一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102643887 B (45)授权公告日 2014.11.26 CN 102643887 B (21)申请号 201210129184.2 (22)申请日 2012.04.28 C12P 21/02(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (73)专利权人 长春生物制品研究所有限责任公 司 地址 130062 吉林省长春市西安大路 3456 号 (72)发明人 时成波 曹玉锋 徐军 (74)专利代理机构 深圳市君胜知识产权代理事 务所 44268 代理人 王永文 CN 101781639 A,2010.07.21, CN 101062941 A,20。

2、07.10.31, CN 101298608 A,2008.11.05, 刘如石等 . 重组戊型肝炎病毒衣壳蛋白工程 菌的高密度培养 .生物工程学报 .2004, 第 20 卷 ( 第 3 期 ),450-455. (54) 发明名称 一种重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发 酵制备方法 (57) 摘要 本发明公开了一种重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 包括以下步骤 ： A， 培 养工程菌株， 并制备基础培养基和补料培养基 ； B， 灭菌处理后， 接入工程菌株 ； C， 监测所工程菌 株的OD600值， 当OD600的值为4080时， 加入诱 导剂进行诱导 ； D， 当。

3、所述 OD600 的值至少提高百 分之五时， 进行收菌 ； E， 离心提纯后， 即得 P179 蛋 白 ； 在整个过程中实时监测基础培养基中葡萄糖 的含量， 当葡萄糖的含量少于预定值时， 增加补料 培养基。本发明通过大肠杆菌 HEV179/BL21(DE3) 以可溶性形式表达重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白， 并可自主包装成粒径为 1820nm 的 VLP 颗 粒。所述 VLP 颗粒具有良好的免疫原性。该发酵 工艺稳定、 简单、 易于产业化。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 高巍 权利要求书 2 页 说明书 6 页 序列表 1 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家。

4、知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书6页 序列表1页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102643887 B CN 102643887 B 1/2 页 2 1. 一种重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 包括以下步骤 ： A， 培养工程菌株， 并制备基础培养基和补料培养基 ； B， 所述基础培养基经过灭菌处理后， 接入所述工程菌株 ； C， 监测所述工程菌株的细菌细胞密度 OD600， 当所述 OD600 的值为 40 80 时， 在基础 培养基中加入诱导剂进行诱导 ； D， 当所述 OD600 的值至少提高百分之五时， 进行收菌 ； E， 离心提纯后， 即。

5、得 P179 蛋白 ； 在所述步骤 BD 过程中， 实时监测基础培养基中葡萄糖的含量， 当葡萄糖的含量少于 预定值时， 增加补料培养基， 使得葡萄糖的含量等于或大于所述预定值 ； 步骤 A 中的所述基础培养基的配方为 ： 葡萄糖 3050g， 酵母粉 90100g， 蛋白胨 200250g， NaCl 80100g， MgSO4 815g，消 泡 剂 25ml， KH2PO4 3545g， Na2HPO412H2O 120150g， 加蒸馏水定容至 20L ； 所述预定值为 0.1% ； 保持葡萄糖含量在 0.1%-0.2% 之间 ； 工程菌菌体达到对数生长期末期开始诱导 ； 步骤 A 中的所。

6、述基础培养基的配方还包括微量元素 3050ml， 所述微量元素的配方为 ： FeSO47H2O 0.10.2g， CaC122H2O 0.0250.05g， ZnSO47H2O 0.02250.05g， MnSO4H2O 0.0010.005g， Na2MoO42H2O 0.0010.005g， Na2B4O712H2O 0.00020.0005g， CuSO45H2O 0.010.04g， CoCl26H2O 0.0010.005g， 加蒸馏水定容至 1L ； 所述补料培养基的配方为 A 配方， 所述 A 配方为 ： 葡萄糖 230250g， MgSO4 35g， 加蒸馏 水定容至 1L ；。

