一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法.pdf

本发明涉及一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法，属于生物技术领域。该方法将TYLCV的V2和C1基因中的保守序列嵌合并构建反向重复序列的RNAi载体，通过农杆菌介导转化法转化番茄无菌苗子叶或下胚轴外植体，转基因番茄经TYLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种和携带TYLCV的烟粉虱接种病毒后都表现对TYLCV抗性，未观察到明显的发病症状。本发明利用RNAi技术可以培育抗TYLCV番茄转基因株系，为防治TYLCV提供了技术支持。

1.一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法,包括：1) 将番茄黄化曲叶病毒TYLCV的V2基因和C1基因中的保守序列嵌合并构建反向重复序列的RNAi载体；2) 利用农杆菌介导转化法转化番茄无菌苗子叶或下胚轴外植体；3) 转基因番茄经TYLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种或携带TYLCV的烟粉虱接种鉴定抗病性，获取抗TYLCV番茄。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：1) 分别利用下列两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，从有TYLCV典型症状的番茄植株病叶样品DNA中扩增V2基因和C1基因，所述V2基因和C1基因的序列分别为SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示；F1 CAGTCAACCAATCAAATTGCATCCTR1 AACTGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGGF2 GTACCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGCR2 GTCCTACACGCTTACGCCTTATTG2) 将SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2 PCR产物混合，以引物F1和R2进行PCR扩增,得到V2和C1的嵌合基因，序列为SEQ ID NO.3所示，嵌合基因SEQ ID NO.3 PCR产物与pGEM-T 载体连接，得到T-V2C1；3) 以T-V2C1为模板，利用下列F3/R3引物进行PCR扩增，将PCR产物和植物表达载体iHp用BamHI和HindIII酶切，将酶切片段进行连接，得到iHp-T-V2C1；F3 CTAATGAGGCGATATAATCATTTCCAR3 TGCAACCGTTGGTTCTTACATTG4) 以T-V2C1为模板，利用下列F4/R4引物进行PCR扩增，将PCR产物和iHp-T-V2C1以XhoI和SacI酶切，将酶切片段进行连接，得到iHp-V2C1；F4 GATAACCGTTGGTTCTTACATTGR4 GTTAGGCGATATAATCATTTCCA5) 用BamHI和SacI酶切植物表达载体pBI121和iHp-V2C1，回收酶切的目的片段，用T4-DNA连接酶连接，构建RNAi载体pBI121-V2C1；6) 农杆菌介导法将RNAi载体pBI121-V2C1转化番茄无菌苗的子叶或下胚轴外植体，通过硫酸卡那霉素筛选，抗性再生苗生根、移栽，PCR鉴定获取转基因番茄；7) 将含有TYLCV的农杆菌侵染性克隆采用农杆菌注射法对4-6叶期苗龄转基因番茄进行注射接种，筛选抗TYLCV转基因番茄；或者将转基因番茄植株置于防虫温室，通过携带TYLCV的烟粉虱进行捕食和传毒，筛选抗TYLCV转基因番茄。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述转基因番茄含有SEQ ID ID NO.3所示的部分或全部核苷酸序列。

技术领域：

本发明涉及一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法，专用于农作物（番茄）遗传转化和转基因新品种的选育，属于生物技术领域。

背景技术：

番茄黄化曲叶病毒（Tomato Yellow Leaf Curl Virus，TYLCV）隶属双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus）。大多数Begomovirus包含2个闭合环状单链、大小为2.5-3.0Kb基因组，即DNA-A和DNA-B组份；少数仅含有一个DNA-A组份，其基因组结构相当于双组份病毒的DNA-A。DNA-A编码6个ORF，分别是位于病毒链上的V1基因(编码外壳蛋白capsid protein, CP)、V2基因(编码移动蛋白movement protein，MP)以及位于互补链上的C1基因(编码复制起始蛋白replication initiator protein，Rep)、C2 基因(编码转录激活蛋白transcriptional activator protein, TrAP)、C3 基因(编码复制增强蛋白replication enhancer protein, REn)和C4 基因(编码的蛋白参与病毒的系统运动或症状形成)；在基因V2 与C1 之间有非编码区(intergenic region，IR)，该区含有病毒复制和转录所需的调控元件，包括茎环结构域和保守的9碱基TAATATTAC序列等。DNA-B编码的蛋白涉及到病毒的移动，其中病毒链编码的BV1是一个核穿梭蛋白（Nuclear shuttle protein，NSP)，具有结合DNA的活性，能够促进病毒DNA在细胞核与细胞质之间进行穿梭运动；互补链上的BC1编码MP，参与病毒的胞间移动(Czosnek H and Gronenborn B. The tomato yellow leaf curl virus genome and function of its proteins. Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease,2007: 67-84). 

