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1、(10)授权公告号 CN 101993839 B (45)授权公告日 2012.06.27 CN 101993839 B *CN101993839B* (21)申请号 201010234986.0 (22)申请日 2010.07.23 CCTCC NO ： M 2010121 2010.05.20 C12N 1/20(2006.01) C02F 3/02(2006.01) C02F 3/34(2006.01) B01D 53/84(2006.01) B01D 53/72(2006.01) A62D 3/02(2007.01) C12R 1/01(2006.01) C02F 101/36(200。
2、6.01) A62D 101/22(2007.01) (73)专利权人 浙江工业大学 地址 310014 浙江省杭州市下城区朝晖六区 专利权人 清华大学 (72)发明人 陈建孟 胡洪营 陈东之 席劲瑛 庄庆丰 於建明 朱润晔 (74)专利代理机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 代理人 黄美娟 冷红梅 DD 290917 A,1991.06.13, 全文 . CN 101732819 A,2010.06.16, 全文 . EJ Bormann， et al.The production of polyhydroxybutyrate by Methylobacterium rhodes。
3、ianum and Ralstonia eutropha in media containing glycerol and casein hydrolysates. BIOTECHNOLOGY LETTERS .1999, 第 21 卷 ( 第 12 期 ),1059 1063. 王家德， 等 . 二氯甲烷降解菌的分离及其特 性 .浙江工业大学学报 .2002, 第 30 卷 ( 第 1 期 ),48 52. (54) 发明名称 能够高效降解二氯甲烷的罗得西亚甲基杆菌 H13 及其应用 (57) 摘要 本发明提供了一株能高效降解 DCM 的菌 株罗得西亚甲基杆菌 (Methylobacteri。
4、um rhodesianum)H13， 保藏于中国典型培养物保藏 中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 430072， 保藏 日期 ： 2010 年 5 月 20 日， 保藏编号 ： CCTCC No ： M2010121。该菌株为好氧革兰氏阴性杆菌， 能够 以 DCM 为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底 物， 为生物法高效净化含 DCM 废水及废气的工程 应用奠定了基础。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吴汀晨 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书。
5、 4 页 附图 2 页 1/1 页 2 1. 一 株 二 氯 甲 烷 高 效 降 解 菌 罗 得 西 亚 甲 基 杆 菌 (Methylobacterium rhodesianum)H13， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 430072， 保藏日期 ： 2010 年 5 月 20 日， 保藏编号 ： CCTCCNo ： M 2010121。 2. 如权利要求 1 所述的罗得西亚甲基杆菌 H13 在微生物降解二氯甲烷中的应用。 3. 如权利要求 2 所述的应用， 其特征在于所述甲基杆菌 H13 用于降解废水中的二氯甲 烷。 4. 如权利要求 2 所述的应用，。
6、 其特征在于所述甲基杆菌 H13 用于降解废气中的二氯甲 烷。 5.如权利要求2或3所述的应用， 其特征在于所述降解在pH 5.510.0、 温度10 40、 Cl-浓度 1.36M 的条件下进行。 6. 如权利要求 4 所述的应用， 其特征在于所述降解在无机盐培养基中进行， 所述 无机盐培养基按如下组成配制 ： 4.5g Na2HPO412H2O、 1.0gKH2PO4、 1.8g(NH4)2SO4、 0.2g MgSO4 7H2O、 0.03g CaCl2 2H2O， 1mL微量元素， 用KH2PO4和K2HPO4调pH至7.0， 蒸馏水补足至 1L ； 微量元素溶液按如下组成配制 ： 1。
