技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种位点特异性整合的表达载体，特别涉及一种HBD3乳腺特异性表达载体及构建的重组细胞。
背景技术
乳房炎是奶牛中很常见的疾病，这种炎症是由多种病原微生物引起的，以大肠杆菌(E.coli)和葡萄球菌(S.aureus)为主(Bannerman DD，Paape MJ，Lee JW，Zhao X，Hope JC，Rainard P.Escherichia coli and Staphylococcus aureus elicit differential innate immune responses followingintramammary infection.ClinDiagn Lab Immunol.2004May；11(3)：463-72.)。乳房炎对奶业造成了巨大的经济损失，目前，治疗乳房炎仍以抗生素的投放为主，但抗生素价格昂贵；而且长期使用抗生素会使细菌产生抗药性，所以寻求一种新的治疗乳房炎的方法迫在眉睫。
自身能够特异性的在乳房携带或者分泌乳房炎的因子，是解决奶牛乳房炎的理想方法，而这需要依赖于现代生物技术来构建转基因奶牛来实现。而应用体细胞克隆技术生产转基因动物已表现出强大的生命力(Jang G，Bhuiyan MM，Jeon HY，Ko KH，Park HJ，Kim MK，Kim JJ，Kang SK，Lee BC，Hwang WS.An approach for producing transgenic cloned cows by nuclear transferof cells transfectedwithhumanalphal-antitrypsingene.Theriogenology.2006Jun；65(9)：1800-12.Epub 2005Nov 21.)，其突出的优点是将转基因步骤提前到体细胞培养阶段，直接利用已确定的整合有目的基因的体细胞作为和供体细胞进行体细胞核移植(SCNT)，这样体细胞核移植前供体细胞的选择不但可以提高转基因动物的出生率还可以减低其生产成本(Wheeler MB，Walters EM.Transgenic technology and applications in swine.Theriogenology.2001Nov1；56(8)：1345-69.)。
人β-防御素3(HBD3)是人体产生的一种大小为4-5kD的抗菌肽，由45个氨基酸组成，它具有光谱、强效的抗多种微生物感染的作用，特别是对金黄色葡萄球菌等阳性菌有强烈杀伤作用(Chen H，Xu Z，Peng L，Fang X，Yin X，Xu N，Cen P.Recent advances in the research and development of human defensins.Peptides.2006Apr；27(4)：931-40.Epub 2005Oct 13.)。目前已有从人扁桃体组织、人新鲜包皮组织、新鲜的人肝癌组织等组织中克隆到了HBD3的cDNA，并构建了各种HBD3表达载体，在大肠杆菌、人的某些细胞中得到表达。
然而，现有的转基因动物生产技术仍然存在一定弊端：外源基因的随机插入带来的位置效应，即外源基因随机插入到与细胞重要生命活动相关的基因内部引起其异常表达，或者外源基因插入异染色质区造成外源基因表达沉默；体细胞核移植技术作为转基因动物生产的有效有段，其突出优点是将基因转移提前到体细胞培养阶段，可以有效的提高转基因动物的出生率和控制生产成本[M.B.Wheeler and E.M.Walters.Transgenic technology and applications in swine.Theriogenology2001，56(8)：1345-1369]，一般的，核供体细胞的准备需要经过药物筛选获得，而最终转基因细胞中抗生素筛选标记的残留，对转基因动物安全及环境安全造成了潜在的威胁。
