌的诊断。 4. 如权利要求 1 所述的应用于 miR-378 生物标志物的实时定量 PCR 反应中的内参， 其 特征在于 ： 所述内参为 U6snRNA， 其引物序列如 SEQ ID NO.2 所示。 5. 如权利要求 1 所述的利用 miR-378 生物标志物进行胃癌检测的方法， 包括步骤 ： (1) 收集人血清样本 ； (2) 提取血清中总 RNA ； (3)对miR-378生物标志物进行反转录和实时定量PCR反应， 并计算miR-378生物标志 物的 PCR 相对定量值 ； (4)当样本中的miR-378生物标志物的PCR相对定量值小于或等于2.9时， 则认为是非 胃癌样本。
5、 ； 大于 2.9 时， 则认为是胃癌样本。 6. 如权利要求 5 所述的利用 miR-378 生物标志物进行胃癌检测的方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (1) 收集人血清样本的具体操作为 ： 将收集的人血样本放入不含 EDTA 的试管 中， 静置凝固后， 取上清在 4下 600g 900g 离心 5 15 分钟后， 再取上清， 并在 4下 12000g 16000g 离心 5 15 分钟， 取上清即得。 7. 如权利要求 5 所述的利用 miR-378 生物标志物进行胃癌检测的方法， 其特征在于 ： 所述步骤(3)中的实时定量PCR反应中， 以U6snRNA作为内参， 该内参的引物序列如SE。
6、Q ID NO.2 所示， miR-378 生物标志物的引物序列如 SEQ ID NO.3 所示 ； 并使用 2Ct公式来计算 miR-378 生物标志物的 PCR 相对定量值， 式中 Ct Ct生物标志物-CtU6。 8.如权利要求1所述的用于胃癌检测的miR-378生物标志物检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述检测试剂盒包括 ： 常规实时定量PCR试剂、 如SEQ ID NO.2所示的内参U6snRNA的检测 引物、 如 SEQ ID NO.3 所示的 miR-378 生物标志物的检测引物。 9.如权利要求8所述的用于胃癌检测的miR-378生物标志物检测试剂盒， 其特征在于 ： 所述常规实。
7、时定量 PCR 试剂包括 ： Taq 酶、 dNTP 试剂、 荧光试剂、 PCR 缓冲液、 DEPC 处理水。 权 利 要 求 书 CN 102605042 A 2 1/8 页 3 miR-378 生物标志物在胃癌检测、 诊断中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种内源性非编码小 RNA(MicroRNA， miRNA) 作为生物标志物的应用， 特别是涉及一种 miR-378(miRNA-378) 在胃癌检测和诊断中的应用。 背景技术 0002 胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一， 每年约有 100 万个新发病例， 男性胃 癌的死亡率为各种肿瘤的第二位， 女性则为第四位 【Garcia 。
8、M et al.2007.Global Cancer Facts & Figures 2007online.Accessed Aug 20， 2008.URL ： www.cancer.gov】 。而我国 是胃癌的高发区， 每年我国新发现 40 万胃癌患者， 约占世界胃癌发病人数的 42左右。由 于胃癌早期症状不明显， 又缺乏特异的早期诊断方法 【di Mario F et al.Non-invasive tests in gastric diseases.Dig Liver Dis 40 ： 523-530(2008)】 ， 现有的肿瘤标志物 CEA、 CA19-9、 CA50、 CA125。
9、 在胃癌中的敏感度与特异性不高， 对胃癌具较高特异性的 CA72-4 也通常在胃癌的 III-IV 期增高。胃癌的明确诊断通常在疾病的进展期才能做出， 而此时病 人的平均生存期只有 7 9 个月 【Wagner AD et al.Chemotherapy in advanced gastric cancer ： asystematic review and meta-analysis based on aggregate data.J Clin Oncol.24 ： 2903-2909(2006)】 。因而寻找利于早期诊断和早期治疗的生物标志物一直是胃 癌研究的热点。 0003 MicroRN。
10、A(miRNA) 是在动植物体内发现的长度约为 21 25 个核苷酸的非 编码 RNA 分子， 主要通过切断降解和翻译抑制来完成它对靶基因的负调控 【Reinhart BJ et al.The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timingin Caenorhabditis elegans.Nature 403， 901-906(2000) ； Brennecke J et al.Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell prolif。