7、L 蒸馏水中加入 1.0g FeSO47H2O、 0.02gCuSO45H2O、 0.014g H3BO3、 0.10g MnSO44H2O、 0.10g ZnSO47H2O、 0.02g Na2MoO42H2O、 0.02g CoCl26H2O。 权 利 要 求 书 CN 101993839 B 2 1/4 页 3 能够高效降解二氯甲烷的罗得西亚甲基杆菌 H13 及其应用 ( 一 ) 技术领域 0001 本发明涉及一株能够高效降解二氯甲烷的罗得西亚甲基杆菌 H13 及其应用。 ( 二 ) 背景技术 0002 DCM( 二氯甲烷 ) 是一类使用非常广泛的化学试剂与溶剂。由于其沸点低 (40.1。
8、 )、 蒸汽压高 (20时 47Pa)， 气态排放是其进入环境的主要方式。当前， DCM 被认为 是大气污染中毒性较大的卤代烃类物质， 在水中的溶解度小， 但在脂类中的溶解度较大， 容 易在生物体的脂肪组织中积累， 具有很强的致癌、 致畸、 致突变作用， 被美国环境保护署列 入 129 种优先控制的有毒污染物名单。因此探索有效去除 DCM 的技术对社会和环境有着重 要的意义。 0003 多年以来， DCM 一度被认为是不可生物降解的物质， 在水体及大气环境中广泛存 在。直至后来人们通过实验证明了 DCM 可以被微生物降解及矿化， 相关的研究才得以进一 步开展。自从 1980 年 Brunner。
9、 等首次从工业废水中分离出能以 DCM 作为唯一碳源和能源 的 Pseudomonas sp.DM1 以来， 迄今报道已相继分离到包括 Hyphomicrobium sp.KDM2 在内 的 10 余株具备分解 DCM 能力的菌株。通过多年的研究， 人们充分肯定了微生物降解工业废 气中有机物的效果， 具有投资少、 运行费用低、 能耗小及管理方便等优点， 成为低浓度有机 废气 ( 2000mg/m3时 ) 治理的一个发展方向。 0004 近些年来， 出现了许多不同的技术应用于从废气中除去 DCM， 如焚烧， 吸附， 湿擦洗 法等， 但这些方法在处理相对较低浓度和大流量的 DCM 时价格非常昂贵。。
10、而生物工艺法因 其较低的运行费用、 较好的安全性和处理DCM的高效性， 所以在处理废气中的DCM方面越来 越受到重视。其中 Hatmans 等的研究表明用生物滴滤池处理废气中的 DCM 在技术上是可行 的， 当气体空床停留时间(EBRT)为9.6s时， 其实验室DCM的去除率为57.0， 而当EBRT为 20.8s时， 其实验室去除率可达85.0左右。 Young等也指出， 较高的液相回流率和自动、 准 确的控制 pH 值是生物滴滤池稳定运行的关键因素。但国内鲜见相关的研究报道。 0005 迄今尚未有罗得西亚甲基杆菌降解 DCM 的报道。 ( 三 ) 发明内容 0006 本发明的目的是针对现有。
11、 DCM 生物降解效率低、 微生物世代时间长的问题， 提供 了一株能高效降解 DCM 的菌株及其应用技术。 0007 本发明采用的技术方案是 ： 0008 一株 DCM 高效降解菌罗得西亚甲基杆菌 (Methylobacteriumrhodesianum) H13， 保藏于中国典型培养物保藏中心， 地址 ： 中国， 武汉， 武汉大学， 430072， 保藏日期 ： 2010 年 5 月 20 日， 保藏编号 ： CCTCC No ： M 2010121。 0009 所述罗得西亚甲基杆菌 H13 菌落特征如下 ： 菌体呈短杆状， 无芽孢 ； 菌落呈小圆 状、 粉色、 形态饱满、 光滑湿润、 易挑。
12、起， 菌苔沿划线生长 ； 氧化酶、 接触酶反应为阳性 ； 精氨 酸双水解酶、 硝酸盐还原反应、 半乳糖苷酶反应、 吲哚反应均为阴性 ； 不能水解淀粉和明胶 ； 说 明 书 CN 101993839 B 3 2/4 页 4 糖发酵实验为阴性， 革兰氏染色阴性。该菌株的 16S rDNA 的 GenBank 登录号为 HM245434。 0010 本发明还涉及所述的罗得西亚甲基杆菌 H13 在微生物降解 DCM 中的应用。 M.rhodesianum H13 能利用 DCM 作为唯一碳源和能源生长， 将 DCM 完全矿化成 Cl-、 CO2和 H2O。在纯培养条件下， 该菌能在 23h 内能将 5。