感染TYLCV番茄早期主要表现为植株生长迟缓或停滞，节间变短，明显矮化，叶片变小，变厚，叶质脆硬，有褶皱，向上卷曲，变形，叶片边缘至叶脉区域黄化，以植株上部叶片症状典型，下部老叶症状不明显；植株感病后期坐果很少，果实变小，膨大速度极慢，成熟期的果实不能正常转色，致使番茄品质下降，基本失去商品价值，产量减少，甚至绝收，给当地番茄生产造成巨大的损失(赵统敏,余文贵,杨玛丽,赵丽萍,季英华,周益军.番茄黄化曲叶病毒病在江苏的暴发与综合防治.江苏农业科学, 2008: 114-115)。

TYLCV通过烟粉虱以长久方式传播。烟粉虱繁殖力强且极易产生抗药性，如片面施用化学农药往往在1-3年后难以防治，而且该虫寄主广泛，几乎涵盖所有常见蔬菜、多种花卉等作物，要将TYLCV限制在一个地点和阻止其传播与扩散有很大难度。同时TYLCV危害重，又几乎无药可治，因此培育抗TYLCV优良品种，是消除TYLCV威胁的主要策略。目前，抗TYLCV的基因仅在醋栗番茄(Lycopersicon pimpinellifolium)、秘鲁番茄(Lycopersicon peruvianum)、多毛番茄(Lycopersicon habrochaites)、智利番茄(Lycopersicon chilense)和契斯曼尼番茄(Lycopersicon cheesmanii) 等近缘野生种中发现，在番茄栽培种中还未发现。番茄栽培种与野生种杂交才可获得抗TYLCV的番茄栽培种质，但这需要大量且长期的选育和鉴定工作(Ji Y, Scott J, Hanson P, Graham E, Maxwell D. Sources of resistance, inheritance, and location of genetic loci conferring resistance to members of the tomato-infecting begomoviruses. Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease, 2007: 343-362) 。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。其作用机制是双链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。RNAi是普遍存在于动物和植物界的一种防御反应，已经发展成为基因治疗、基因功能研究和植物新种质创制的有效的方法。

因此，利用RNAi技术特异地对抗番茄黄化曲叶病毒，可以培育抗TYLCV番茄。

发明内容：

技术问题

本发明的目的是针对TYLCV危害番茄生产的现状，提供一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法。

技术方案

一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法，包括：

1) 将TYLCV的V2和C1基因中的保守序列嵌合并构建反向重复序列的RNAi载体；

2) 利用农杆菌介导转化法转化番茄无菌苗子叶或下胚轴外植体；

3) 转基因番茄经TYLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种和携带TYLCV的烟粉虱接种鉴定抗病性，获取抗TYLCV番茄。

本发明所述的方法，具体步骤如下：

1) 分别利用下列两对引物F1/R1和F2/R2进行PCR扩增，从有TYLCV典型症状的番茄植株病叶样品DNA中扩增V2基因和C1基因，所述V2基因和C1基因的序列分别为SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2所示；

F1 CAGAAGCTTTCAACCAATCAAATTGCATCCT

R1 AACGAGGCATGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGG

F2 GTATCGAAGCCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGC

R2 GTCAAGCTTCTACACGCTTACGCCTTATTG

2) 将SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO.2 PCR产物混合，以引物F1和R2进行PCR扩增,得到V2和C1的嵌合基因，嵌合基因序列为SEQ ID NO.3所示，SEQ ID NO.3 PCR产物与pGEM-T 载体连接，得到T-V2C1；

