含有-氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌.pdf

本发明为含有α-氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌，解决原有宿主菌黄单胞菌Xanthomonas?rubrilineans的β-内酰胺酶对β-内酰胺环的水解作用。测定了来源于Xanthomonas?rubrilineans菌株的a-氨基酸酯水解酶基因全序列及其所编码的酶蛋白，确定目的基因aeh，并提供含有该基因的重组质粒pET28a及构建的E.coli?BL21（DE3）宿主菌，该宿主菌拉丁文名：Escherichia?coli，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC?No.4757。目的基因氨基酸序列见序列表中序列2，目的基因核酸碱基序列见序列表中序列1。该宿主菌克服了原有宿主菌的β-内酰胺酶对诸多头孢类抗生素母核，如：7-ADCA等及其衍生物有破坏性的缺点。该宿主菌可一般地应用于合成头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢曲嗪、头孢唑啉。

1.含有α-氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌，其特征在于该大肠杆菌拉丁文名：，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2011年4月11日，保藏编号CGMCC No.4757。 2.如权利要求1所述的含有α-氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌在合成头孢氨苄、头孢丙烯、头孢曲嗪和头孢唑啉中的应用。



技术领域：

本发明涉及α-氨基酸酯水解酶，更具体地说是涉及黄单胞菌Xanthomonas rubrilineans菌株的α-氨基酸酯水解酶（α-amino acid ester hydrolase, AEH）基因的全序列及其所编码的酶蛋白，目的基因aeh基因克隆在大肠杆菌中的稳定表达。

背景技术：

1972年，Takahashi等人在寻找能合成侧链有氨基的β-内酰胺抗生素的过程中，发现某些细菌能够通过α-氨基酸酯酰化7-aminocephem类母核合成非天然的头孢类抗生素。而负责该反应的酶由于底物范围限于带α-氨基的酰基供体，而且相对酰胺，该酶和酯的亲和性更高的原因被命名为α-氨基酸酯水解酶。α-氨基酸酯水解酶有诸多优点：由于和酰胺的亲和力低，底物水解少；不受苯甘氨酸的抑制；对D型苯甘氨酸甲酯有构象选择性，工业上可以直接使用消旋混合物，而不必先进行拆分；其最适反应pH比青霉素酰化酶低，也使反应体系中的底物和产物更稳定。长期以来，对α-氨基酸酯水解酶的研究受到生物学家和药学家的重视，有关α-氨基酸酯水解酶产酶菌株的分离、酶基因的鉴定及其在生物转化中的应用也有不少报道。Polderman-Tijmes等人通过定点突变确定了混浊醋酸杆菌（Acetobacter turbidans）产α-氨基酸酯水解酶的活性中心氨基酸位点(J.Biological Chemistry vol277,No32:28474,2002)。Barends等人描述了柑橘黄单胞菌（Xanthomonas citri）中α-氨基酸酯水解酶的基因序列，及1.9埃分辨率的酶晶体结构（J.Biological Chemistry vol278，No25:23076，2003）。

在使用Xanthomonas rubrilineans菌株所产α-氨基酸酯水解酶合成头孢氨苄、头孢丙烯、头孢曲嗪和头孢唑啉的过程中发现，在所制备无细胞裂解液中含有头孢菌素酶，而该酶对β-内酰胺环具有极强的水解活力。虽然可以通过进一步纯化细胞裂解液特异性地去除头孢菌素酶，但由于生产成本和产品质量，纯化不是理想的措施。

发明内容：

本发明的目的是构建一个转化体的重组载体中导入的α-氨基酸酯水解酶基因片断可以使大肠杆菌表达宿主制备的无细胞裂解液没有原宿主黄单孢菌株对β—内酰胺环的明显的破坏作用，可应用于合成头孢类抗生素药物的含有α-氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌。