11、eration and regulates the proapoptotic gene hid in Drosophila.Cell 113， 25-36(2003) ； Zeng Y etal.Sequence requirements for microRNA processing and function in human cells.RNA 9， 112-123(2003) ； Hake S et al.MicroRNAs ： A role in plant development. Curr.Biol.13， R851-R852(2003)】 。 由于它的序列、 结构、 丰度和表达方。
12、式的多样性， 使其在 真核基因表达调控中有着广泛的作用。作为人类肿瘤信号通路积极的参与者， miRNA 不仅 扮演着原癌基因和抑癌基因的角色 【Dews M et al.Augmentation of tumor angiogenesis by a Myc-activated microRNA cluster.NatGenet.38， 1060-1065(2006) ； He L et al.A microRNA polycistron as a potential human oncogene.Nature 435， 828-33(2005) ； Bonci D et al.The miR-。
13、15a-miR-16-1cluster controls prostate cancer by targeting multiple oncogenic activities.Nat Med.14， 1271-1277(2008)】 ，与 肿 瘤 的 转 移 凋 亡也有关联 【Huang Q et al.The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumor invasion and metastasis.Nat Cell Biol.10， 202-210(2008) ； Ma L et al.Tumour invasion and metastasi。
14、s initiated by microRNA-10b in breast cancer.Nature 449， 682-688(2007) ； Tavazoie SF et al.Endogenous human microRNAs that suppress 说 明 书 CN 102605042 A 3 2/8 页 4 breast cancer metastasis.Nature 451， 147-152(2008)】 。 由于不同的肿瘤显示出特异性 的miRNA表达谱 【Lu J et al.MicroRNA expression profiles classify human can。
15、cers. Nature 435， 834-838(2005)】 ， miRNA 在福尔马林固定的组织中有很高的稳定性 【Xi Y et al.Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples.RNA 13， 1668-1674(2007) ； Nelson PTet al.RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in 。
16、archivalhuman brain.RNA 12， 187-191(2006)】 ， 所以越来越多的科学家提出miRNA在血清 和血浆中也能有稳定的表达， 并可以作为潜在的新型肿瘤标志物。单个 miRNA 能够影响数 百个蛋白质表达， 21-25 个核苷酸的长度也决定了 miRNA 没有复杂的结构与修饰过程， 这些 特点都预示了 miRNA 作为生物学标志的优越性。已有研究发现， miR-141 在包括人前列腺 癌在内的上皮细胞性肿瘤患者血清中有明显的表达上调， 提示 miR-141 可以作为判断肿瘤 类型的生物学标志 【Patrick S et al.Circulating microR。
17、NAs as stable blood-based markers for cancer detection.PNAS.105， 10513-10518(2008)】 。缺乏明显临床症状及 有效生物学标志的卵巢癌患者也可以用血清 miRNA 检测来提高早期诊断及早期治疗的可 能性。科学家们发现并证实了 miR-21， 92， 93， 126 和 29a 在肿瘤血清样本中有明显的过量 表达， 而 miR-155， 127 及 99b 的表达却明显降低 【Resnick KE et al.The detection of differentially expressed microRNAs fro。