3) 以T-V2C1为模板，利用下列F3/R3引物进行PCR扩增，将PCR产物和植物表达载体载体iHp用BamHI和HindIII酶切，酶切片段进行连接，得到iHp-T-V2C1；

F3 CTAGGATCCATGAGGCGATATAATCATTTCCA

R3 TGCAAGCTTAACCGTTGGTTCTTACATTG

4) 以T-V2C1为模板，利用下列F4/R4引物进行PCR扩增，将PCR产物和iHp-T-V2C1以XhoI和SacI酶切，酶切片段进行连接，得到iHp-V2C1；

F4 GATCTCGAGAACCGTTGGTTCTTACATTG

R4 GTTGAGCTCAGGCGATATAATCATTTCCA

5) 用BamHI和SacI酶切植物表达载体pBI121和iHp-V2C1，回收酶切的目的片段，用T4-DNA连接酶连接，构建RNAi载体pBI121-V2C1。

6) 农杆菌介导法将RNAi载体pBI121-V2C1转化番茄无菌苗的子叶或下胚轴外植体，通过硫酸卡那霉素筛选，抗性再生苗生根、移栽，PCR鉴定获取转基因番茄。

7) 将含有TYLCV的农杆菌侵染性克隆采用农杆菌注射法对4-6叶期苗龄转基因番茄进行注射接种，筛选抗TYLCV转基因番茄或者将转基因番茄植株置于防虫温室，通过携带TYLCV的烟粉虱进行捕食和传毒，筛选抗TYLCV转基因番茄。

有益效果：

本发明方法利用RNAi技术可以培育具有优良抗TYLCV的转基因番茄，转基因番茄经TYLCV的农杆菌侵染性克隆注射接种和携带TYLCV的烟粉虱传毒接种后，未表现TYLCV感染症状，而非转基因番茄植株的顶端新叶则产生卷曲皱缩、耳突，植株表现矮化等典型TYLCV感染症状。

附图说明

图 1  pBI121- V2C1载体转基因番茄PCR检测

CK:非转基因番茄；M: 1kb DNA 分子量标准；1-15: pBI121-V2C1转化番茄再生植株。除了6和14号再生植株，其他13株番茄再生植株能扩增出400bp大小的片段，而非转基因植株没有扩增到特异条带，证明RNAi框架已经整合至番茄基因组。

图 2  PCR检测pBI121-V2C1转基因番茄植株体内病毒

CK:非转基因番茄；1-5,7-13,15：pBI121-V2C1转基因番茄。对照植株能扩增明亮的病毒特异条带，部分转基因植株（2、3、4、5、7、9、11、15号植株）也能检测到该特异条带，但条带亮度比对照植株暗，而1、8、10、12和13号转基因植株没有检测到病毒特异条带，初步表明该几个转基因株系对TYLCV有抗性。

图 3  烟粉虱传毒一个月后番茄植株表现

A : 非转基因植株上半部分的新叶明显卷曲皱缩；  B : 转基因植株上半部分的叶片无卷曲皱缩现象；C : 非转基因植株整体表现植株矮化；D : 转基因植株整株表现正常，无感染TYLCV症状。

具体实施方式

1、TYLCV的V2和C1基因RNAi载体的构建

1.1 植物总DNA提取

利用CTAB法提取有TYLCV典型症状（顶端新叶出现卷曲、产生耳突）的番茄植株病叶样品DNA，具体步骤如下：取1g新鲜叶片，液氮研磨成粉末，转入1.5 ml离心管，加入600μl预热CTAB裂解液（表1），涡旋混匀，65℃水浴1h，加入600μl氯仿-异戊醇（24：1），颠倒50次混匀，10000rpm离心15min，取上清于新1.5ml离心管，加入等体积的预冷异丙醇，充分混匀，-20℃放置30min，12000rpm离心15min，弃上清，加入1ml 75%酒精洗涤DNA沉淀，弃酒精，风干，加100μl TE溶解DNA，4℃储存备用。