缩写列表

7—ADCA：7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸

PGM：D-苯甘氨酸甲酯

7—ACCA：7-氨基-3氯-头孢烷酸

7—ACA：7-氨基头孢烷酸

7—APRA：7-氨基-3-丙烯基头孢烷酸

7—TACA：7-氨基-3-(1,2,3-三唑-5-硫)甲基-头孢烷酸

本发明是这样实现的：

本发明含有α—氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌，其特征在于是由大肠杆菌携带导入的含-—氨基酸酯水解酶基因片断aeh作为目的基因的重组质粒pET28a—aeh构成，大肠杆菌的脱氧核糖核酸的碱基序列见序列表中序列1，导入的目的基因的氨基酸序列见序列表中序列2。

制备方法如下：

（1）提取黄单孢菌基因组，

（2）将黄单孢菌基因组用PCR方法扩增目的基因aeh，所用载体为pGEM-T，aeh的酶切位点为EcoRI和XhoI，将EcoRI-aeh-XhoI片段与载体pGEM-T连接，转化入宿主菌JM109，选择白色菌落，得重组质粒pGEM-T-aeh，

（3）将重组质粒pGEM-T-aeh和载体pET28a双酶切，对线性化后的pET28a载体进行去磷酸化，用连接酶将aeh和载体pET28a连接，转化入宿主菌JM109，得重组质粒pET28a-aeh，

（4）从宿主菌JM109中提取重组质粒pET28a-aeh转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，

（5）培养转化细胞，使重组质粒pET28a—aeh随大肠杆菌BL21（DE3）细胞一起大量扩增，

（6）从扩增的细胞中筛选出含有重组质粒的pET28a-aeh细胞，即得大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-aeh。

步骤（2）中以黄单孢菌基因组为模板，一对寡核苷酸EcoRI5′和XhoI3′为引物，扩增得EcoRI5′3′XhoI片段，经凝胶电泳分离纯化，得分别在5′端和3′端具有EcoRI5′和XhoI′酶切位点的片断与载体pGEM-T连接。

应用于7-ADCA或7-APRA或7-TACA或7-ACA衍生物的合成。

7-ADCA、7-APRA、7-TACA、7-ACA的衍生物分别是头孢氨苄、头孢丙烯、头孢曲嗪和头孢唑啉。

本发明中的大肠杆菌表达宿主所制备的无细胞裂解液对β-内酰胺环的破坏作用明显减少，可用于以7-ADCA为中间体合成头孢氨苄、头孢丙烯、头孢克洛、头孢曲嗪、头孢唑啉。具有工业应用前景。

原产生菌Xanthomonas rubrilineans和本发明大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-aeh应用于7-ADCA到头孢氨苄的转化过程中对β-内酰胺环的破坏程度的比较。

本发明大肠杆菌由北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏时间2011年4月11日，保藏编号CGMCC No.4757。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。分类命名：大肠埃希氏菌   Escherichia  coli。

将原产生菌Xanthomonas rubrilineans和大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-aeh分别应用于7-ADCA到头孢氨苄、7-APRA到头孢丙烯、7-TACA到头孢曲嗪的转化，比较它们对β-内酰胺环的破坏程度。

表1 原产生菌Xanthomonas rubrilineans和本发明大肠杆菌BL21（DE3）/pET28a-aeh应用于7-ADCA到头孢氨苄的转化过程中对β-内酰胺环的破坏程度表的数据可以看出大肠杆菌宿主对β-内酰胺环的破坏程度大大降低，可应用于大规模的生产之中。