近年来，链霉菌噬菌体φC31整合酶能够催化链霉菌基因组中的attB位点和噬菌体基因组attP位点之间的同源重组引人关注[Kuhstoss S，Rao RN.Analysis of the integration functionof the streptomycete bacteriophageφC31.J Mol Biol，1991，222(4)：897-908.]。φC31整合酶介导的重组具有单向整合、无需外界化学能源和辅助因子、胜任大片段基因有效整合、可在多种高等植物和动物细胞中发挥作用及外源基因可长期高效表达等特点[Calos MP.The φC31 integrase system for gene therapy.Curr Gene Ther，2006，6(6)：633-645.]，已经成为继Cre重组酶和FLP重组酶之后的又一种基因修饰的有力工具，越 来越多的用于转基因研究。而有关假attP位点在基因组分布规律方面的研究表明，假attP位点多位于基因间或基因内含子内，整合很少发生在基因的外显子中[Thyagarajan B，Liu Y，Shin S，Lakshmipathy U，ScheyhingK，Xue H， C，Strehl R，Hyllner J，Rao MS，Chesnut JD.Creation of engineered human embryonicstem cell lines using φC31 integrase.Stem Cells，2008，26(1)：119-126.]。这种偏向于转录活跃区的整合有利于基因的表达，这有可能是整合酶介导的整合与随机整合相比普遍有较长时间高水平表达的原因[Calos MP.The φC31 integrase system for gene therapy.Curr Gene Ther，2006，6(6)：633-645.]。而且，整合位点不偏好于转录起始位点[Chalberg TW，Portlock JL，Olivares EC，Thyagarajan B，Kirby PJ，Hillman RT，Hoelters J，Calos MP.Integrationspecificity of phage φC31 integrase in the human genome.J MolBiol，2006，357(1)：28-48.]，Sivalingam等[Sivalingam J，Krishnan S，Ng WH，Lee SS，Phan TT，KonOL.Biosafety assessment of site-directed transgene integrationin human umbilical cord-lining cells.MolTher，2010，18(7)：1346-1356.]发现，超过70％的整合位点位于转录起始位点50kb以外。因此，从这方面来讲，φC31整合酶介导的整合潜在的安全隐患较随机插入和病毒载体系统要小的多。
此外，选择标记基因在转基因的研究中是一个用于区分转化细胞和非转化细胞的必不可少的重要基因，它的使用大大加速了转基因技术的发展。但选择标记基因也带来了一些不利因素：目前广泛使用的有效标记基因只有少数几种，而在基因工程操作过程中往往需要对同一基因片段进行多次转化，这时不易找到合适的选择标记基因；另外选择标记基因的表达可能会对转化细胞中的其它基因的表达产生负面作用，导致结果分析的复杂化；同时选择标记基因在转基因作物中的存在增加了它们分布环境的不确定性，由此带来转基因动植物的环境安全性问题，这些对转基因动植物的环境释放有很大的制约作用。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种HBD3乳腺特异性表达载体及构建的重组细胞，克服了当前转基因动物生产过程中存在的随机整合的缺陷，提高了转基因动物生产的安全性，为克服奶牛乳房炎的转基因奶牛提供坚实的基础。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种HBD3乳腺特异性表达载体，包含带有信号转导肽的HBD3基因，分别在HBD3基因的上游和下游设有CSN5和CSN3作为调控元件。