表1    CTAB裂解液组成

成分 用量 1.4 M NaCl 40.908g 0.1 M Tris-HCl 50 ml 1.0 M Tris-HCl(pH 8.0) 20 mM EDTA 20 ml 0.5 M EDTA(pH 8.0) 2%十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 10 g 2% 聚乙烯基吡咯烷酮(PVP) 10 g 1% (V/V)β-巯基乙醇 5 ml 去离子水 425 ml 总体积 500 ml

1.2 PCR分别扩增V2和C1基因片段

V2基因片段PCR引物为F1 CAGAAGCTTTCAACCAATCAAATTGCATCCT和R1 AACGAGGCATGGGCTTCGATACATTCTGTATATTCTGG，

C1基因片段PCR引物为F2 GTATCGAAGCCCATGCCTCGTTTATTTAAAATATATGC和R2 GTCAAGCTTCTACACGCTTACGCCTTATTG。 

PCR反应条件：94℃预变性3min，（94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸40sec）35个循环，72℃继续延伸10min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒（Axygen公司）分别回收纯化V2基因453bp（SEQ ID NO.1）和C1基因1103bp (SEQ ID NO.2)的目的片段。

1.3 PCR扩增V2和C1的嵌合基因

将步骤1.2的目的片段（SEQ ID NO.1, SEQ ID NO.2）混合做模板，以上述引物F1和R2进行PCR扩增。PCR反应条件：94℃预变性3min，（94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸40sec）35个循环，72℃继续延伸10min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒（Axygen公司）回收纯化嵌合基因392bp（SEQ ID NO.3）。

1.4 载体T-V2C1构建和质粒提取

将步骤1.3的嵌合基因与pGEM-T 载体（Promega公司）连接，反应体系如下: 2×Buffer 5.0 μl、pGEM-T载体 0.7μl、PCR 产物 3.3μl、T4 DNA 连接酶 1.0μl，上述成分混匀后16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌JM109（Takara公司），步骤如下： 取一管-70℃保存的感受态细胞，冰盒上融化，加入10μl连接产物，轻摇混匀，冰浴30min； 42℃热激90sec后迅速置冰浴2min，加入400μl液体LB，37℃ 100rpm振荡培养1h；取200μl培养液均匀涂布于涂有4μl IPTG(200mg/ml)和40μl X-GAL(20mg/ml)的氨苄青霉素(50 mg/l)平板上，37℃静置培养12h。挑取平板上长出的单克隆，在含有氨苄青霉素(50 mg/l)的LB液体培养基中37℃、220rpm培养16h，经引物F1和R2进行PCR鉴定为阳性克隆，测序验证含有V2和C1的嵌合基因序列（SEQ ID NO.3），命名为T-V2C1，用质粒DNA提取试剂盒（Axygen公司）提取T-V2C1质粒DNA。

1.5载体iHp-T-V2C1构建和质粒提取

以T-V2C1 DNA为模板，利用引物F3 CTAGGATCCATGAGGCGATATAATCATTTCCA和R3 TGCAAGCTTAACCGTTGGTTCTTACATTG进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性3min，（94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸40sec，）35个循环，72℃继续延伸10min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒（Axygen公司）回收纯化目的片段（413bp）。将目的片段和植物表达载体iHp（Peter A. Stoutjesdijk, Surinder P. Singh, Qing Liu, et al. hpRNA-mediated targeting of the ArabidopsisFAD2gene gives highly efficient and stable silencing. Plant physiology, 2002, 129:1723-1731.）用BamHI和HindIII酶切，酶切产物用T4-DNA酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109（Takara公司）。挑取平板上长出的单克隆，在含有50mg/l卡那霉素的LB液体培养基中37℃、220rpm培养16h，经引物F3和R3进行PCR鉴定为阳性克隆后，命名为iHp-T-V2C1，用质粒DNA提取试剂盒（Axygen公司）提取iHp-T-V2C1质粒DNA。

