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1、(10)申请公布号 CN 102676630 A (43)申请公布日 2012.09.19 CN 102676630 A *CN102676630A* (21)申请号 201110427090.9 (22)申请日 2011.12.19 C12Q 1/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (71)申请人 河南科技大学 地址 471003 河南省洛阳市涧西区西苑路 48 号 (72)发明人 侯军 林晓民 王少先 刘保国 侯明阳 (74)专利代理机构 郑州睿信知识产权代理有限 公司 41119 代理人 牛爱周 (54) 发明名称 一种利用干茯苓分离和鉴定茯苓菌种方法 (57。
2、) 摘要 本发明涉及一种利用干茯苓分离和鉴定茯苓 菌种方法， 包括以下步骤 ： (1) 利用茯苓菌核分离 菌种， 先对干菌核进行预处理， 然后进行菌丝促 生， 并取块接种， 得到茯苓菌丝 ； (2) 菌丝的培养 及鉴定， 选取培养基， 接种、 培养， 放置在显微镜下 直接观察， 茯苓菌丝在自然状态下的生长， 在菌丝 顶端呈对称二叉状分枝， 这样的菌种即为茯苓菌 种。本发明的方法可以依据干茯苓的的质地判断 分离的菌种是否优质， 填补了鲜茯苓分离菌种时， 后期品质无法准确预测的空白。 另外， 本发明的方 法可行， 操作简单， 鉴定准确， 方法简单， 不需特殊 仪器。 本发明以个苓( 干茯苓 ) 为。
3、分离材料， 能非 常成功的分离茯苓菌种， 并且根据发现的茯苓的 一个天然生长表象， 能准确的鉴定茯苓菌种。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种利用干茯苓分离和鉴定茯苓菌种方法， 其特征在于 ： 包括以下步骤 ： (1) 利用茯苓菌核分离菌种， 先对干菌核进行预处理， 然后进行菌丝促生， 并取块接种， 得到茯苓菌丝 ； (2) 菌丝的培养及鉴定， 选取培养基， 接种、 培养， 放置在显微镜下直接观察， 茯苓菌丝 在自然状态。
4、下的生长， 在菌丝顶端呈对称二叉状分枝， 这样的菌种即为茯苓菌种。 2.根据权利要求1所述的利用干茯苓分离和鉴定茯苓菌种方法， 其特征在于 ： 步骤(1) 的具体分离方法如下 ： 取用干净的潮润纱布包裹干茯苓菌核， 每天把纱布换洗一次， 锤子把 干茯苓菌核敲裂 ； 潮润纱布包裹的干茯苓菌核 2-5 天即可萌发出茯苓菌丝 ； 敲裂的干茯苓 块被润湿后取出大小适宜操作的裂块， ， 用透明胶带缠紧只露出菌块最平处均匀的一面 ； 把 胶带外面用酒精消毒后， 把露出的茯苓部位放入抗生素平板， 3-5 天即可萌发出茯苓菌丝。 3.根据权利要求1所述的利用干茯苓分离和鉴定茯苓菌种方法， 其特征在于 ： 步骤。
5、(2) 中的培养基由以下方法制得 ： 将土豆去皮， 切2-3毫米厚， 在85-95的温度下浸煮2-3h， 取 上清置于量筒中， 初步静置， 离心， 取上清， 加入葡萄糖， 纯净琼脂粉， 完全溶解后过滤， 去除 粒状物， 高压灭菌 15-25min， 灭菌后马上灌平板， 以免二次加热造成培养基变色。 4.根据权利要求1所述的利用干茯苓分离和鉴定茯苓菌种方法， 其特征在于 ： 步骤(2) 中的接种为 ： 平板培养茯苓菌种， 菌块 1.51.5cm2， 接于内置载玻片中心， 在超净工作台上 操作为好， 接种箱内消毒剂易降低透明度。 5.根据权利要求1所述的利用干茯苓分离和鉴定茯苓菌种方法， 其特征在。