13、mM DCM 完全降解。 0011 具体的， 所述甲基杆菌 H13 可用于降解废水或废气中的 DCM。 0012 优选的， 所述降解在 pH 5.5 10.0、 温度 10 40、 Cl-浓度 1.36M(0 1.36M， 优选 0 0.68M) 的条件下进行。实验发现， Cl-浓度为 0 时， H13 菌对 DCM 的降解效 果和生长情况最好 ； 随 Cl-浓度的增加， H13 菌的生长延滞期相应延长， 且 DCM 的降解速率 变慢， 当 Cl-浓度高于 0.68M 时， H13 菌基本不生长， 对 DCM 的降解也很差。 0013 用于降解废气中的二氯甲烷时， 所述降解可在无机盐培养基中进。
14、行， 所述无机盐 培养基组成如下 ： 4.5g Na2HPO4 12H2O、 1.0g KH2PO4、 1.8g(NH4)2SO4、 0.2g MgSO4 7H2O、 0.03g CaCl22H2O， 1mL 微量元素， 用 KH2PO4和 K2HPO4调 pH 至 7.0， 蒸馏水补足至 1L ； 微量元素溶 液按如下组成配制 ： 1L 蒸馏水中加入 1.0g FeSO47H2O、 0.02g CuSO45H2O、 0.014g H3BO3、 0.10g MnSO44H2O、 0.10g ZnSO47H2O、 0.02gNa2MoO42H2O、 0.02g CoCl26H2O。 0014 本。
15、发明的有益效果主要体现在 ： 提供了一株能高效降解 DCM 的菌株， 该菌株为好 氧革兰氏阴性杆菌， 能够以 DCM 为唯一碳源与能源生长同时高效降解该底物， 为生物法净 化含 DCM 废水及废气的工程应用奠定了基础。 ( 四 ) 附图说明 0015 图 1 为 H13 菌的生长曲线及 Cl-浓度的变化曲线。 0016 图 2 为不同 pH 对 H13 菌降解 DCM 的影响。 0017 图 3 为不同温度下菌体浓度及 DCM 浓度随时间变化情况。 0018 图 4 为不同 Cl-浓度对 DCM 降解菌的影响。 ( 五 ) 具体实施方式 0019 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述， 但。
16、本发明的保护范围并不仅限于 此 ： 0020 实施例 1 ： M.rhodesianum H13 的分离与鉴定 0021 (1) 样品采集及驯化 0022 现场采集台州某医药厂污水处理池的活性污泥， 以 DCM 为唯一碳源和能源， 进行 驯化、 富集。数月后， 经富集后的活性污泥， 接种到含 50mL 无机盐培养基的 250mL 密封盐水 瓶中， 以 DCM 作为唯一碳源和能源， 继续培养、 富集。实验需恒温 (301 )， 并保持在好氧 条件下进行。 0023 无 机 盐 培 养 液 成 分 ： 1L 蒸 馏 水 中 加 入 4.5g Na2HPO412H2O、 1.0gKH2PO4、 1.。
17、8g(NH4)2SO4、 0.2g MgSO47H2O、 0.03g CaCl22H2O， 1mL 微量元素溶液。 0024 微量元素溶液成分 ： 1L 蒸馏水中加入 1.0g FeSO4 7H2O、 0.02gCuSO4 5H2O、 0.014g H3BO3、 0.10g MnSO44H2O、 0.10g ZnSO47H2O、 0.02gNa2MoO42H2O、 0.02g CoCl26H2O。 0025 (2) 菌株分离与鉴定 0026 将在盐水瓶中经过多次传代富集的混合菌液， 进行稀释涂布， 依据菌体群落的差 说 明 书 CN 101993839 B 4 3/4 页 5 异性， 挑取单菌。
18、落。对单菌落进行多次划线分离后， 再接至以 DCM 为唯一碳源和能源的无机 盐培养液中， 测试降解活性。选择具有 DCM 降解能力的纯菌， 进一步分离纯化， 获得有 DCM 降解活性的菌株 H13。 0027 菌株 H13 细胞呈短杆状， 无芽孢 ； 菌落呈小圆状、 透明、 粉色、 形态饱满、 光滑湿润， 易挑起， 菌苔沿划线生长 ； 革兰氏染色呈阴性。 0028 经 API 细菌鉴定系统获得 H13 的生理生化特征为 ： 氧化酶、 接触酶反应为阳性 ； 精 氨酸双水解酶、 硝酸盐还原反应、 半乳糖苷酶反应、 吲哚反应为阴性 ； 不能水解淀粉和明胶 ； 糖发酵实验为阴性。 0029 上述特征与。