1.6载体iHp-V2C1构建和质粒提取

以T-V2C1 DNA为模板，利用引物F4 GATCTCGAGAACCGTTGGTTCTTACATTG和R4 GTTGAGCTCAGGCGATATAATCATTTCCA进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性3min，（94℃变性30sec，57℃退火30sec，72℃延伸40sec，）35个循环，72℃继续延伸10min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒（Axygen公司）回收纯化目的片段（410bp）。将目的片段和iHp-T-V2C1以XhoI和SacI酶切，酶切产物用T4-DNA酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌JM109（Takara公司）。挑取平板上长出的单克隆，在含有50mg/l卡那霉素的LB液体培养基中37℃、220rpm培养16h，经引物F4和R4进行PCR鉴定为阳性克隆后，命名为iHp-V2C1，用质粒DNA提取试剂盒（Axygen公司） 提取iHp-V2C1质粒DNA。

1.7 载体pBI121-V2C1构建

用BamHI和SacI酶切植物表达载体pBI121（Clontech公司）和iHp-V2C1，酶切产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离，用DNA凝胶回收试剂盒（Axygen公司）回收纯化酶切片段，用T4-DNA连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌JM109（Takara公司）。挑取平板上长出的单克隆，在含有卡那霉素的LB液体培养基中37℃、220rpm培养16h，用质粒DNA提取试剂盒 （Axygen公司）提取质粒DNA，经BamHI/SacI双酶切验证后，命名为pBI121-V2C1。

2、农杆菌介导转化番茄

2.1农杆菌感受态细胞的制备

取-70℃保存农杆菌EHA105（北京Biovector公司）划线于LB（含有20mg/l 利福平）平板，28℃培养2d。挑单菌落培养于50ml 液体LB（含20mg/l利福平），140rpm，28℃培养至OD600 =0.5；农杆菌菌液转入无菌50ml 离心管，4000rpm离心4min，弃上清液，加入5ml预冷0.15M NaCl 悬浮细胞，4000rpm离心4min,去上清液；再用0.15M NaCl悬浮细胞，4000rpm离心4min,去上清液；加入3ml预冷20mM CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30min，加入终浓度为15%甘油, 混匀后每管分装100μl，立即冻存于-70℃。

2.2 RNAi载体pBI121-V2C1转化农杆菌

取1μg左右的pBI121-V2C1质粒DNA加入到100μl 农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴30min；液氮冷冻1min，取出后37℃水浴2min，冰浴2min；加入1ml 液体LB，28℃、140rpm摇培2-3h；离心，100μl 液体LB重悬后涂在含50mg/l 卡那霉素 LB平板上，28℃培养到形成单菌落；单菌落培养于含有50 mg/l 卡那霉素的液体LB，28℃、140rpm摇培16h，取2μl 菌液进行PCR验证，阳性克隆保存备用。

2.3农杆菌转化番茄子叶或下胚轴

感病自交系番茄品种E-6（彭宏,余文贵,赵统敏,张保龙,倪万潮,吴丹,杨玛丽,赵丽萍. GroEL基因抗番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)的研究,江苏农业学报, 2011, 27( 2 ): 371-377）种子用70%乙醇浸泡30sec，然后用10%次氯酸钠消毒15min，期间不断摇动，随后用无菌水冲洗3遍，接种于1/2MS培养基上培养10d；取番茄无菌苗的子叶或下胚轴为外植体，用OD600 =0.3左右的农杆菌菌液浸泡感染外植体5min。取出外植体，置于无菌干燥滤纸上吸干残留菌液，转入MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L培养基上黑暗处共培养48h，然后转入MS+IAA 0.5mg/L+6-BA 2.0mg/L+头孢霉素 500mg/L+ 卡那霉素 50mg/L筛选培养基上，25℃、 18/6h光照周期进行培养。每三周换一次培养基。约40d左右分化出绿色芽点；待再生芽长到3-4cm时切下并转入1/2MS+IBA 1.0mg/L+头孢霉素 400mg/L生根培养基中培养；根系发达后移栽至土壤。

2.4 转基因番茄的DNA提取

利用CTAB法提取再生番茄植株叶片DNA，具体步骤如下：取0.1-0.5g新鲜叶片，液氮研磨成粉末，转入1.5 ml离心管，加入600μl预热CTAB裂解液（表1），涡旋混匀，65℃水浴1h，加入600μl氯仿-异戊醇（24：1），颠倒50次混匀，10000rpm离心15min，取上清于新1.5ml离心管，加入等体积的预冷异丙醇，充分混匀，-20℃放置30min，12000rpm离心15min，弃上清，加入1ml 75%酒精洗涤DNA沉淀，弃酒精，风干，加100μl TE溶解DNA，4℃储存备用。