附图说明：

图1为构建pET28a-aeh流程图。

图2为构建本发明的大肠杆菌流程图。

具体实施方式：

一、来源于Xanthomonas rubrilineans的α-氨基酸酯水解酶基因全序列及其所编码的酶蛋白：

来源于Xanthomonas rubrilineans的α-氨基酸酯水解酶基因aeh为双链DNA，长度为1917bp。

表2  克隆α-氨基酸酯水解酶基因aeh所需的菌株、质粒及其他商品

（1）亚克隆及DNA序列测定：

以pGEM-T为载体构建的aeh基因的亚克隆流程图见图1，序列见序列表中序列1，序列表中序列3、4给出了所用引物的序列。

步骤1：Xanthomonas rubrilineans基因组提取 

红纹黄单胞菌培养过夜，离心收集菌体，将菌体重悬于溶菌酶溶液中。该溶菌酶溶液的组分为：20mg/ml 溶菌酶，20mM Tris-HCl,2.5mM EDTA, 1% Triton X-100。37℃水浴30-60min。加入蛋白酶K溶液，56℃水浴30min至细胞完全裂解。依次加入Binding Buffer,无水乙醇，充分混匀。将以上得到的溶液加入吸附柱，放入收集管。离心后，倒掉收集管中的液体。向吸附柱中加入PW Solution,离心，倒掉收集管中的液体。再向吸附柱中加入Wash Solution，离心，倒掉收集管中的液体。将吸附柱重新放回收集管，离心除去残留的乙醇。将吸附柱放入干净的1.5ml离心管中，在吸附柱中央加入50-100ul预热至60℃的Elution Buffer,静置3min，离心，离心管中收集到的液体即为红纹黄单胞菌基因组DNA溶液。

步骤2：引物的设计及合成。

正向引物见序列表中序列3，反向引物见序列表中序列4。

组分体积(ul)基因组模板520uM正向引物120uM反向引物110×缓冲液525uM dNTPs2pfu酶 5U/ul0.5H2O35.5总体积50

 步骤3：PCR法克隆目的基因

PCR反应参数：

1.94℃        3分钟

2.94℃        30秒

3.58℃        90秒

4.72℃        2分钟

5.2-4步       ×19次

6. 72℃        10分钟

步骤4：电泳分离并回收目的基因

将步骤3得到的PCR产物与6×核酸电泳上样缓冲液混合，在0.8%低熔点琼脂糖凝胶上，电泳回收2Kb的带酶切位点的aeh片段。

步骤5：pGEM-T-aeh重组质粒的获得

将步骤4的产物与pGEM-T连接并转化JM109，在LB Amp平板上选择白色菌落。扩大培养，提取质粒，进行插入片段测序。

（2）pET28a-aeh重组质粒的构建（图1）

本发明提供一种新的重组质粒pET28a-aeh，它是一双链环状DNA，长度为7250bp，其主要基因型为aeh，kanaR。

步骤1 aeh基因插入片段的制备

EcoRI、XhoI双酶切3 ug的pGEM-T-aeh重组质粒，电泳分离，回收2Kb片段。

步骤2 pET28a载体的制备

EcoRI、XhoI双酶切3 ug的pET28a载体，脱磷，电泳回收。

步骤3 线性pET28a与aeh基因片段的重组

分别由步骤1和步骤2得到的脱磷pET28a 100ng(5ul)与aeh片段200ng(8ul)混合，溶解于连接缓冲液中，加入1ul T4 DNA连接酶，16℃反应16小时。

步骤4 带aeh基因的重组质粒pET28a-aeh的筛选

步骤3的连接酶混合液用于转化JM109感受态细胞并在含30ug/ml卡那霉素的LB平板上37℃培养24小时。随机挑取14个转化菌落，培养后抽提质粒DNA和酶切电泳鉴定。确定6株转化菌的质粒DNA中带有2Kb的外源aeh基因片段。

（3）重组质粒pET28a-aeh在宿主菌BL21(DE3)中的表达

步骤1 转化

从携带重组质粒pET28a-aeh的宿主菌JM109中提取重组质粒pET28a-aeh，转化感受态BL21(DE3)，并在含30ug/ml卡那霉素的LB平板上37℃培养24小时。随机挑取14个转化菌落，培养后抽提质粒DNA和酶切电泳鉴定。

步骤2 培养及诱导

过夜培养物转接入装有100ml NZCYM培养基（含kana）的500ml摇瓶，37℃，150rpm培养4小时。加入IPTG，使其终浓度为1mM。20℃，摇床转速150转/分钟的条件下诱导20小时，收集菌体，置-20℃冻存备用。