18、m the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform.Gynecol Oncol.112， 55-59(2009) ； Taylor D et al.MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.Gynecol Oncol.110， 13-21(2008)】 。此外在弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 血清中 miR-21 的表达明显增高， 增高的 miR-21 还暗示了较好的。
19、无复发生存率 【Lawrie CH et al.Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma.Br J Haematol.141， 672-5(2008) ； Chin LJ et al.A truth serum for cancer-microRNAs have major potential as cancer biomarkers.Cell Res.18， 983-984(2008)】 。这一结果显示，。
20、 检验 miRNA 的特异性表达不 仅有助于肿瘤的早期诊断， 还可用于病人的预后判断。这些研究都充分证实， 血清及血浆 miRNA 的测定是一个检测癌症生物学标志物很有前途的领域。 0004 现有的肿瘤标志物 CEA、 CA19-9、 CA50、 CA125 在胃癌中的敏感度与特异性不高， 对 胃癌具较高特异性的 CA72-4 也通常在胃癌的 III-IV 期增高。胃癌的明确诊断通常在疾病 的进展期才能做出， 因而寻找利于早期诊断和早期治疗的生物标志物一直是胃癌研究的热 点。 发明内容 0005 本发明要解决的技术问题是提供一种 miR-378 生物标志物在胃癌检测、 诊断中的 应用。利用该生。
21、物标志物可以简单、 快捷地进行胃癌检测、 诊断， 以便更好的治疗。 0006 为解决上述技术问题， 本发明的一种用于胃癌检测的 miRNA 生物标志物， 是如 SEQ ID NO.1 所示 miRNA 序列的 miR-378。该 miR-378 在胃癌患者血清中特异性表达上调。 0007 该生物标志物还可以应用于胃癌的诊断。 0008 另外， 本发明还提供了一种利用上述生物标志物进行胃癌检测的方法， 具体包括 说 明 书 CN 102605042 A 4 3/8 页 5 以下步骤 ： 0009 (1) 收集人血清样本 ； 0010 (2) 提取血清中总 RNA( 包含 miRNA) ； 001。
22、1 (3)对miR-378生物标志物进行反转录和Real time-PCR(RT-PCR， 实时定量PCR)， 并计算 miR-378 生物标志物的 PCR 相对定量值 ； 0012 (4)当样本中的miR-378生物标志物的PCR相对定量值小于或等于2.9时， 则认为 是非胃癌样本 ； 大于 2.9 时， 则认为是胃癌样本。 0013 其中， 步骤(1)收集人血清样本的具体操作为 ： 将收集的血样本放入不含EDTA(乙 二胺四乙酸 ) 的试管中， 静置凝固后， 取上清在 4下 600g 900g 离心 5 15 分钟后， 再 取上清并在 4下 12000g 16000g 离心 5 15 分钟。
23、， 取上清即得。 0014 步骤 (2) 中的总 RNA 抽提， 可按照商业化的 RNA 抽提试剂盒进行操作， 并测量 RNA 的浓度。 0015 步骤 (3) 中的反转录可按照商业化的反转录试剂盒进行 ； Real time-PCR 反应也 可按照商业化 RT-PCR 反应试剂盒进行操作， 其中， Real time-PCR 反应中， 以 U6snRNA 作为 内参， 并自行设计U6snRNA的引物， 以及使用2Ct公式来计算miR-378生物标志物的PCR相 对定量值， 式中 Ct Ct生物标志物-CtU6， Ct 是域值循环数， Ct生物标志物是 miR-378 生物标志 物的 Ct 值。
24、， CtU6是 U6snRNA 的 Ct 值。反转录反应条件为 ： 37 1 小时， 95 5 分钟。Real time-PCR 反应中 U6snRNA 的引物序列设计为 ttcgtgaagcgttccatatttt(SEQ ID NO.2 所 示 )， miR-378 生物标志物的引物序列为 actggacttggagtcagaagg(SEQ ID NO.3 所示 )， 其 Realtime-PCR反应条件为9515分钟， 然后进行循环， 循环条件为 ： 9415秒， 5530秒， 70 34 秒， 共 40 个循环。 0016 再者， 本发明还提供一种用于胃癌检测的 miR-378 生物标。
25、志物检测试剂盒， 该检 测试剂盒包括 ： 常规实时定量 PCR 试剂 ( 包括 ： Taq 酶、 dNTP 试剂、 荧光试剂、 PCR 缓冲液、 DEPC处理水等)、 内参U6snRNA的检测引物(SEQ ID NO.2所示)、 miR-378的检测引物(SEQ ID NO.3 所示 )。其中， 该检测试剂盒的操作方法可参照利用上述生物标志物进行胃癌检测 的方法进行。 0017 本发明的实验数据显示不同的肿瘤样本都具有特异性的血清 miRNA 表达谱。本发 明中的 miR-378 在正常人和胃癌患者血清中存在差异表达， 在胃癌血清中有显著的表达上 调。另外， 本发明以 miR-378 生物标志。