7、 步骤 B 中， 当采用空气为气源时， 接入菌株后， 发酵起始罐压为 0.5bar， 起始 pH 值为 7.0 ； 控制溶氧量不低于 30%， 且不高于 60% ； 步骤 B 中， 当采用纯氧为气源时， 接入菌株后， 发酵起始罐压为 0.5bar， 起始 pH 值为 7.0， 控制溶氧量不低于 40% ； 步骤 C 中， 当采用空气为气源时， 在所述 OD600 的值为 40 50 时， 加入诱导剂 IPTG 进 行诱导 ； 所述 OD600 的值为 55 65 时， 进行收菌 ； 步骤 C 中采用纯氧为气源时， 所述 OD600 的值为 60 75 时， 加入诱导剂 IPTG 进行诱 导 ；。

8、 所述 OD600 的值为 80 100 时， 进行收菌 ； 目的蛋白表达量不低于 15%， 可溶性蛋白占总目的蛋白的 90% 以上， 表达产物自主形成 粒径为 18-20nm 的 VLP 颗粒 ； 步骤 A 所述工程菌株为大肠杆菌 HEV179/BL21(DE3)， 该工程菌株由 pET28a-P179 重组 质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 经克隆筛选获得， 所述重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白是 基于型戊型肝炎病毒中国株的蛋白片段， 该蛋白片段为 HEV ORF2 编码的 453631 位氨基 酸， 具体氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表中序列 1 所示。 2. 如权利要求。

9、 1 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 其特征在 于， 在所述步骤 BD 过程中， 保持温度在 35 38之间。 3. 如权利要求 1 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 其特征在 权 利 要 求 书 CN 102643887 B 2 2/2 页 3 于， 所述诱导剂为 IPTG， IPTG 的浓度为 0.21.0mmol/L， 诱导时间为 47 小时。 权 利 要 求 书 CN 102643887 B 3 1/6 页 4 一种重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域， 尤其涉及一种重组戊型。

10、肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发 酵制备方法。 背景技术 0002 戊型肝炎在亚洲、 非洲及中美洲等发展中国家是一种非常严重的传染病， 是导致 发病及病死的重要因素。在一些发展中国家戊型肝炎可占到急性病毒性肝炎的 50， 孕妇 死亡率高达 20。1986 1988 年在我国新疆的爆发流行， 造成二十万人发病， 孕妇平均死 亡率为 1346。因此， 加强对戊型肝炎的预防控制极为必要。戊型肝炎病毒 （HEV） 是一 种经肠道传播的病原体， 是一种无包膜的单股正链 RNA 病毒， 病毒颗粒呈球形， 直径 27 34nm， 表面粗糙， 不规则， 在胞浆中装配， 呈晶格状排列， 可形成包涵体。HEV 基。

11、因组全长约 7.5kb， 有 3 个开放性读码框 (ORF)， 分别为 ORF1、 ORF2 和 ORF3， 其中 ORF2 基因长约 2kb， 为主要的结构基因编码区， 编码病毒衣壳蛋白 (pORF2)， 产物为分子量约 76kDa 的糖基化蛋 白， 其 c 末端约 200 个氨基酸范围内有多个重要的免疫抗原表位。目前较为普遍的分型标 准将 HEV 分为四个主要基因型， 即基因、 、 、 型， 其代表株分别为缅甸株、 墨西哥株、 美国株及中国株， 各基因型在全球的地理分布有明显的差异。自 2000 年以来， 型 HEV 已 经成为在中国流行的主要基因型。 0003 由于HEV不能在体外培养，。