所示的带有信号转导肽的HBD3基因的序列如SEQ.IC.NO.1所示；CSN5的序列如SEQ.ID.NO.2所示，CSN3的序列如SEQ.ID.NO.3所示。
所述的CSN3的下游还设有pUC ori和attB序列。
所述的attB序列的下游还设有CMV组成型启动子，CMV组成型启动子下游插入两个同向的LoxP元件，在LoxP元件下游设有第一荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子，在两个LoxP元件之间设有第二荧光指示蛋白开放阅读框及其终止子和抗生素筛选元件。
所述的attB序列如SEQ.ID.NO.4所示，所述的CMV组成型启动子为Pcmv IE启动子。
所述的HBD3乳腺特异性表达载体，所述的第一荧光指示蛋白开放阅读框为绿色荧光蛋白EGFP开放阅读框，第二荧光指示蛋白开放阅读框为红色荧光蛋白DsRed1开放阅读框，其终止子均为Sv40终止子。
所述的HBD3乳腺特异性表达载体为pARNG-HBD3，将HBD3基因插入到pARNG载体的CSN5和CSN3之间。
一种重组牛胎儿成纤维细胞，宿主细胞为牛胎儿成纤维细胞，通过共转染的方式将外源性表达载体pARNG-HBD3在链霉菌噬菌体φC31整合酶的作用下整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组假attP位点，通过药物筛选取得阳性克隆，再经过Cre重组酶的处理，去除载体上两个同向LoxP序列之间的 抗生素筛选标记，得到去除抗生素筛选标记的包含HBD3乳腺特异性表达载体的重组牛胎儿成纤维细胞。
所述的pARNG-HBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的第2号常染色体上，位于KIAA1486基因和IRS-1基因之间的间隔序列。
所述的去除抗生素筛选标记的包含HBD3乳腺特异性表达载体的重组牛胎儿成纤维细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
1、本发明提供的HBD3基因为自身带有信号肽的基因组DNA而非mRNA反转录而来的cDNA，所扩增的HBD3基因为自身带有信号肽的基因组DNA，所携带的信号肽使得HBD3新生肽链在翻译的同时进入内质网，经过加工和修饰，最后经过高尔基体包装继而分泌到细胞外，达到抑菌功能。
为验证HBD3基因的活性，将其插入到pCDNA3.1(+)载体上构建真核表达载体pCDNA-HBD3。用质粒pCDNA-HBD3转染牛成纤维细胞，经G418筛选获得转HBD3基因的阳性细胞。将阳性细胞裂解，进行大肠埃希氏菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、无乳链球菌(CVCC1886)、停乳链球菌(CVCC587)、化脓链球菌(CVCC593)的平板抑菌试验，结果表明本发明获取的HBD3基因表达产生的多肽具有杀菌的活性。
进一步，在HBD3基因的上下游插入CSN5和CSN3进行调控，而CSN5和CSN3分别为牛β-酪蛋白基因的5’和3’调控区，能够保证所转录的基因通过泌乳激素的刺激在牛乳腺组织中特异性地高表达。
2、本发明构建了的带有attB序列(SEQ.ID.NO.4)的HBD3乳腺特异性表达载体pARNG-HBD3，在链霉菌噬菌体φC31整合酶介导下，位点特异性地整合到牛基因组内假attP位点，其分布偏向于转录活跃的区域，避免了质粒随机插入引起的安全隐患。
3、本发明经过G418药物筛选，得到具有G418抗性且稳定表达红色荧 光蛋白的阳性细胞克隆，排除了因为个别细胞对G418不敏感形成的假阳性克隆。此时由于两个同向LoxP之间终止子的作用，绿色荧光蛋白不表达。
4、本发明还利用Cre重组酶处理阳性细胞克隆，去除两个同向LoxP之间的抗生素筛选标记、红色荧光蛋白基因及终止子，使得CMV启动子和eGFP基因拼接，绿色荧光蛋白得以表达，提示Cre重组酶切离成功。经过流式细胞仪分选得到的稳定表达绿色荧光蛋白(可作为转基因生物标签)的无抗生素筛选标记的包含HBD3乳腺特异性表达载体的重组牛胎儿成纤维细胞，可作为供体细胞通过体细胞核移植技术生产转基因动物，排除了筛选标记对转基因动物安全和环境安全的影响。