（4）α-氨基酸酯水解酶N端氨基酸序列的测定（序列见序列表中序列2）

步骤1：电转印步骤

a)      准备转印膜 将Millipore的硝酸纤维素膜在转移缓冲液平衡10-15min,

b)      纯化后的α-氨基酸酯水解酶样品参照Harlow and Lane（1988年）的方法进行SDS-PAGE电泳，完毕拆卸凝胶夹层，除去积层胶。然后将凝胶浸泡于含20ug/ml DTT和1%甲醇的10mM CAPS 转膜缓冲液中约10min。

c)      将凝胶和硝酸纤维素膜按“夹心饼”的方式固定，放入转膜装置中，恒压50V电转移1h。

d)      将硝酸纤维素膜从转印装置中取出，放入含有20ug/ml DTT的重蒸水中漂洗。

e)      将已转移过样品的硝酸纤维素膜放入甲醇/水/乙酸=5/4/1溶解的2.5mg/ml考马斯亮蓝R-250溶液中染色20min，然后再甲醇/水/乙酸=5/4/1的溶液中脱色，直到背景为白色为止。

步骤2：氨基酸序列分析

将准备测序的蛋白亚基从硝酸纤维素膜上切割下来，放入Beckman LF-3200蛋白多肽测序仪上测定N端氨基酸序列。

二、α-氨基酸酯水解酶活力测定

步骤1：大肠杆菌培养物无细胞裂解液的制备

将实施例3中得到的培养物按照《分子克隆实验指南》第15章方案7制备无细胞裂解液。

步骤如下：

1 每100ml细胞培养物的细胞沉淀悬于4mlpH7.8的缓冲液（20mM 磷酸钠，500mM NaCl），

2加入溶菌酶至终浓度1mg/ml,冰上放置30min，

3混合物于4℃摇床上孵育10min，

4加入TritonX-100,DNase,RNase, 终浓度分别为1%，5ug/ml和5ug/ml，再于4℃摇床上孵育10min，

5 4℃3000g离心30min，去除不溶性细胞碎片。上清即为无细胞裂解液。

步骤2：底物溶液的准备（以100ml为例）

以80ml 0.1M，pH7.5磷酸-氨水缓冲液溶解7-ADCA使终浓度为0.04mol/L，磁力搅拌下缓慢滴加1M 氨水调节pH直至7-ADCA完全溶解，加入苯甘氨酸甲酯，磁力搅拌溶解完全后，立刻以0.1M盐酸调节至pH6.0。最后以0.1M pH6.0磷酸-氨水缓冲液定容至100ml。

步骤3：酶反应过程

反应在25ml的锥形瓶中进行，加入9ml底物溶液和1ml无细胞裂解液，在40℃的水浴摇床中保温振荡。反应进行30min时，取出反应液用蒸馏水稀释20倍终止反应，再以HPLC流动相稀释5倍。

步骤4：HPLC法检测生成的头孢氨苄的量

分析参数

分析柱：C18柱，4×250mm，

进样量：20ul

流动相：甲醇︰0.04M pH2.1磷酸-氨水缓冲液=3︰7

检测波长：254nm

α-氨基酸酯水解酶活力的定义：在特定条件下（pH6.0，40℃，底物初始浓度7-ADCA0.04mol/L，苯甘氨酸甲酯0.08mol/L），每分钟转化7-ADCA和苯甘氨酸甲酯生成1umol头孢氨苄的酶量定义为一个酶活力单位，以1U表示。

反应液中头孢氨苄的浓度C头孢氨苄（umol/ml）=Sx·Cs·Dx·γ·1000/(Ss·Ds·347.4)

其中：Sx、Ss分别为反应液中和标准溶液中头孢氨苄的峰面积

Cs为标准溶液中头孢氨苄的浓度，mg/ml

Dx、Ds分别为反应液和标准溶液在HPLC分析前的稀释倍数

γ为标准品中头孢氨苄的相对含量

1000为mg至ug的转换

347.4为头孢氨苄的分子量

根据以下公式计算酶活力

酶活力(U/ml)= C头孢氨苄·Vrm/(t·ν)