12、 目前无法制备HEV灭活病毒疫苗和减毒活疫苗， 国内外 研究多为基因重组疫苗， 候选抗原肽多集中于 ORF2 区。有学者利用杆状病毒昆虫细胞表 达系统或汉逊酵母系统等真核系统成功表达了 HEV 重组蛋白， 但真核表达系统存在表达量 低、 工艺复杂、 成本高等问题。厦门大学等多家研发单位采用大肠杆菌原核表达系统， 表达 产物为包涵体， 需要变性、 复性等步骤， 收率低、 工艺复杂。 0004 因此， 现有戊型肝炎疫苗制备工艺有待于完善和发展。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种表达率高， 工艺简单， 制备成本低的重组戊型肝炎疫 苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法。 0006 本发明的。

13、技术方案如下 ： 0007 一种重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 包括以下步骤 ： 0008 A， 培养工程菌株， 并制备基础培养基和补料培养基 ； 0009 B， 所述基础培养基经过灭菌处理后， 接入所述工程菌株 ； 0010 C， 监测所述工程菌株的细菌细胞密度 OD600， 当所述 OD600 的值为 40 80 时， 在 基础培养基中加入诱导剂进行诱导 ； 0011 D， 当所述 OD600 的值至少提高百分之五时， 进行收菌 ； 0012 E， 离心提纯后， 即得 P179 蛋白 ； 0013 在所述步骤 BD 过程中， 实时监测基础培养基中葡萄糖的含量， 当葡萄。

14、糖的含量 说 明 书 CN 102643887 B 4 2/6 页 5 少于预定值时， 增加补料培养基， 使得葡萄糖的含量等于或大于所述预定值。 0014 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 其中， 步骤 A 中的所述 工程菌株为大肠杆菌 HEV179/BL21(DE3)。 0015 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 其中， 步骤 A 中的所述 基础培养基的配方为 ： 葡萄糖 3050g， 酵母粉 90100g， 蛋白胨 200250g， NaCl 80100g， MgSO4 815g， 消泡剂 25ml， KH2PO4 3545g， Na2H。

15、PO412H2O 120150g， 加蒸馏水定容至 20L。 0016 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 其中， 步骤 A 中的 所述基础培养基的配方还包括微量元素 3050 ml， 所述微量元素的配方为 ： FeSO47H2O 0.10.2g， CaC122H2O 0.0250.05g， ZnSO47H2O 0.02250.05g， MnSO4H2O 0.0010.005g， Na2MoO42H2O 0.0010.005g， Na2B4O712H2O 0.00020.0005g， CuS045H2O 0.010.04g， CoCl26H2O 0.0010.005g，。

16、 加蒸馏水定容至 1L。 0017 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 其中， 在所述步骤 BD 过程中， 保持温度在 35 38之间， 溶解氧的浓度不低于 30%， 所述基础培养基的 pH 值为 6.08.0。 0018 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 其中， 所述预定值为 0.1%。 0019 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法， 其中， 步骤A中， 所述补 料培养基的配方为 A 配方或 B 配方 ； 0020 所述 A 配方为 ： 葡萄糖 230250g， MgSO4 35g， 加蒸馏水定容至 1L ； 0021 所述。

17、 B 配方为 ： 葡萄糖 230250g， 酵母粉 4050g， MgSO4 35g， 加蒸馏水定容至 1L。 0022 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 其中， 所述诱导剂为 IPTG， IPTG 的浓度为 0.21.0mmol/L， 诱导时间为 47 小时。 0023 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法， 其中， 步骤C中， 当采用 空气为气源时， 在所述 OD600 的值为 40 50 时， 用诱导剂 IPTG 进行诱导 ； 0024 所述 OD600 的值为 55 65 时， 进行收菌。 0025 所述的重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的。

18、发酵制备方法， 其中， 步骤 C 中采用纯 氧为气源时， 所述 OD600 的值为 60 75 时， 加入诱导剂 IPTG 进行诱导 ； 0026 所述 OD600 的值为 80 100 时， 进行收菌。 0027 本发明提供一种利用高密度发酵技术中试规模生产重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的方法。利用该工艺在较短时间内即可实现高密度发酵， 目的蛋白表达量不低于 15%， 主要以可溶形式表达， 表达产物在发酵过程中自主形成粒径为 1820nm 的 VLP 颗粒， 所述 VLP 颗粒具有良好的免疫原性。该发酵工艺稳定、 简单、 易于产业化。本发明所采用工程 菌株为大肠杆菌 HEV179/BL。

