技术领域
本发明涉及一种鲨鱼蛋白抗氧化肽，本发明还涉及该鲨鱼蛋白抗氧化肽的制备方 法，本发明还涉及该鲨鱼蛋白抗氧化肽的用途。
背景技术
抗氧化剂是一类可以阻止氧气不良影响，帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基 对人体损害和保护食物免受氧化损伤变质的一类物质。抗氧化剂主要分为天然和化学合 成两种类型，而化学合成抗氧化剂由于价格便宜、活性好，因而被广泛地应用到食品工 业中。然而，现有研究表明化学合成抗氧化剂丁基羟基茴香醚（BHA）、二丁基羟基甲 苯（BHT）和特丁基对苯二酚（TBHQ），除TBHQ外，在不同程度上对人体的肝脏、 肾脏等器官均有不利影响，并容易产生过敏反应。因此，基于食品安全的考虑，化学合 成抗氧化剂的应用受到了较大影响，部分发达国家已限量或禁止使用对人体有毒副作用 的化学合成抗氧化剂，比如北欧已禁止使用BHA和BHT，美国、日本及西欧国家也已 限量使用。因此，寻找高效、低毒的天然食品抗氧化剂成为世界各国科学家的研究热点。
目前，已从多种植物、动物组织中提取得到了抗氧化活性显著的物质，如茶叶中的 茶多酚、大豆中的异黄酮、河螯虾外壳中的虾青素，枸杞中的多糖，蔬菜水果中的类胡 萝卜素和抗坏血酸等物质。而已有的研究揭示，多肽类物质也具有显著的抗氧化活性， 如存在于肌肉组织中的肌肽不仅可以有效抑制脂肪氧化，而且在肉制品贮藏时有护色作 用；谷胱甘肽（GSH）亦具有抗氧化作用和整合解毒作用，半具有显著的抗氧化作用； 而以生物蛋白为原料，采用酶解技术得到的蛋白酶解物及其组成多肽也具有显著的抗氧 化活性，如牛瑞等研究发现鳕鱼皮酶解多肽具有显著的抗氧化活性；刘成梅等研究发现 罗非鱼鱼皮多肽多肽对二苯代苦味酰（DPPH）自由基的抑制作用强于对超氧阴离子自 由基的抑制作用；吴建中等研究发现大豆蛋白酶解多肽具有抗亚油酸过氧化能力和清除 自由基能力；徐怀德等研究发现甲鱼蛋白的木瓜蛋白酶酶解产物可清除羟基自由基和超 氧阴离子自由基和DPPH自由基；王勇刚研究发现鱼精多肽中的二肽（Pro-Arg）可显 著清除羟自由基，而且还可有效降低MRC-5（胚肺细胞）胞内自由基的含量，从而保 护细胞避免氧化损伤。
申请人在实验中发现，以路氏双髻鲨鱼肉蛋白为原料，利用酶解技术制备抗氧化多 肽的工艺研究处于空白阶段，而以酶解产物为材料制备高活性抗氧化肽及其应用更是未 见报道。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种鲨鱼蛋白抗氧 化肽，该抗氧化肽安全无毒副作用，抗氧化活性强和易于消化吸收，可清除自由基和抑 制脂质过氧化作用。
本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种鲨鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的制备方法， 工艺科学合理、易操作。
本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种鲨鱼鱼肉蛋白抗氧化肽的应用。
本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种鲨鱼蛋白抗氧化肽， 其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Leu-Asp-Lys，ESI-MS检测给出分子离子峰分子 量m/z 375.30[M+H]+。
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种鲨鱼蛋白抗氧化肽的 制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1）以脱脂鲨鱼鱼肉作为原料，按固液比1g:15mL~20mL加入缓冲液，用HCl或 NaOH调节pH到5.0~7.0，得混合液；
2）将混合液温度升至50℃~60℃搅拌预热5min~10min，按照脱脂鱼肉质量 的0.8%~1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解温度为50℃~60℃，酶解时间1h~3h，得酶 解产物；
3）将得到的酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次经脱盐、超滤和层 析，得到抗氧化肽。
作为改进，所述步骤1）中的脱脂鲨鱼鱼肉的制备过程为：将洗净、去骨和皮的鲨 鱼肉按照固液比1g:1mL~2mL放入缓冲液中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆， 然后按照体积比1:2~4放入乙醚中脱脂20~25h，3~5℃、4000~5000rpm，10~15min 离心除去乙醚，收集固形物即得到脱脂鲨鱼鱼肉。
作为优选，所述步骤2）中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5×106U/g。
作为改进，所述步骤3）中的灭酶处理为：将酶解产物升温至90℃~95℃，并于此 温度保持10min~15min后，冷却至15℃~20℃，然后离心，得酶解液。
再改进，所述步骤3）的脱盐、超滤和层析的具体过程为：
脱盐：将得到的酶解液制成浓度为15mg/mL~20mg/mL溶液，加入到大孔树脂层 析柱进行脱盐，然后用质量浓度45~55%乙醇进行解析，40℃以下低压旋蒸除去乙醇， 浓缩液进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；