附图说明
图1为真核表达HBD3的Western blotting检测结果；
图2为真核表达活性HBD3平板抑菌试验结果；
图3为pARNG的质粒图谱；
图4为pARNG-HBD3的质粒图谱；
图5-a～图5-b为对整合了pARNG-HBD3的重组细胞株的拷贝数及插入位点鉴定；
图6-a～6-b为荧光显微镜检测本发明载体系统切除筛选标记及双荧光报告系统功能检测；图6-a～6-b为经过G418筛选得到稳定表达红色荧光蛋白的阳性细胞克隆；图6-c～6-e为用Cre重组酶处理上述阳性细胞后，切除neoR基因和Dsred1基因，重组细胞转换为绿色荧光蛋白作为指示标记；图6-f～6-g为Cre重组酶处理后，用流式细胞仪分选得到只表达绿色荧光蛋白作为指示标记；
图7-a～7-c为用流式细胞仪分选阳性细胞的结果；
图8-a～8-b为转基因囊胚发育情况及绿色荧光蛋白表达情况。
具体实施方式
本发明提供的HBD3乳腺特异性表达载体，首先构建带有attB序列的HBD3乳腺特异性表达载体pARNG-HBD3，其次在链霉菌噬菌体φC31整合酶介导下使外源性表达载体pARNG-HBD3位点特异性地整合到牛胎儿成纤维细胞基因组内，荧光显微镜观察红色荧光蛋白的表达情况，并经过G418筛选获得阳性细胞，进行PCR鉴定，证实目的基因HBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；然后Cre重组酶处理阳性细胞克隆，去除两个同向LoxP之间的抗生素筛选标记、红色荧光蛋白基因及终止子，使得Pcmv IE启动子和EGFP基因拼接，绿色荧光蛋白得以表达，经过流式细胞仪分选得到的无抗生素筛选标记的包含HBD3乳腺特异性表达载体的重组牛胎儿成纤维细胞；最后将无抗生素筛选标记的转HBD3基因的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去卵母细胞，获得转基因克隆胚，将转基因克隆胚移入受体牛子宫，进行转基因克隆牛的生产。下面结合具体的载体的构建和检测对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
1、HBD3基因的克隆及其在真核细胞中的活性鉴定
根据GeneID：55894所公布的HBD-3基因序列，设计引物HBD3F和HBD3R，以人基因组为模板用引物HBD3F和HBD3R进行PCR扩增，引物序列如下：
HBD3F：TAGCTAGCAGCAGCTATGAGGATCCA；
HBD3R：TCCCAAGCTTTTATTTCTTTCTTCGG；
所扩增的HBD3基因为自身带有信号肽的基因组DNA，所携带的信号肽使得HBD3新生肽链在翻译的同时进入内质网，经过加工和修饰，最后经过高尔基体包装继而分泌到细胞外，达到抑菌功能。
回收PCR扩增的HBD3基因，然后用NheI和HindIII分别双酶切PCR产物和pCDNA3.1(+)质粒。回收HBD3基因片段和pCDNA3.1(+)载体片段， 将这两个片段用T4DNAase连接过夜并转化感受态细胞E.coli DH5，构建真核表达载体pCDNA-HBD3。
用质粒pCDNA-HBD3转染牛成纤维细胞，经G418筛选获得转HBD3基因的阳性细胞。将大约106的阳性细胞消化并离心，倒掉上清，按照蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，分别加100-300μL/60mm皿RIPA裂解缓冲液裂解细胞，冰浴5-30min，4℃，2000×g离心15min，收集上清，加入上样缓冲液100℃变性，然后用Tricine-SDS-PAGE电泳和Western blotting对重组HBD3蛋白表达进行检测。检测结果如图1所示，泳道1为阳性对照的HBD3蛋白(Sigma)，泳道2为阳性细胞提取蛋白，泳道3为正常的牛成纤维细胞提取蛋白；泳道2与泳道1相比，均显示了HBD3特异性的条带(～5KD)，泳道3作为阴性对照并没有相应条带，说明扩增所得的HBD3基因能够在真核细胞中正常表达。