2.5 转基因番茄的PCR检测

用特异引物V2C1-93F：TCCAAGGCACAAACAAGCGACGA和FAD-intron96R:TATCGTGAGCGGAGAAATTCACAG进行PCR检测RNAi载体的V2C1嵌合基因序列和内含子部分序列，目的片段大小为400 bp左右，非转基因番茄为对照。PCR扩增程序如下：95℃预变性5 min；94℃变性30 sec，56℃退火30 sec，72℃延伸50 sec，30个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，电泳检测结果显示：有13株番茄再生植株能扩增出400bp大小的片段，而非转基因植株没有扩增到特异条带（图1），证明RNAi框架已经整合至番茄基因组。

3、转基因番茄的TYLCV抗性鉴定

3.1 农杆菌注射接种

采用农杆菌注射法将含有TYLCV的农杆菌侵染性克隆(叶剑,青玲,周雪平.与中国番茄黄化曲叶病毒伴随的DNAβ分子βC1缺失突变体介导的交叉保护作用初步研究. 浙江大学学报(农业与生命科学版),2006,32: 479-482.)对4-6叶期苗龄的非转基因和转基因番茄进行注射接种，具体操作如下：1ml一次性注射器吸取含有TYLCV的农杆菌侵染性克隆，在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部注射，或者在植株叶柄处取三点进行韧皮部注射，或者在上部嫩叶背部用带有菌液的针头划伤，接种植株置于防虫温室，在25℃、16/8h光照周期下培养。

3.2农杆菌注射接种转基因番茄植株体内病毒的PCR检测和抗病鉴定

提取农杆菌注射接种15d的番茄叶片DNA，用病毒特异引物TYLCV-V1F:  CGCCCGTCTCGAAGGTTC和TYLCV-V1R: GCCATATACAATAACAAGGC进行PCR检测，PCR扩增程序如下：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸50 s，30个循环；72℃延伸5 min。结果发现对照植株能扩增明亮的病毒特异条带，部分转基因植株（2、3、4、5、7、9、11、15号植株）也能检测到该特异条带，但条带亮度比对照植株暗，而1、8、10、12和13号转基因植株没有检测到病毒特异条带，初步表明该几个转基因株系对TYLCV有抗性。病症表现方面，非转基因番茄植株的顶端新叶出现卷曲、产生耳突，严重者叶片向上卷曲皱缩，植株表现矮化，而1、8、10、12和13号转基因植株未表现发病症状（图2）。

3.3 烟粉虱传毒实验

将转基因番茄植株和非转基因对照置于防虫温室，25℃、16/8h光照周期进行培养，通过携带TYLCV的烟粉虱（纠敏,周雪平,刘树生.烟粉虱传播双生病毒研究进展.昆虫学报,2006,49:513-520;吴丹,张保龙,杨郁文,倪万潮,赵统敏,张云华,王荣富.不同启动子在转基因烟草中抗番茄黄化曲叶病毒的研究.江苏农业学报,2010,26(1):55-60）进行捕食和传毒，30d内观察植株症状。结果发现非转基因植株严重感病,植株上半部分的新叶明显卷曲皱缩，植株矮化，生长期后期开花不畅；而10和13号转基因植株未观察到明显的发病症状（图3），表明转基因植株对TYLCV有良好抗病性。

SEQ ID NO.1 

V2基因片段

cagaagctttcaaccaatcaaattgcatcctcaaacgttagataagtgttcatttgtctttatatacttggtccccaagtagtttgtcttgcactatgtgggatccacttctaaatgaatttcctgaatctgttcacggatttcgttgtatgttagctattaaatatttgcagtccgttgaggaaacttacgagcccaatacattgggccacgatttaattagggatcttatatctgttgtaagggcccgtgactatgtcgaagcgaccaggcgatataatcatttccacgcccgtctcgaaggttcgccgaaggctgaacttcgacagcccatacagcagccgtgctgctgtccccattgtccaaggcacaaacaagcgacgatcatggacgtacaggcccatgtaccggaagcccagaatatacagaatgtatcgaagcccatgcctcgtt