其中：C头孢氨苄为反应液中头孢氨苄的浓度，umol/ml

Vrm为反应液的体积，此处为10ml

       t为反应时间，此处为30min

       ν为参加反应的裂解液的体积

三、原产生菌X. rubrilineans无细胞裂解液和工程宿主菌无细胞裂解液应用于头孢氨苄、头孢丙烯、头孢曲嗪合成过程中β-内酰胺环破坏程度的比较（数据见表）

步骤1：被测无细胞裂解液的制备

按照（5）中步骤1的方法制备

步骤2：底物溶液的准备

按照（5）中步骤2的方法制备。

将无细胞裂解液与底物溶液以1︰9（体积比）的比例混匀后在40℃的水浴摇床中保温振荡。反应进行120min，过程中用1N氨水调整pH，使其维持在6.0左右。间隔取样取出反应液用蒸馏水稀释20倍终止反应，再以HPLC流动相稀释5倍。高压液相法测定产物和底物母核的浓度。

序列表

<110>叶丽娟 王辂 李端华 赵晨 褚以文 潘佳林

<120>含有α-氨基酸酯水解酶基因的大肠杆菌

<160>6

<170>Patent In Version 3.3

<210>1

<211>1917

<212>DNA 

<213>红纹黄单胞菌（Xanthomonas rubrilineans）

<400>1

atgcgccgca tcgctccctg cctgcccgcc gccgccgtcg ccctcgccac caccggcgcc     60

gcgttcgccc agaccgcgcc gatgacgccg gacatcaccg gcaagccgtt cgtcgcgccg    120

accgcggcca acgactacgt caagcgcgag gtgatgatcc cgatgcgcga cggggtcaag    180

ctgcacacgg tgatcgtgct gcccaagggc gcgcacggcg cgccgatcct gttgacccgc    240

acgccctacg acgccagcgg ccgcgccagc cgcctggcct cgccgcacat gcgcgatctg    300

ctgccgcagg gcgacgaggt gttcgtcgac ggcggctaca tccgggtgtt ccaggacatc    360

cgcggcaagt acggctcgga gggcgactat gtggtgaccc ggccgctgcg cgggccgctc    420

aacccgacca aggtcgacca cgccaccgac gcctgggaca ccatcgactg gctggtcaag    480

cacgtgcccg aatccaacgg caaggtcggc atgatcggtt cgtcctacga gggcttcacc    540

gtggtgatgg cgctggccga tccgcacccg gcgctgaagg tggccgcgcc ggaaagcccg    600

atgatcgacg gctggatggg cgacgactgg ctcaactacg gcgccttccg ccaggtcaac    660

ctggactact tcaccgggca gatgacccgg cgcggcaagg gcgagggcat cccgcgccag    720

ggctacgacg actacagcaa tttcctgcgc gccggctcgg ccggcgacta cgccaaggcc    780

gccgggctgg agcagttgcc gtggtggcac aagctcaccg agcacccggc ctacgatgcg    840

ttctggcagg agcaggcgct ggacaaggtg atggcgcgca ccccgctgaa ggtgccgacg    900

atgtggctgc aggggctgtg ggaccaggaa gacatgtggg gcgcgatcca cagctacgag    960

gcgatggagc cgcgcgacac cggcaacgac aagaactacc tggtgatggg gccgtggcgg   1020

catagccagg tcaactacga gggcgcctcg ctgggcgcgc tgcagttcga cggcgacacc   1080

gcgctgcagt tccgccgcga cgtgctcaag ccgttcttcg accagtacct ggtcgatggc   1140

gcgcccaagg ccgacacccc gccggtgctg atctacgaca ccggcgccaa ccactgggac   1200

cgcctgcagc gctggccgct gagctgcgcg cagggctgcc cggcgcagag caagccgctg   1260。

tacctggagg ccggcggccg cgtctcgttc gaggcgccca aggccgggca gggcgagtac   1320

accgagtacg tgtccgaccc ggccaagccg gtgccgttcg tgccgcgccc ggtggtgttc   1380

ggcgaccgcg acatgtggac cacctggctg gtgcacgacc agcgcttcgt cgacgggcgc   1440

ccggacgtgc tgaccttcgt cagcgagccg ctgcaggcgc cgctgcgcat cgccggcgcg   1500

ccgcaggtgc acctgcaggc ctccaccagc ggcagcgaca gcgattgggt ggtgaagctg   1560

atcgacgtgt acccggacca gatggcctcc gcgccgaagc tgggcggcta cgagctgccg   1620

gtgtcgctgg cgatcttccg cggccgctac cgcgagagct tcgagcatcc ggcgccgctg   1680

accccgaacc agccgctggc ctacagcttc ggcctgccca ccgccaacca caccttcgag   1740

cgcggccacc gggtgatggt gcaggtgcag tccagcctgt tcccgctgta cgaccgcaat   1800

ccgcagacct acgtgcccaa catctacttc gccaagccgg gcgattacca gaaggcgacg   1860

cagcggatct ggcacacgcc gcagcaggcc agtttcatca gtctgccggt acattga      1917