19、21(DE3)， 该工程菌株由 PET28A-P179 重组质粒转化大肠杆菌 BL21(DE3)， 经克隆筛选获得。所述大肠杆菌 HEV179/BL21(DE3) 以可溶性形式表达重组戊 型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白， 并可自主包装成粒径为 1820nm 的 VLP 颗粒。所述重组戊型 肝炎疫苗抗原 P179 蛋白是基于型戊型肝炎病毒 （HEV） 中国株的蛋白片段， 该蛋白片段为 HEV ORF2 编码的 453631 位氨基酸， 具体氨基酸序列见说明书核苷酸和氨基酸序列表。 附图说明 说 明 书 CN 102643887 B 5 3/6 页 6 0028 图 1 为本发明一种重组戊型肝炎疫。

20、苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法中发酵罐内 大肠杆菌的生长曲线图。 0029 图 2 为本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法中 VLP 颗粒 的电镜观察图。 0030 图 3 为本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法中发酵菌的 可溶性分析。 具体实施方式 0031 本发明提供了一种重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 为使本发 明的目的、 技术方案及效果更加清楚、 明确， 以下参照附图并举实例对本发明进一步详细说 明。应当理解， 此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明， 并不用于限定本发明。 0032 本发明公开了一种重组戊型肝。

21、炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法， 包括以下 步骤 ： 0033 步骤 A， 培养工程菌株， 并制备基础培养基和补料培养基。所述工程菌株为大肠杆 菌， 具体为大肠杆菌 HEV179/BL21(DE3)， 所述大肠杆菌 HEV179/BL21(DE3) 能实现高密度发 酵， 菌密度 OD600 可达 50100， 湿菌重达 80150g/L， 发酵周期短， 工艺稳定 ； 且发酵过程中 表达产物自主形成粒径为 1820nm 的 VLP 颗粒， 所述 VLP 颗粒与铝佐剂配制的疫苗具有很 好的免疫原性， 预防肝炎的保护率达 100%。具体可从工作种子库里取出大肠杆菌的菌种 1 支， 按 1%。

22、 比例复苏后， 于 37， 200rpm 过夜培养， 作为种子液用于发酵， 培养出来的种子液 应在 4h 内使用， 否则菌种活力会下降。 0034 所述发酵基础培养基具体的配方为 ： 葡萄糖 3050g， 酵母粉 90100g， 蛋白 胨 200250g， NaCl 80100g， MgSO4 815g， 消 泡 剂 25ml， KH2PO4 3545g， Na2HPO4 12H2O 120150g， 加蒸馏水定容至 20L， 原位灭菌后使用。 0035 酵母粉、 蛋白胨作为菌体生长的氮源， 主要构成菌体细胞物质、 维持菌体正常生理 活动并合成目的产物。氮源浓度过高， 菌体则生长过快、 对数期。

23、维持时间较短、 菌体老化严 重 ； 浓度过低则菌体生长缓慢， 不利于高密度发酵。葡萄糖成本低廉， 容易被微生物利用， 而成为首选优质碳源。葡萄糖一方面提供微生物生长代谢能量及菌体合成的碳骨架， 但过 快的生长速度可导致乙酸生成过量， 对菌体生长及生理代谢构成不利影响 ； 另一方面葡萄 糖代谢产物可降低 cAMP 含量， 通过代谢物阻遏效应发挥对受控于乳糖操纵子的 T7 启动子 的负调控作用， 进而降低目的蛋白表达量。本研究以 OD600 值 目的蛋白表达量 为判 断指标， 在单因素分析的基础上进行正交试验， 确定出所述基础培养基的具体配方， OD600 值 目的蛋白表达量 数值较高， 表明工程。