SEQ ID NO.2 

C1基因片段

gtatcgaagcccatgcctcgtttatttaaaatatatgccaaaaattatttcctaacatatcccaattgttctctctctaaagaggaagcactttcccaattgaaaaacctagaaaccccaacaaataaaaaatacatcaaagtttgcagagaactccacgagaatggggaaccacatctccatgtgcttatccaattcgaaggcaaataccaatgtaagaaccaacggttcttcgacctggtatccccaaacaggtcagcacatttccatccgaacattcaggcagctaagagctcaacagatgtcaagacctacgtggaaaaagacggagacttcattgattttggagttttccaaatcgatggcagatcagctagaggaggtcagcaatctgccaacgacgcatatgccgaggcactcaattcaggcagtaaatccgaggccctcaatatattaaaagagaaggccccaaaggactatattttacaatttcataatttaagttcaaatttagataggatttttagtcctcctttagaagtttatgtttctccatttctttcttcttcttttaatcaagttccagatgaacttgaagagtgggtcgccgagaacgtcgtatcttccgctgcgcggccatggagacccataagtattgtcgttgagggtgatagcagaacaggcaaaacaatgtgggccaggtctctaggcccacataattatttatgtggacatttagacctaagcccaaaggtgtacagtaatgatgcgtggtacaacgtcattgatgacgtagacccgcattatttaaagcacttcaaggaattcatgggggcccagagggactggcaaagcaacacaaagtacgggaagcccattcaaattaaagggggaattcccactatcttcctctgcaatccaggacctacctcctcatatagggaatatctagacgaagaaaaaaacatatccttgaaaaattgggctctcaagaatgcaaccttcgtcaccctctacgagccactgttcgcaagtatcaatcaaggtccaacacaagatagccaagaagaaaccaataaggcgtaagcgtgtagaagcttgac

SEQ ID NO.3

V2C1嵌合基因片段

aggcgatataatcatttccacgcccgtctcgaaggttcgccgaaggctgaacttcgacagcccatacagcagccgtgctgctgtccccattgtccaaggcacaaacaagcgacgatcatggacgtacaggcccatgtaccggaagcccagaatatacagaatgtatcgaagcccatgcctcgtttatttaaaatatatgccaaaaattatttcctaacatatcccaattgttctctctctaaagaggaagcactttcccaattgaaaaacctagaaaccccaacaaataaaaaatacatcaaagtttgcagagaactccacgagaatggggaaccacatctccatgtgcttatccaattcgaaggcaaataccaatgtaagaaccaacggtt

SEQUENCE LISTING

<110>  江苏省农业科学院

<120>  一种利用RNAi技术培育抗TYLCV番茄的方法

<130>  0

<160>  13   

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  453

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  V2基因片段

<222>  (1)..(453)

<223> 

<400>  1

cagaagcttt caaccaatca aattgcatcc tcaaacgtta gataagtgtt catttgtctt     60

tatatacttg gtccccaagt agtttgtctt gcactatgtg ggatccactt ctaaatgaat    120

ttcctgaatc tgttcacgga tttcgttgta tgttagctat taaatatttg cagtccgttg    180

aggaaactta cgagcccaat acattgggcc acgatttaat tagggatctt atatctgttg    240

taagggcccg tgactatgtc gaagcgacca ggcgatataa tcatttccac gcccgtctcg    300

aaggttcgcc gaaggctgaa cttcgacagc ccatacagca gccgtgctgc tgtccccatt    360

gtccaaggca caaacaagcg acgatcatgg acgtacaggc ccatgtaccg gaagcccaga    420

atatacagaa tgtatcgaag cccatgcctc gtt                                 453

<210>  2

<211>  1103

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  C1基因片段

<222>  (1)..(1103)