取10微升的裂解上清用于涂布新鲜的大肠埃希氏菌(ATCC25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、无乳链球菌(CVCC1886)、停乳链球菌(CVCC587)、化脓链球菌(CVCC593)琼脂糖平板。37℃过夜培养后，平板抑菌结果如图2所示，其中A、B、C、D、E分别为用琼脂扩散法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、化脓链球菌进行体外抑菌活性测定的结果；图中1为正常牛胎儿成纤维细胞裂解液(阴性对照)；2为HBD3标准品(阳性对照)；3为转pCDNA-HBD3载体阳性细胞裂解液。在以上5个平板当中均可以清晰的看到平板上阳性细胞裂解液产生的杀菌环(而阴性对照没有杀菌环)，这表明所扩增的HBD3在真核细胞表达之后能够对多种细菌具有杀菌的活性。
2、带有attB序列的HBD3乳腺特异性表达载体pARNG-HBD3的构建
2.1乳腺特异性表达元件的克隆：
牛β-酪蛋白是奶牛乳汁中的主要的蛋白质，牛β-酪蛋白基因具有很强的 表达活性，在泌乳激素的刺激下，牛β-酪蛋白基因的5’和3’调控区能够使得目的基因在牛乳腺组织中的特异性地高表达。
根据GenBank：EU169458.1所公布的牛β-酪蛋白5’和3’调控序列，设计引物CSN5F/CSN5R和CSN3F/CSN3R，以牛基因组为模板用引物CSN5F/CSN5R扩增牛β-酪蛋白5’调控区，用引物CSN3F/CSN3R扩增牛β-酪蛋白3’调控区。
引物序列如下：
CSN5F：ATCGAGCTCTACTTTTCTGGTCCAATCGAATCCATCTC；
CSN5R：TAAGGCCGGCCAATGGGAAGATGAGGAAATAG；
CSN3F：CCCAAGCTTAATGATTCCAAGTAAGCC；
CSN3R：CCTAGATCTTCCAATTTTAATTTTCCACAGC。
2.2载体pARNG-HBD3的构建
载体pARNG为一种基于假attP位点整合的通用型表达载体(其质粒图谱如图3所示)，其中包括attB序列、neoR抗生素筛选标记和Cre/LoxP元件。
a.将PCR回收产物牛β-酪蛋白3’调控区CSN3和载体pARNG通过HindII/BglII进行双酶切并进行4℃过夜连接，转化，酶切鉴定，阳性重组质粒进行测序。
b.将测序正确的重组质粒pARNG-CSN3和PCR回收产物HBD3进行XhoI和PvuI双酶切并进行4℃过夜连接，转化，酶切鉴定，阳性重组质粒进行测序。
c.将测序正确的重组质粒pARNG-CSN3-HBD3和PCR回收产物CSN5进行XhoI和PvuI双酶切并进行4℃过夜连接，转化，酶切鉴定，阳性重组质粒进行测序，得到最终载体pARNG-HBD3，其质粒图谱如图4所示。
3、pARNG-HBD3表达载体转染牛胎儿成纤维细胞构建核供体细胞系
1)牛胎儿成纤维细胞的培养
从液氮中取一管荷斯坦奶牛的胎儿成纤维细胞于38℃解冻，加1mLDMEM细胞培养液离心，弃上清，加细胞培养液重悬，取3mL细胞培养液接种于60mm细胞培养皿中，置于CO2培养箱中38.5℃条件下培养。
待牛胎儿成纤维细胞达到80％汇合时，吸弃培养液，用无C2+、Mg2+的PBS冲洗细胞，加入胰酶-EDTA消化细胞。在倒置显微镜下观察细胞，待大多数细胞变圆时，用含10％胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，移液器吹打，离心收集，悬浮，接种于6孔板，翻入CO2培养箱而培养。1-3代的牛胎儿成纤维细胞，培养至细胞达到70％-90％汇合用于转染。
2)G418最小致死浓度的测定
在牛胎儿成纤维细胞(宿主细胞)的培养液(含血清的DMEM细胞培养液)中分别加入不同浓度梯度的G418筛选12天，测定正常细胞的G418最小致死浓度。当细胞培养液中G418的浓度≥600μg/ml时，在显微镜下可见细胞全部死亡，所以G418的最小致死浓度为600μg/ml。
3)细胞转染及筛选：