<210> 2

<211>638

<212> PRT 

<213>红纹黄单胞菌（Xanthomonas rubrilineans）

<400>  2

Met Arg Arg Ile Ala Pro Cys Leu Pro Ala Ala Ala Val Ala Leu Ala 

1               5                    10                   15      

Thr Thr Gly Ala Ala Phe Ala Gln Thr Ala Pro Met Thr Pro Asp Ile 

             20                  25                   30          

Thr Gly Lys Pro Phe Val Ala Pro Thr Ala Ala Asn Asp Tyr Val Lys 

         35                  40                   45              

Arg Glu Val Met Ile Pro Met Arg Asp Gly Val Lys Leu His Thr Val 

      50                   55                   60                  

Ile Val Leu Pro Lys Gly Ala His Gly Ala Pro Ile Leu Leu Thr Arg 

65                  70                   75                  80  

Thr Pro Tyr Asp Ala Ser Gly Arg Ala Ser Arg Leu Ala Ser Pro His 

                 85                  90                   95      

Met Arg Asp Leu Leu Pro Gln Gly Asp Glu Val Phe Val Asp Gly Gly 

             100                  105                  110         

Tyr Ile Arg Val Phe Gln Asp Ile Arg Gly Lys Tyr Gly Ser Glu Gly 

        115                 120                 125             

Asp Tyr Val Val Thr Arg Pro Leu Arg Gly Pro Leu Asn Pro Thr Lys 

    130                 135                  140                 

Val Asp His Ala Thr Asp Ala Trp Asp Thr Ile Asp Trp Leu Val Lys 

145                 150                  155                 160 

His Val Pro Glu Ser Asn Gly Lys Val Gly Met Ile Gly Ser Ser Tyr 

                165                  170                 175     

Glu Gly Phe Thr Val Val Met Ala Leu Ala Asp Pro His Pro Ala Leu 

            180                  185                  190         

Lys Val Ala Ala Pro Glu Ser Pro Met Ile Asp Gly Trp Met Gly Asp 

        195                 200                  205             

Asp Trp Leu Asn Tyr Gly Ala Phe Arg Gln Val Asn Leu Asp Tyr Phe 

     210                 215                  220                 

Thr Gly Gln Met Thr Arg Arg Gly Lys Gly Glu Gly Ile Pro Arg Gln 

225                  230                  235                 240 

Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Ala Gly Ser Ala Gly Asp 

                 245                  250                 255     

Tyr Ala Lys Ala Ala Gly Leu Glu Gln Leu Pro Trp Trp His Lys Leu 

            260                  265                  270         

Thr Glu His Pro Ala Tyr Asp Ala Phe Trp Gln Glu Gln Ala Leu Asp 

        275                  280                  285             

Lys Val Met Ala Arg Thr Pro Leu Lys Val Pro Thr Met Trp Leu Gln 

    290                  295                 300                 

Gly Leu Trp Asp Gln Glu Asp Met Trp Gly Ala Ile His Ser Tyr Glu 

305                  310                  315                 320 

Ala Met Glu Pro Arg Asp Thr Gly Asn Asp Lys Asn Tyr Leu Val Met 

              325                  330                   335     