24、菌收率、 目的蛋白表达量较为可观。试验表明， 酵母粉、 蛋白胨、 葡萄糖、 MgSO4及微量元素含量对菌体生长及目的蛋白的表达量影响尤其 明显。基于以上研究， 发明上述发酵的基础培养基配方。 0036 所述补料培养基的配方包括 A 配方或 B 配方 ； 0037 所述 A 配方为 ： 葡萄糖 230250g， MgSO4 35g， 加蒸馏水定容至 1L ； 0038 所述 B 配方为 ： 葡萄糖 230250g， 酵母粉 4050g， MgSO4 35g， 加蒸馏水定容至 1L。 高压湿热灭菌后使用。 0039 Mg2 是菌体多菌体多种酶的活性中心， Mg2 不但影响基质的氧化， 还影响蛋白质。

25、 说 明 书 CN 102643887 B 6 4/6 页 7 的生物合成， 而且高密度时发酵菌体密度较大， 碳源消耗较快， 因此发酵过程中流加一定浓 度的葡萄糖和 MgSO4。试验中 A、 B 配方完全满足高密度发酵的需要。对菌体生长及表达量 的影响无明显差异， 从节约成本角度考虑选择 A 配方。 0040 更优选的配方在所述基础培养基里还包括微量元素 3050 ml， 所述微量元素的 配 方 为 ： FeSO47H2O 0.10.2g， CaC122H2O 0.0250.05g， ZnSO47H2O 0.02250.05g， MnSO4H2O 0.0010.005g， Na2MoO42H2。

26、O 0.0010.005g， Na2B4O712H2O 0.00020.0005g， CuS045H2O 0.010.04g， CoCl26H2O 0.0010.005g， 加蒸馏水定容至 1L。过滤除菌。 0041 微量元素是微生物生理活性物质的重要组成， 并调节其生理活性， 在低浓度时对 微生物生长和产物的合成有促进作用， 在高浓度是常表现出明显的抑制作用。经过长期微 生物培养经验及试验， 研制出上述微量元素的具体配方。 0042 步骤 B， 所述基础培养基灭菌处理后， 接入所述工程菌株。优先是将所述基础培养 基注入发酵罐， 具体地， 将20L基础培养基注入发酵罐， 然后116， 30mi。

27、n进行原位灭菌， 待 基础培养基冷至室温后， 按 35% 比例接入工程菌株。经摇瓶发酵多次试验得出， 当所述发 酵罐内的温度设为 35 38， 所述基础培养基的 pH 值为 6.08.0， 起始转速为 200rpm， 起 始罐压为 0.5bar 时， 最适合用于培养， 研究发现， 当采用空气或纯氧为气源时， 控制溶解氧 为不低于 30%， 优选是不高于 60%， 发酵收菌量均可达到预期效果。 0043 自接入工程菌株后， 直到收菌完成， 都需要实时监测基础培养基中葡萄糖的含量， 当葡萄糖的含量少于预定值时， 增加补料培养基， 使得葡萄糖的含量等于或大于所述预定 值 ； 所述预定值为 0.1%。。

28、优选保持葡萄糖的含量保持在 0.1% 0.2% 之间， 通过基础培养 基葡萄糖含量、 pH 值、 溶解氧及菌浓变化确定补料时机和补料速率。 0044 步骤C， 监测所述工程菌株中大肠杆菌的菌浓度 （OD600值） ， 如图1所示， 为本发明 重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法中发酵罐内大肠杆菌的生长曲线图， 采 用空气为气源时随培养时间延长， 菌浓度的增加， 而当 OD600 达到 4050 时， 菌体达对数生 长末期， 比生长速率明显变低， 此时开始诱导。采用纯氧为气源时， OD600 达到 6075 时， 最 高 OD600 可达到 80， 菌体达对数生长末期， 此时开始诱。