6、于 ： 步骤(2) 中的培养是在 25-30的温度下进行培养。 权 利 要 求 书 CN 102676630 A 2 1/3 页 3 一种利用干茯苓分离和鉴定茯苓菌种方法 技术领域 0001 本发明涉及一种利用干茯苓分离和鉴定茯苓菌种方法， 属于生物技术领域。 技术背景 0002 茯 苓 Wolfiporia cocos(shw.)Rvy.&Gilbn.，原 学 名 Poria cocos(Fr.) Wolf.，隶 属 于 担 子 菌 门 (Basidiomycota) 层 菌 纲 (Hymenomycetes) 非 褶 菌 目 (Aphyllophorales) 多孔菌科 (Polypora。
7、ceae) 茯苓属 (Wolfiporia)。别称茯菟、 茯灵、 茯 蕶、 伏苓、 伏菟、 松腴、 绛晨伏胎、 云苓、 茯兔、 松薯、 松木薯、 松苓、 松茯苓、 松柏芋等， 为寄生 在松树根上的大型真菌茯苓的干燥菌核， 形状像甘薯， 外皮黑褐色， 里面白色或粉红色， 是 我国传统的名贵中药材。 0003 茯苓性味甘淡平， 入心、 肺、 脾经， 具有渗湿利水， 健脾和胃， 宁心安神的功效 ； 可治 小便不利， 水肿胀满， 痰饮咳逆， 呕逆， 恶阻， 泄泻， 遗精， 淋浊， 惊悸， 健忘等症。 茯苓之利水， 是通过健运脾肺功能而达到的， 与其它直接利水的中药不同。中医经典药方中也多离不开 茯苓。。
8、茯苓除了药用外， 还被调配成多种营养食品， 如我国市场上常见的 “茯苓糕” 、“茯苓 饼” 、“茯苓酥” 、“茯苓茶” 等。菌核是茯苓贮存营养的主要器官， 为药用部分， 形状有球形、 扁 球形、 卵形、 椭圆或扁平等不规则形状， 对不良的环境条件有很强的抵抗力。菌核受营养和 环境条件等影响， 其大小差别很大， 小的 0 2 千克左右， 最大的可达 50 60 千克， 但一般 多为 2 3 千克左右。菌的外壳在较嫩和新鲜时为淡黄棕色、 棕色， 老熟时为棕褐色或黑褐 色， 表面粗糙多皱， 较坚硬， 能抵御不良的环境条件。 菌核内部的菌肉为白色或淡粉红色， 柔 软， 多浆汁， 主要由菌丝体、 茯苓聚。
9、糖类物质和粘液物质组成。 0004 目前， 茯苓菌种的分离一般选用新鲜菌核进行组织分离 ： 将选好的种苓洗净， 擦去 表面水分， 置接种室或接种箱内进行分离。分离时先用 70酒精将菌核表面擦洗消毒一遍 后， 用刀子将菌核切一道口子， 再用手掰开， 在皮下 0.5 1 厘米处挑取黄豆粒大小一块菌 核组织放到斜面培养基上， 25恒温培养两天后， 可见组织块周围长出绒毛状菌丝， 七天左 右满管， 即得一级母种。 0005 按加工方法和部位分为个苓、 白苓片 ( 平片 )、 白苓块、 赤苓块、 茯神块、 骰方、 白碎 苓、 赤碎苓、 茯神木等规格， 个苓， 一般为不规则圆球形， 表面黑褐色或棕褐色。体。
10、坚实， 皮 细。 作为筛选后的个苓， 能比较客观的反应茯苓的种性， 而鲜茯苓则无法准确反映干后茯苓 的出苓率及内在品质。 发明内容 0006 本发明的目的在于提供一种能够快速利用干茯苓分离和鉴定茯苓菌种方法。 0007 为了实现上述目的， 本发明的技术方案采用了一种利用干茯苓分离和鉴定茯苓菌 种方法， 包括以下步骤 ： 0008 (1) 利用茯苓菌核分离菌种， 先对干菌核进行预处理， 然后进行菌丝促生， 并取块 接种， 得到茯苓菌丝 ； 说 明 书 CN 102676630 A 3 2/3 页 4 0009 (2) 菌丝的培养及鉴定， 选取培养基， 接种、 培养， 放置在显微镜下直接观察， 茯。