超滤：将脱盐后的酶解物干粉溶于pH5.5~6.5的磷酸盐缓冲液配成8~12mg/mL的 溶液，于0.1~0.15MPa的工作压力和20~25℃的工作温度下采用超滤膜进行超滤处 理，收集分子量小于1kDa部分，得超滤酶解液；
层析：将上述超滤酶解液用pH5.5~6.5的磷酸盐缓冲液配成8~12mg/mL的溶液， 经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09~0.11mol/L、0.45~0.55mol/L和0.9~1.1mol/L NaCl 溶液进行洗脱，收集280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活 性最高组分为离子交换酶解液；将所述离子交换酶解液用pH5.5~6.5磷酸盐缓冲液配成 8~12mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集280nm下 的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶制备酶解物， 将上述凝胶制备酶解物用pH5.8~6.2磷酸盐缓冲液配成45~55μg/mL的溶液，利用反相 高效液相色谱RP-HPLC进行纯化，根据抗氧化活性得1个高活性抗氧化肽Leu-Asp-Lys。
优选，所述大孔树脂为D101.
再优选，所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25； 所述反相高效液相色谱条件为：进样量19~21μg；色谱柱为Zorbax C18；柱温为室温； 流动相：A含0.1%三氟乙酸的水和B含0.1%三氟乙酸的乙腈；梯度洗脱：0-55min乙 腈浓度从0至50%，每5min增加5%；洗脱速度1.0ml/min；紫外检测波长280nm。
最后，所述鲨鱼为路氏双髻鲨。
本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种鲨鱼蛋白抗氧化肽的 应用，其特征在于Leu-Asp-Lys对羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有 良好的清除作用，而对DPPH自由基显示出中等的清除活性；同时，Leu-Asp-Lys亦显 示出良好的脂质过氧化抑制作用和对β-胡萝卜素亚油酸体系中产生的过氧化氢自由基 的良好清除作用；Leu-Asp-Lys具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等 优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂上应用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明工艺科学合理，选用木瓜蛋白酶作为 酶解用酶，通过生物酶解法同时融合大孔树脂脱盐、超滤分级和色谱精制，酶解过程易 监控，同时制得的抗氧化肽具有较高的活性；与化学合成的抗氧化剂相比较，本发明制 得的抗氧化肽具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药 品、保健食品和食品添加剂等。
附图说明
图1是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物的RP-HPLC分析；
图2是本发明的Leu-Asp-Lys的反相高效液相色谱（RP-HPLC）图；
图3是本发明的Leu-Asp-Lys的质谱图；
图4是本发明的Leu-Asp-Lys的DPPH自由基清除活性；
图5是本发明的Leu-Asp-Lys的羟基自由基清除活性；
图6是本发明的Leu-Asp-Lys的ABTS自由基清除活性；
图7是本发明的Leu-Asp-Lys的超氧阴离子自由基清除活性；
图8是本发明的Leu-Asp-Lys在β-胡萝卜素-亚油酸体系中的抗氧化活性；
图9是本发明的Leu-Asp-Lys的脂质过氧化抑制活性。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。
一种鲨鱼蛋白抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下：路氏双髻鲨鱼肉→脱脂→ 酶解→酶解物→大孔树脂脱盐→超滤→离子交换层析→凝胶过滤层析→高效液相色谱制 备→抗氧化肽。
实施例1：
1）将洗净、去骨和皮的路氏双髻鲨鱼肉按照固液比1g:1mL放入缓冲液中，如磷 酸盐缓冲液作为pH调节剂，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1:4 放入乙醚中脱脂24h，4℃、4500rpm，15min离心除去乙醚，收集固形物；
2）脱脂鱼肉按固液比1g:20mL加入缓冲液，如磷酸盐缓冲液，用0.05~0.15mol/L HCl 或0.05~0.15mol/L NaOH调节pH到6.0，得混合液；
3）将混合液温度升至55℃搅拌预热10min，按照脱脂鱼肉质量的1.2%加入木瓜 蛋白酶，酶解温度为60℃，酶解时间2h，得酶解产物；
4）将步骤3）所得的酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次经脱盐、超 滤和层析，得到抗氧化肽，利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为：