待宿主细胞生长至70％-90％汇合率，使用X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent转染试剂，对宿主细胞进行pARNG-HBD3表达载体和表达phiC31整合酶的载体pCMVInt(Dr.M.P.Calos惠赠，Stanford University)共转染；在链霉菌噬菌体φC31整合酶介导下，能够位点特异性地整合到真核细胞基因组内假attP位点，其分布偏向于基因间或基因内含子内的转录活跃的区域，避免了质粒随机插入引起的基因表达沉默和其他安全隐患；
由于表达载体pARNG-HBD3包含G418抗性基因neoR，整合到基因组上的neoR基因的阳性细胞能够在含有一定浓度G418的培养液中存活下来，而为转染的正常细胞会被该药物杀死。
表达载体pARNG-HBD3转染牛胎儿成纤维细胞24h后在含血清的DMEM细胞培养液中添加终浓度为最小致死浓度(600μg/ml)的G418进行 筛选；以未转染的牛胎儿成纤维细胞为阴性对照，其细胞培养液加有同样浓度的G418。
转染细胞G418筛选12d后，对照组的细胞全部死亡；对表现为G418抗性的转染阳性重组细胞在荧光显微镜下进行观测，观察荧光指示蛋白RFP是否表达。对既具有G418抗性又稳定表达红色荧光蛋白的阳性细胞克隆(图6-a为在荧光显微镜绿色激发光下观察结果，图6-b为明场下的观察结果)，将培养基的G418浓度减半持续筛选直到细胞长满皿底，然后用胰酶-EDTA消化细胞，再添加不加抗生素的DMEM细胞培养液扩大培养。
4、重组细胞拷贝数鉴定(基于实时定量PCR技术的绝对定量法)
1)标准品制备
a.实时荧光定量PCR.采用20μl PCR的反应体系(SYBR Premix Ex TaqTM，TaKaRa)和条件按StepOne plus荧光定量PCR(ABI公司)使用手册设置，95℃10s；95℃5s，60℃30s(40个循环)；95℃15s，60℃30s，95℃15s.反应体系在96孔板(BIOplastics EU 0.2mL Thin-wall 8-tube strip)中混匀并用超净光盖(BIOplastics EU Optical Wide area 8-cap strip)封口.反应结果使用StepOne Software v2.1收集、分析.所有的样品都在同一块板中做3次重复，取均值。
b.标准曲线的建立.按照P.Song(SONG P.CA I C Q，SKOKUTM，et al.Qurntitative real-time PCR as a screening tool for estimating transgenecopy number inWHISKERSTM-derived transgenic maize[J].Plant Cell Rep，2002，20(10)：948-954.)构建标准品的方法，将含外源基因的质粒pARNG-HBD3与牛胎儿成纤维细胞基因组DNA混合，设置含有0.5、1、2、4、8和16个转基因拷贝数的标准品对照，具体如下：假设含有转基因片段的质粒大小为a bp，牛胎儿成纤维细胞基因组DNA用量为b ng，转基因片段完全随机地头尾相连(或头头相连)插入一条染色体上，由于牛基因组DNA单倍体(haploid) 大小为3×109bp，那么b ng的转基因阳性牛胎儿成纤维细胞基因组DNA含有一个转基因拷贝的质量为：
a × b × 0.5 3 × 10 9 ng . ]]>
以引物TRFP扩增外源基因RFP片段，以引物TGAPDH扩增管家基因GAPDH。TRFP引物序列为：5′GCCACAACACCGTGAAGCTGAA 3′(上游)和5′ACACCTTGGAGCCGTACTGGAA 3′(下游)，扩增产物为96bp.TGAPDH引物序列为5′TCAACGGGAAGCTCACTGG 3′(上游)和5′CCCCAGCATCGAAGGTAGA 3′(下游)，扩增产物为225bp。将外源基因片段检测引物扩增Ct(RFP)减去相应的GAPDH基因的扩增Ct(GAPDH)，得到ΔCt，再对样品的拷贝数的对数值作图便得到绝对定量的标准曲线。
2)重组细胞的外源基因拷贝数的检测结果