19、文献 ( 常见细菌鉴定手册 ) 编录的甲基杆菌属的生理生化性状相吻 合。 该菌株经16S rDNA同源性分析， H13与M.rhodesianum的亲缘关系最近， 相似度达99。 结合以上生理生化特征， 因此确定本实验获得的 DCM 降解菌为 M.rhodesianum。 0030 实施例 2 ： M.rhodesianum H13 降解 DCM 的特性 0031 接种 M.rhodesianum H13 种子液 (OD600 0.186)2mL 于 50mL 无机盐培养基， 加入 DCM 使初始 DCM 浓度为 5mM， 置于温度为 30、 转数为 160r/min 的摇床中培养， 每隔一定。
20、时 间取样检测。结果见图 1。随着反应的进行， 菌体浓度逐渐增大 ； 至 23h 时， DCM 被完全降 解， 菌体浓度达到 OD600 0.192。本实施例说明降解菌 M.rhodesianum H13 可利用 DCM 作 为唯一碳源和能源进行生长， 并且具有高效降解 DCM 的能力。 0032 调 节 反 应 体 系 pH 分 别 为 5.5、 6.0、 6.5、 6.8、 7.0、 7.2、 7.5、 8.0、 8.5、 9.0、 9.5、 10.0。在各反应体系中的加入 DCM 使初始浓度为 5mM ； 接入初始 OD600 0.186 的 M.rhodesianum H13种子液2m。
21、L， 置于恒温摇床里振荡(30， 160r/min)， 18h后取样测其降 解率， 结果见图 2。在 pH5.5 10.0， 微生物均能降解 DCM 并伴随细胞浓度的增加。随着 pH 从 5.5 增大到 10.0， 菌体浓度及 DCM 降解率均先增大后减小， M.rhodesianum H13 降解 DCM 的较适宜的 pH 值为 7.0。本实施例说明菌株 H13 在中性和偏碱性的较宽 pH 范围内能较好 得降解 DCM， 为其在不同 pH 环境的应用提供了保证。 0033 控制反应体系 pH 为 7.0， 加入 DCM 使初始浓度为 5mM， 添加初始 OD600 0.186 的 M.rho。
22、desianum H13 种子液 2mL， 分别置于温度为 25、 30、 37摇床 ( 转数 160r/min) 中恒温振荡， 定时取样检测 M.rhodesianumH13 菌体浓度和 DCM 残留浓度。结果见图 3。 M.rhodesianum H13在25、 30、 37都能够较好地生长， 且能较快地降解DCM。 其中30 为菌株生长及 DCM 降解较适宜的温度。另外， 当温度低至 10或高于 40时， DCM 的降解 仍可进行， 但速度比较缓慢。 0034 分别控制初始反应体系 Cl-浓度分别为 0M、 0.017M、 0.17M、 0.34M、 0.68M、 1.02M、 1.36。
23、M， 加入 DCM 使初始浓度为 5mM， 添加初始 OD600 0.186 的 M.rhodesianum H13 种子液 2mL。定时检测菌体浓度和 DCM 残留浓度。由图 4 可知， 当 Cl-浓度为 0M 时， H13 菌对 DCM 的降解效果和生长情况最好 ； 随 Cl-浓度的增加， H13 菌的生长延滞期相应延长， 且 DCM 的 降解速率变慢。当 Cl-浓度高于 0.68M 时， H13 菌基本不生长， 对 DCM 的降解也很差。本实 施例说明 H13 菌能在 Cl-浓度为 0M 0.68M 时生长。 0035 实施例 3 ： M.rhodesianum H13 净化 DCM 废。
24、气 0036 在有机玻璃生物滴滤塔内的聚丙烯填料表面上， 用 M.rhodesianumH13 菌悬液接 种和挂膜， 用无机盐培养基作为生物滴滤塔内 H13 菌的营养液进行循环喷淋， 液体喷淋量 说 明 书 CN 101993839 B 5 4/4 页 6 1010-3 1210-3m3/h， pH6.5 7.5， 控制温度 30左右， 连续通入 DCM 气体， 进口浓度 5500mg/m3， 停留时间3045s。 挂膜30天后， 生物滴滤塔对DCM的净化效率可达80 99。 说 明 书 CN 101993839 B 6 1/2 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101993839 B 7 2/2 页 8 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101993839 B 8 。