①灭酶：酶解产物升温至90℃~95℃，并于此温度保持10min~15min后，冷却至 15℃~20℃，然后离心，得酶解液；
②脱盐：将得到的酶解液制成浓度为15mg/mL~20mg/mL溶液，加入到D101大 孔树脂层析柱进行脱盐，然后用50%乙醇进行解析，40℃以下低压旋蒸除去乙醇，浓 缩液进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；
③超滤：将上述脱盐酶解物干粉溶于磷酸盐缓冲液（pH6.0）配成10mg/mL的溶 液，于0.1~0.15MPa的工作压力和20~25℃的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理， 收集分子量小于1kDa部分，得超滤酶解液；
④阴离子交换层析：将上述超滤酶解液用磷酸盐缓冲液（pH6.0）配成10mg/mL 的溶液，经过DEAE-52纤维素阴离子交换树脂分离，用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自 由基清除活性最高组分为离子交换酶解液；
⑤凝胶色谱层析：将所述离子交换酶解液用磷酸盐缓冲液（pH6.0）配成10mg/mL 的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25柱层析分离，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集280nm下 的吸光度曲线收集洗脱组分，其中，DPPH自由基清除活性最高组分为凝胶制备酶解物。
⑥高效液相色谱精制：将上述凝胶制备酶解物用磷酸盐缓冲液（pH6.0）配成50 μg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化（条件：进样量20μg；色 谱柱为Zorbax C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱温为室温；流动相：A水（含0.1% 三氟乙酸）和B乙腈（含0.1%三氟乙酸）；梯度洗脱：0-55min乙腈浓度从0至50%， 每5min增加5%；洗脱速度1.0ml/min；紫外检测波长280nm），根据抗氧化活性得1 个高活性抗氧化肽（见图1）。
⑦结构检测：收集活性最高的1个抗氧化肽经检测为单一峰（见图2），利用蛋白/ 多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Leu-Asp-Lys，ESI-MS检测给出分子离子峰m/z [M+H]+375.30（见图3）。
实施例2
1）将洗净、去骨和皮的路氏双髻鲨鱼肉按照固液比1g:2mL放入缓冲液中，用高 速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1:2放入乙醚中脱脂20h，4℃、5000 rpm，10min离心除去乙醚，收集固形物；
2）脱脂鱼肉按固液比1g:15mL加入缓冲液，用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH 调节pH到6.0，得混合液；
3）将混合液温度升至50℃搅拌预热10min，按照脱脂鱼肉质量的1.0%加入木瓜 蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解时间3h，得酶解产物。
接下步骤同实施例1。
实施例3
1）将洗净、去骨和皮的路氏双髻鲨鱼肉按照固液比1g:1.5mL放入缓冲液中，用高 速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1:3放入乙醚中脱脂22h，4℃、 4000rpm，13min离心除去乙醚，收集固形物；
2）脱脂鱼肉按固液比1g:17mL加入缓冲液，用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH 调节pH到6.0，得混合液；
3）将混合液温度升至55℃搅拌预热8min，按照脱脂鱼肉质量的0.8%加入木瓜蛋 白酶，酶解温度为55℃，酶解时间2h，得酶解产物。
接下步骤同实施例1。
将上述制得的鲨鱼醇溶蛋白抗氧化肽Leu-Asp-Lys进行DPPH自由基清除实验（见 图4）、羟基自由基清除实验（见图5）、ABTS自由基清除实验（见图6）、超氧阴离子 自由基清除实验（见图7）、β-胡萝卜素－亚油酸体系实验（见图8）和脂质过氧化抑 制实验（见图9）。实验结果表明：Leu-Asp-Lys Leu-Asp-Lys对羟基自由基（EC50 0.17 mg/mL）、ABTS(EC50 0.19mg/mL)和超氧阴离子自由基(EC50 0.12mg/mL)具有良好的清 除作用，而对DPPH自由基(EC50 3.06mg/mL)显示出中等的清除活性；同时， Leu-Asp-Lys亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用和对β-胡萝卜素亚油酸体系中产生的 过氧化氢自由基的良好清除作用。
最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不 限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直 接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。