a.绝对定量标准曲线.为了确定Real-timePCR扩增中Ct值与初始拷贝数N的关系，将转基因质粒与野生型牛胎儿成纤维细胞基因组DNA混和，设置了分别含有0.5、1、2、4、8、16个拷贝的标准品对照，以引物TRFP和TGAPDH扩增外源基因片段，取平均Ct值，再将外源基因片段检测引物扩增平均Ct(RFP)值减去相应的GAPDH基因的扩增平均Ct(GAPDH)值，得到ΔCt值，将ΔCt值对样品拷贝数的对数(log2N)作图得到绝对定量标准曲线(如图5-a所示)，定量方程计算公式为：log2N＝-0.9406ΔCt+3.5217，决定系数R2＝0.9987，表明标准品制备成功。为了评估反应的特异性并鉴定产物，在扩增后进行了融解曲线分析，结果如图5-b所示，大约86.5℃和87.5有且只有一个单峰，表明两个引物扩增的特异性非常好，并且两个引物的阴性对照和空白对照均没有扩增峰。
b.转基因拷贝数的鉴定.取重组的牛胎儿成纤维细胞克隆进行实时定量PCR，扩增外源基因RFP和管家基因GAPDH，并进行3次重复实验，数值 以 (平均值±标准差)表示。Real-time PCR对重组牛胎儿成纤维细胞克隆鉴定结果如表1所示，标准差在0.02到0.17之间，表明结果准确可信，确定重组的牛胎儿成纤维细胞克隆为单拷贝整合。
表1转基因拷贝数的鉴定结果
鉴于插入的拷贝数多则会导致表达的不稳定甚至基因沉默现象，而低的整合拷贝数(1或2个)有利于降低在高风险位点的整合几率，相比高拷贝可以更稳定的存在于转基因生物中，不会发生拷贝数明显的变化，因此挑选单拷贝整合可以保证外源基因持续稳定的表达。
5、半巢式反向PCR鉴定整合位点
鉴于以上分析结果，取单拷贝整合克隆进行整合位点分析。
10μg基因组DNA用同尾酶NheI和SpeI 37℃过夜消化。在乙醇沉淀、苯酚/氯仿抽提后，消化过的基因组DNA用1000单位T4-DNA连接酶(NEB公司)4℃过夜连接。连接产物经过乙醇沉淀、苯酚/氯仿抽提后，溶于20μl TE buffer制成模板。以制得的模板用引物HNIF1：CCCATAGTAACGCCAATA(上游)和HNIR：CGATGTAGGTCACGGTCT(下游)进行第一轮PCR，按以下条件进行：94℃5min，一个循环；94℃，30s、51-61℃45s、72℃5min，三十个循环；72℃，10min，一个循环，得到第一轮PCR产物。1μl第一轮PCR产物作为第二轮PCR的模板，用引物HNIF2：TAGCGGTTTGACTCACG(上游)和HNIR：CGATGTAGGTCACGGTCT(下游)进行扩增，按以下反应：94℃5min，一个循环；94℃，30s、50-60℃45s、72℃5min，三十个循环； 72℃，10min。第二轮PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收连接pMD9-T载体送测序。测序结果在NCBI上进行BLAST分析。
BLAST结果显示，重组细胞中整合事件发生在第2号常染色体上，位于KIAA1486基因和IRS-1基因之间的间隔序列，符合假attP位点特征。
6、Cre重组酶处理：
将上述以单拷贝形式整合到牛基因组假attP位点的重组细胞接种于含有10％胎牛血清的DMEM培养液中，将接种细胞的6孔培养板放入38.5℃、5％CO2培养箱中。待细胞生长至70％-90％汇合率时进行Cre重组酶处理。
通过Cre重组剪切作用，去除两个同向LoxP之间的抗生素筛选标记、红色荧光蛋白基因及终止子，使得CMV启动子和eGFP基因拼接，绿色荧光蛋白得以表达，提示Cre重组酶切离成功，重组细胞转换为绿色荧光蛋白作为指示标记。图6-c～6-e为用Cre重组酶处理上述阳性细胞后，切除neoR基因和Dsred1基因，重组细胞转换为绿色荧光蛋白作为指示标记，将细胞消化、离心、重悬后于荧光显微镜下照相，其中图6-c为绿色激发光下观察结果，图6-d为蓝色激发光下观察结果，图6-e为明场观察结果。
Cre重组酶的处理具体的可采用以下两种方法之一进行：
1)Cre质粒转染筛选法：
a.准备1.5mL无菌离心管，加入200μl Opti-MEM培养基；