11、苓 菌丝在自然状态下的生长， 在菌丝顶端呈对称二叉状分枝， 这样的菌种即为茯苓菌种。 0010 步骤 (1) 的具体分离方法如下 ： 取用干净的潮润纱布包裹干茯苓菌核， 每天把纱 布换洗一次， 锤子把干茯苓菌核敲裂 ； 潮润纱布包裹的干茯苓菌核 2-5 天即可萌发出茯苓 菌丝 ； 敲裂的干茯苓块被润湿后取出大小适宜操作的裂块， ， 用透明胶带缠紧只露出菌块最 平处均匀的一面 ； 把胶带外面用酒精消毒后， 把露出的茯苓部位放入抗生素平板， 3-5 天即 可萌发出茯苓菌丝。 0011 步骤 (2) 中的培养基由以下方法制得 ： 将土豆去皮， 切 2-3 毫米厚， 在 85-95的 温度下浸煮 2-。
12、3h， 取上清置于量筒中， 初步静置， 离心， 取上清， 加入葡萄糖， 纯净琼脂粉， 完 全溶解后过滤， 去除粒状物， 高压灭菌 15-25min， 灭菌后马上灌平板， 以免二次加热造成培 养基变色。 0012 步骤 (2) 中的接种为 ： 平板培养茯苓菌种， 菌块 1.51.5cm2， 接于内置载玻片中 心， 在超净工作台上操作为好， 接种箱内消毒剂易降低透明度。 0013 步骤 (2) 中的培养是在 25-30的温度下进行培养。 0014 本发明的方法可以依据干茯苓的的质地判断分离的菌种是否优质， 填补了鲜茯苓 分离菌种时， 后期品质无法准确预测的空白。另外， 本发明的方法可行， 操作简单。
13、， 鉴定准 确， 方法简单， 不需特殊仪器。 本发明以个苓(干茯苓)为分离材料， 能非常成功的分离茯苓 菌种， 并且根据发现的茯苓的一个天然生长表象， 确立一种方法， 能准确的鉴定茯苓菌种。 附图说明 0015 图 1 为本发明茯苓菌丝顶端二叉状分支示意图。 具体实施方式 0016 本发明的方法为 ： (1) 干茯苓菌核非常坚硬， 用干净的潮润纱布包裹干茯苓菌核， 每天把纱布换洗一次， 锤子把干茯苓菌核敲裂 ； 0017 (2) 菌丝促生 0018 潮润纱布包裹的干茯苓菌核 3 天左右即可萌发出茯苓菌丝 ； 0019 (3) 透明胶带包裹 0020 敲裂的干茯苓块被润湿后取出大小适宜操作的裂块。
14、， 用透明胶带缠紧只露出菌块 最平处均匀的一面 ； 0021 (4) 取块接种 0022 把胶带外面用酒精消毒后， 把露出的茯苓部位在火焰上迅速来回过一下， 用手术 刀削成条， 用尖嘴镊掰取花生粒大小放入抗生素平板， 3-5 天即可萌发出茯苓菌丝。 0023 茯苓菌丝对称分叉现象的培养及观察 0024 培养基制备 ： 0025 土豆去皮， 切 2-3 毫米厚， 小火浸 2-3 小时， 取上清置于 1000 毫升量筒中， 初步静 置， 5000r/min 离心， 取上清， 加入葡萄糖 20g， 纯净琼脂粉 20g， 完全溶解后过滤 ( 去除粒状 物 )， 高压灭菌 20min， 灭菌后马上灌平板。
15、 ( 以免二次加热造成培养基变色 )。 0026 制平板 ： 在培养皿内放置一个载玻片， 灭菌后加灌培养基。 灌注标准(高于内置载 说 明 书 CN 102676630 A 4 3/3 页 5 玻片 )1mm 左右， 待用。 0027 接种 ： 平板培养茯苓菌种， 菌块 1.51.5cm2， 接于内置载玻片中心， 在超净工作 台上操作为好， 接种箱内消毒剂易降低透明度。 0028 培养 ： 28培养。 0029 观察 ： 用挑针把平板中预埋的载玻片周围的培养基划掉， 取出， 底面擦干净， 放置 显微镜下直接观察， 茯苓菌丝在自然状态下的生长， 在菌丝顶端呈对称二叉状分枝， 这样的 菌种极为茯苓菌种， 见图 1。 说 明 书 CN 102676630 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 102676630 A 6 。