26、物的 PCR 相对定量值取 2.9 为临界值作为判断胃癌 的依据是根据具体的实验数据所得， 其中， 实验数据包括以下具体实施例中的实施例 1 和 实施例2。 因此， 可以成为胃癌检测诊断、 病理分级、 临床分期、 治疗疗效判断的有效工具， 具 有良好的临床应用前景。 附图说明 0018 图 1 是实施例 1 中的 24 个血清样本的 miRNA 表达谱聚类图。横排代表 miRNA， 纵 排代表样本。从左到右， 左侧区域显示的是 10 个正常样本， 中间区域显示的是 7 个结直肠 癌样本， 右侧区域显示的是 7 个胃癌样本。 0019 图 2 是实施例 1 中的胃癌样本与正常样本中 miR-37。
27、8 表达量的比值， 其中， 左侧显 示的是芯片结果， 右侧为 RT-PCR 的验证结果。 说 明 书 CN 102605042 A 5 4/8 页 6 0020 图 3 是实施例 2 中的正常血清样本和胃癌血清样本中的 miR-378 表达丰度的比较 图， 其中， 纵坐标为 miR-378 的 PCR 相对定量值。 0021 图 4 是实施例 2 中的正常血清样本和胃癌血清样本中的 miR-378 表达丰度的比较 图 ( 箱图 )， 其中， 纵坐标为 miR-378 的 PCR 相对定量值。 具体实施方式 0022 下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明 ： 0023 实施例 1。
28、 用于胃癌检测的生物标志物组合的建立 0024 1. 收集血清样本 0025 采集 10 个正常人、 7 个结直肠癌、 7 个胃癌各病期病人术前外周血 2mL( 采血时间 一般为早晨或上午 )， 其中， 这 24 个血清样本的具体临床数据如表 1 所示。将采集的 2mL 外 周血迅速转入不含 EDTA 的普通试管中， 在 22 25 ( 室温 ) 静置 15 30 分钟至完全凝 固。取 0.6ml 1mL 上清转至洁净的 1.5mL 离心管中， 在 1 小时 ( 室温条件下 ) 或 2 小时 (4条件下 ) 内进行以下操作 ： 4下 820g 离心 10 分钟 ； 再次吸取上清转至洁净的 1.。
29、5mL 离心管中， 4下16000g离心10分钟， 小心吸取上清到新的离心管中， 置于-80保存备用。 0026 表 1 24 个血清样本的具体临床数据 说 明 书 CN 102605042 A 6 5/8 页 7 0027 0028 2. 血清中总 RNA( 包含 miRNA) 抽提 0029 每份样本取 400L 血清， 使用 Applied Biosystem 公司的 mirVanaTMPARISTM试剂 盒， 按照说明书步骤抽提总 RNA， 并取 1LRNA， 使用 NanoDrop ND-1000Spectrophotometer 仪器按说明书步骤测量 RNA 浓度后置于 -80保存。
30、。 0030 3. 基因芯片杂交 0031 取 100ng 所抽提的血清 RNA， 使用 Agilent Technologies 公司的 miRNAComplete Labeling and Hyb 试 剂 盒， 按 照 说 明 书 步 骤 进 行 样 本 标 记 和 浓 缩， 使 用 Agilent Technologies 公司的人 microRNA 表达谱芯片进行杂交。使用芯片扫描仪进行图像扫描以 后， 把数据导入GeneSpring GX11.0软件进行数据的标准化处理及后续的分析， 将芯片归一 化后的有效数据应用 Pearson correlation 进行聚类分析。 0032 分。
31、析发现， 来源于胃癌的样本和来源于结直肠癌的样本都各自聚集到了一起 ( 图 说 明 书 CN 102605042 A 7 6/8 页 8 1)， 提示血清miRNA表达谱可以区分不同来源的肿瘤， 而且正常血清miRNA的表达谱也明显 与肿瘤血清 miRNA 表达谱不同， 提示血清 miRNA 表达谱也能区分正常与肿瘤样本。 0033 利用倍数分析、 t 检验、 聚类分析等生物信息学手段进行差异基因表达分析， 探寻 可能的差异基因， 最终筛选出在胃癌中特异性表达上调的 miRNA-miR-378( 序列如 SEQ ID NO.1 所示 )。 0034 4. 反转录和 Real time-PCR(。
32、RT-PCR) 反应验证芯片结果 0035 取 60ng 所抽提的 RNA 使用 Qiagen 公司的 miScript Reverse Transcription 反 转录试剂盒进行反转录反应。20L 反应体系 ： 60ng 所提取的 RNA+Rnase free water(RNA 和 Rnase free water 的总和为 15L)， 5miScript RT Buffer 4L， miScriptReverse Transcriptase Mix 1L。在热循环仪上进行反转录反应， 反应条件如下 ： 37 1 小时， 95 5 分钟。 0036 取 1.5L 的反转录产物作为实时定。