b.向离心管中加入pCAG-Cre-IP质粒载体(2μg)；
c.短暂轻柔涡旋(不超过10s)；
d.分别加入8μl X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent；
e.短暂轻柔涡旋；
f.室温(15℃-25℃)孵育15-30min。
g.将转染复合物逐滴加入6孔培养板的细胞中；
h.孵育细胞24h后，得到重组的无抗生素标记的细胞。
i.将重组细胞倒置荧光显微镜下观测，筛选绿色荧光表达的重组细胞；
k.将重组的细胞用于流式细胞分选绿色荧光表达的重组细胞(图6-f)，并最终得到无抗生素筛选标记的阳性细胞。
2)Cre蛋白转导法：
为了避免Cre处理步骤中，表达Cre重组酶的质粒载体随机整合到阳性细胞基因组中，带来不必要的风险，可使用连接有穿膜肽的Cre重组酶加入DMEM细胞培养液中，孵育24h，然后进行绿色荧光蛋白的观察检测和流式细胞分选，最终得到无抗生素筛选标记的阳性细胞(图6-f、图6-g)。图6-f～6-g为Cre重组酶处理后，用流式细胞仪分选得到只表达绿色荧光蛋白作为指示标记的，即去除了neoR基因和DsRed1基因的转HBD3基因的阳性细胞，其中图6-f为在荧光显微镜蓝色激发光下观察结果，图6-g为明场下的观察结果。
流式细胞分选的结果如图7-a～图7c所示，其中图7-a为正常牛胎儿成纤维细胞；图7-b为具有G418抗性且稳定表达红色荧光蛋白的阳性细胞克隆；图7-c为经过Cre处理后得到切除抗生素筛选标记并稳定表达绿色荧光蛋白的细胞。
7、转基因克隆胚的获得
以上述去除了抗生素筛选标记并且整合了目的基因HBD3的牛胎儿成纤维细胞作为核供体细胞，构建转基因克隆胚。
1)卵母细胞的成熟培养
卵巢采自西安市定点屠宰场，保存在25℃生理盐水中4～6h运送回实验室。抽取3～8mm直径的有腔卵泡收集卵母细胞卵丘复合体，实体显微镜下挑选具有完整的3层以上卵丘细胞，胞质均匀的卵母细胞用于成熟培养。成熟培养液为TCM199(Gibaco)加10％胎牛血清，10ng/mL的表皮生长因子，培养条件为38.5℃，5％CO2、95％空气的气体环境，饱和湿度；成熟培养20h后用0.2％透明质酸酶去除卵丘细胞，以第一极体排放作为卵母细胞成 熟的判定标准，挑选成熟卵母细胞用于核移植实验。
2)转基因克隆胚的构建
显微操作液为含10％FBS，5μg/mL细胞松弛素B的PBS。用内径20μm的去核管在显微操作仪上吸出第一极体及部分胞质。以10μg/mLHoechst 33342染色10min，在荧光显微镜下挑出完全去核的卵母细胞。采用电融合法进行体细胞核移植，过程如下：在显微镜下挑选直径为15μm左右的供体细胞注射到透明带下，并使之与卵母细胞质膜紧密接触。注射后的细胞-卵胞质重组体以微电极挤压融合法进行融合。融合前先将重组体放入融合液(含0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1％BSA)中预平衡4～6min。用与显微操作仪连接的微电极的尖部排列重组体，使膜接触面与两电极的连线垂直，用微电极尖轻轻压住重组体，给予2次电脉冲进行电融合(28V，10μs)。融合后的重组体放入含10％FBS的M199中，38.5℃、5％CO2、饱和湿度下培养，0.5～1h后观察融合情况。
3)克隆胚的激活及体外培养
融合的重组胚在含10％FBS的M199中平衡2h后，用含5μmol/LIonomycin的mSOFaa培养液处理5min，然后在含2mmol/L 6-DMAP的mSOFaa培养液内培养5h，洗3次后转移到mSOFaa微滴中培养，培养密度为每个重构胚5μL，在38.5℃、5％CO2、饱和湿度下培养，每48h半量换液1次，第1次换液时检查卵裂率，第7～9d检查囊胚发育情况，及绿色荧光蛋白表达情况。
观察结果如图8-a、图8-b所示，图为8-a转基因囊胚在荧光显微镜蓝色激发光下的观察结果，图8-b为明场观察结果。用本发明得到的去除neoR基因的转HBD3转基因细胞作为核供体细胞进行体细胞核移植，得到的胚胎可以正常发育为可用于胚胎移植的囊胚，并且转基因稳定表达。