Gly Pro Trp Arg His Ser Gln Val Asn Tyr Glu Gly Ala Ser Leu Gly 

            340                  345                  350         

Ala Leu Gln Phe Asp Gly Asp Thr Ala Leu Gln Phe Arg Arg Asp Val 

         355                  360                  365             

Leu Lys Pro Phe Phe Asp Gln Tyr Leu Val Asp Gly Ala Pro Lys Ala 

      370                   375                  380                 

Asp Thr Pro Pro Val Leu Ile Tyr Asp Thr Gly Ala Asn His Trp Asp 

385                 390                  395                  400 

Arg Leu Gln Arg Trp Pro Leu Ser Cys Ala Gln Gly Cys Pro Ala Gln 

                 405                  410                  415     

Ser Lys Pro Leu Tyr Leu Glu Ala Gly Gly Arg Val Ser Phe Glu Ala 

             420                  425                 430         

Pro Lys Ala Gly Gln Gly Glu Tyr Thr Glu Tyr Val Ser Asp Pro Ala 

           435                  440                 445             

Lys Pro Val Pro Phe Val Pro Arg Pro Val Val Phe Gly Asp Arg Asp 

         450                 455                 460                 

Met Trp Thr Thr Trp Leu Val His Asp Gln Arg Phe Val Asp Gly Arg 

465                  470                  475                 480 

Pro Asp Val Leu Thr Phe Val Ser Glu Pro Leu Gln Ala Pro Leu Arg 

                 485                 490                  495     

Ile Ala Gly Ala Pro Gln Val His Leu Gln Ala Ser Thr Ser Gly Ser 

           500                  505                 510         

Asp Ser Asp Trp Val Val Lys Leu Ile Asp Val Tyr Pro Asp Gln Met 

         515                  520                 525             

Ala Ser Ala Pro Lys Leu Gly Gly Tyr Glu Leu Pro Val Ser Leu Ala 

       530                  535                  540                 

Ile Phe Arg Gly Arg Tyr Arg Glu Ser Phe Glu His Pro Ala Pro Leu 

545                 550                  555                 560 

Thr Pro Asn Gln Pro Leu Ala Tyr Ser Phe Gly Leu Pro Thr Ala Asn 

            565                 570                  575     

His Thr Phe Glu Arg Gly His Arg Val Met Val Gln Val Gln Ser Ser 

             580                 585                  590         

Leu Phe Pro Leu Tyr Asp Arg Asn Pro Gln Thr Tyr Val Pro Asn Ile 

        595                  600                  605             

Tyr Phe Ala Lys Pro Gly Asp Tyr Gln Lys Ala Thr Gln Arg Ile Trp 

    610                  615                  620                 

His Thr Pro Gln Gln Ala Ser Phe Ile Ser Leu Pro Val His 

625                 630                 635             

<210> 3 

<211> 33 

<212> DNA 

<213> 人工序列 

<223> PCR引物Forward

<400> 3

CGGAATTCATGCGCCGYYTTGCCRCCTGCCTGC

<210> 4 

<211> 35 

<212> DNA

<213> 人工序列 

<223> PCR引物Reverse

<400> 4

CCGCTCGAGTCAAYCBACCGGCAGACTGATGTAGC

<210> 5 

<211>18 

<212> DNA

<213> 人工序列 

<223> 测序引物M13F

<400> 5

TGT AAA ACG ACG GCC AGT。

<210> 6 

<211>18 

<212> DNA

<213> 人工序列 

<223> 测序引物SP6

<400> 6

ATT TAG GTG ACA CTA TAG。