<223> 

<400>  2

gtatcgaagc ccatgcctcg tttatttaaa atatatgcca aaaattattt cctaacatat     60

cccaattgtt ctctctctaa agaggaagca ctttcccaat tgaaaaacct agaaacccca    120

acaaataaaa aatacatcaa agtttgcaga gaactccacg agaatgggga accacatctc    180

catgtgctta tccaattcga aggcaaatac caatgtaaga accaacggtt cttcgacctg    240

gtatccccaa acaggtcagc acatttccat ccgaacattc aggcagctaa gagctcaaca    300

gatgtcaaga cctacgtgga aaaagacgga gacttcattg attttggagt tttccaaatc    360

gatggcagat cagctagagg aggtcagcaa tctgccaacg acgcatatgc cgaggcactc    420

aattcaggca gtaaatccga ggccctcaat atattaaaag agaaggcccc aaaggactat    480

attttacaat ttcataattt aagttcaaat ttagatagga tttttagtcc tcctttagaa    540

gtttatgttt ctccatttct ttcttcttct tttaatcaag ttccagatga acttgaagag    600

tgggtcgccg agaacgtcgt atcttccgct gcgcggccat ggagacccat aagtattgtc    660

gttgagggtg atagcagaac aggcaaaaca atgtgggcca ggtctctagg cccacataat    720

tatttatgtg gacatttaga cctaagccca aaggtgtaca gtaatgatgc gtggtacaac    780

gtcattgatg acgtagaccc gcattattta aagcacttca aggaattcat gggggcccag    840

agggactggc aaagcaacac aaagtacggg aagcccattc aaattaaagg gggaattccc    900

actatcttcc tctgcaatcc aggacctacc tcctcatata gggaatatct agacgaagaa    960

aaaaacatat ccttgaaaaa ttgggctctc aagaatgcaa ccttcgtcac cctctacgag   1020

ccactgttcg caagtatcaa tcaaggtcca acacaagata gccaagaaga aaccaataag   1080

gcgtaagcgt gtagaagctt gac                                           1103

<210>  3

<211>  392

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  V2C1嵌合基因片段

<222>  (1)..(392)

<223> 

<400>  3

aggcgatata atcatttcca cgcccgtctc gaaggttcgc cgaaggctga acttcgacag     60

cccatacagc agccgtgctg ctgtccccat tgtccaaggc acaaacaagc gacgatcatg    120

gacgtacagg cccatgtacc ggaagcccag aatatacaga atgtatcgaa gcccatgcct    180

cgtttattta aaatatatgc caaaaattat ttcctaacat atcccaattg ttctctctct    240

aaagaggaag cactttccca attgaaaaac ctagaaaccc caacaaataa aaaatacatc    300

aaagtttgca gagaactcca cgagaatggg gaaccacatc tccatgtgct tatccaattc    360

gaaggcaaat accaatgtaa gaaccaacgg tt                                  392

<210>  4

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  F1

<222>  (1)..(31)

<223> 

<400>  4

cagaagcttt caaccaatca aattgcatcc t                                    31

<210>  5

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  R1

<222>  (1)..(38)

<223> 

<400>  5

aacgaggcat gggcttcgat acattctgta tattctgg                             38

<210>  6

<211>  38

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  F2

<222>  (1)..(38)

<223> 

<400>  6

gtatcgaagc ccatgcctcg tttatttaaa atatatgc                             38

<210>  7

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  R2

<222>  (1)..(30)

<223> 

<400>  7

gtcaagcttc tacacgctta cgccttattg                                      30

<210>  8

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  F3

<222>  (1)..(32)

<223> 

<400>  8

ctaggatcca tgaggcgata taatcatttc ca                                   32

<210>  9

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  R3

<222>  (1)..(29)

<223> 

<400>  9

tgcaagctta accgttggtt cttacattg                                       29

<210>  10

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  F4

<222>  (1)..(29)

<223> 

<400>  10

gatctcgaga accgttggtt cttacattg                                       29

<210>  11

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  R4

<222>  (1)..(29)

<223> 

<400>  11

gttgagctca ggcgatataa tcatttcca                                       29

<210>  12

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  V2C1-93F

<222>  (1)..(23)

<223> 

<400>  12

tccaaggcac aaacaagcga cga                                             23

<210>  13

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工

<220>

<221>  FAD-intron96R

<222>  (1)..(24)

<223> 

<400>  13

tatcgtgagc ggagaaattc acag                                            24