33、量 PCR 反应的模板， 使用 Qiagen 公司的 miScript SYBR Green PCR 试剂盒进行实时定量 PCR 反应。定量 PCR 以 U6snRNA 为内参， 并 设计该内参的引物。20L 反应体系 ： 1.5L 反转录产物， 2QuantiTectSYBR Green PCR Master Mix 10L， 10miScript Universal Primer 2L， miR-378 或内参 U6snRNA 的特 异性引物(浓度为20M)2L， Rnase free water 4.5L。 miR-378的引物序列为SEQ ID NO.3 所示， U6snRNA 的引物。
34、序列为 SEQ ID NO.2 所示。反应在 Applied Biosystem 公司的 7300 定量 PCR 仪上进行， 条件为 95预热 15 分钟， 然后进行循环， 循环条件为 ： 94 15 秒， 55 30 秒， 70 34 秒， 共 40 个循环的 PCR 反应。 0037 利用RT-PCR反应对芯片结果进行验证， 发现芯片结果显示miR-378在胃癌血清中 的表达是正常样本中的 2.8 倍， 而 RT-PCR 结果中， 胃癌血清中 miR-378 的相对定量值是正 常样本的 3.9 倍， 即 miR-378 在胃癌血清中有显著的表达上调， 该 RT-PCR 结果与芯片结果 显示。
35、一致 ( 图 2)。 0038 实施例 2 应用 miR-378 生物标志物进行胃癌检测的方法 0039 1. 收集血清样本 0040 采集 13 例初发胃癌患者的术前外周血 2mL， 并匹配 13 例正常人血样本， 26 例血清 样本的临床数据如表 2 所示。按照实施例 1 中的 “收集血清样本” 步骤进行操作， 但其中的 离心条件改为 ： 4下 600g 离心 15 分钟 ； 再次吸取上清转至洁净的 1.5mL 离心管中， 4下 12000g 离心 15 分钟， 小心吸取上清到新的离心管中， 最后得到的血清于 -80保存备用。 0041 表 2 26 个血清样本的具体临床数据 说 明 书 。
36、CN 102605042 A 8 7/8 页 9 0042 0043 2. 血清中总 RNA( 包含 miRNA) 抽提 0044 如同按照实施例 1 进行操作。 0045 3. 反转录和 Real time-PCR(RT-PCR) 反应 0046 如同按照实施例 1 中的 “反转录和 Real time-PCR(RT-PCR) 反应” 进行操作。 0047 miR-378 生物标志物的 PCR 相对定量使用 2Ct公式来计算， 其中 Ct Ct生物标志 物-CtU6。 结果显示胃癌血清样本中的miR-378的表达量明显上调， 平均miR-378的PCR相对 定量值为 5.52， 而正常样本的。
37、平均 miR-378 的 PCR 相对定量值仅为 1.98， 差异有显著性 (p 0.003)( 图 3)。 0048 4. 以 miR-378 作为胃癌检测的生物标志物 说 明 书 CN 102605042 A 9 8/8 页 10 0049 以 miR-378 的 PCR 相对定量值取 2.9 为临界值， 小于等于 2.9 认为是非胃癌样本， 大于 2.9 认为是胃癌样本。 0050 以 miR-378 的 PCR 相对含量为诊断标准， 本实施例中的 26 个样本的诊断结果如 下 ： 胃癌血清样本中 2.9 有 9 例， 2.9 的有 2 例 ； 正常血清样本中 2.9 有 4 例， 2.。
38、9 的有 9 例， 具体如表 3 所示。miR-378 作为诊断标准的特异性为 73.33 (11/15)， 敏感性为 84.62 (11/13)( 图 4)。 0051 表 3miR-378 为生物标志物进行胃癌诊断的结果 0052 0053 实施例 3 检测试剂盒及应用 0054 本实施例中的用于胃癌检测的 miR-378 生物标志物检测试剂盒， 除含有常规实时 定量 PCR 试剂之外， 还包括内参 U6snRNA 的检测引物 (SEQ ID NO.2 所示 ) 和 miR-378 的检 测引物 (SEQ ID NO.3 所示 )。其中， 常规实时定量 PCR 试剂包括 Taq 酶、 dN。
39、TP 试剂、 荧光试 剂、 PCR 缓冲液、 DEPC( 焦碳酸二乙酯 ) 处理水 (Rnase free water)。 0055 利用上述检测试剂盒进行检测时， 其具体的操作方法可参照实施例 2 的操作方法 进行样本的检测和胃癌的判断， 其中，“收集血清样本” 步骤中的离心条件还可以为 ： 4下 900g 离心 5 分钟 ； 再次吸取上清转至洁净的 1.5mL 离心管中， 4下 16000g 离心 5 分钟。 0056 应用本实施例中的检测试剂盒可以简单、 快速、 便利地进行 miR-378 生物标志物 的检测， 以判断胃癌情况， 便于治疗。 说 明 书 CN 102605042 A 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102605042 A 11 2/2 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102605042 A 12 。