29、导。即当所述菌浓度在 OD600 的值 为 4080 时， 用诱导剂 IPTG 进行诱导 ； 所述诱导剂 IPTG 的浓度为 0.21.0mmol/L， 诱导时 间为 47 小时。选择菌体生长的对数末期进行诱导， 既保证了工程菌良好的生长状态和表 达活力， 又保证了较高的菌体密度。 诱导时菌体密度过低不利于高密度发酵， 菌体密度过高 过则表达活性下降。 0045 步骤 D， 诱导后， 菌浓度在 OD600 的值会有所提高， 优选地， 当所述菌浓度在 OD600 的值至少提高百分之五时， 进行收菌。 0046 具体地， 采用空气为气源时， 当所述菌浓度在 OD600 的值为 40 50 时， 用。

30、诱导 剂 IPTG 进行诱导 ； 当所述菌浓度在 OD600 的值为 55 65 时， 进行收菌， 此时， 湿菌重达 80100g/L。 0047 又或者是， 采用纯氧为气源时， 当所述菌浓度在 OD600 的值为 60 75 时， 用诱导 剂 IPTG 进行诱导 ； 当所述菌浓度在 OD600 的值为 80 100 时， 进行收菌， 此时湿菌重达 150180g/L。 0048 由于高密度发酵时， 菌体浓度较大、 菌液粘稠， 优选通过提高转速、 加大通气量、 培 养后期通入纯氧等方式维持溶氧在 3060% 之间。实验证实， 溶氧过低菌体生长状态不好， 说 明 书 CN 102643887 B。

31、 7 5/6 页 8 目的蛋白表达量下降 ； 氧浓度过高可发生氧中毒， 并导致大肠杆菌自溶。 0049 步骤 E， 离心提纯后， 即得 P179 蛋白。具体地， 发酵后的菌体经离心、 破碎、 粗提及 精纯后， 即可获得纯度不低于 95% 的 P179 蛋白。采用本发明的制备方法， 重复发酵 5 批， 收 菌量稳定， 表达量均不低于 15%。所述 P179 蛋白能在大肠杆菌中自动包装成 1820nm 的病 毒样颗粒 （VLP） 。 病毒样颗粒(VLP)是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的病毒样颗粒， 形 态结构上类似完整病毒， 具有与完整病毒相似的免疫原性， 并通过激活抗原提呈细胞， 诱导 免疫应。

32、答。VLP 不含有病毒核酸， 不能自主复制， 因此无致病性， 安全性良好， 在疫苗研发中 具有广泛的应用前景。 0050 以下是本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法最优选的具 体实施例 ： 0051 1-1， 培养工程菌株 ： 取工作种子库大肠杆菌的菌种 1 支， 按 1% 比例复苏后于 37， 200rpm 过夜培养， 作为种子液用于发酵， 制备好的种子液应在 4h 内使用。 0052 2-1， 配制基础培养基 ： 0053 葡萄糖 45g， 酵母粉 95g， 蛋白胨 200g， NaCl 80g， MgSO4 10g， 微量元素 50 ml， 消泡 剂 5ml， K。

33、H2PO4 35g, Na2HPO412H2O 120g， 加蒸馏水定容至 20L， 高压原位灭菌后使用。 0054 2-2， 配制补料培养基 ： A 配方 ： 葡萄糖 250g， MgSO4 5g， 加水定容至 1L， 高压原位灭 菌后使用。 0055 2-3， 配制微量元素 ： FeSO47H2O 0.2g， CaC122H2O 0.03g， ZnSO47H2O 0.05g， MnSO4H2O 0.002g， Na2MoO42H2O， 0.002g， Na2B4O712H2O 0.0005g， CuS045H2O 0.03g， CoCl26H2O 0.005g， 加蒸馏水定容至 1L， 过。

34、滤除菌。 0056 3-1， 以空气为气源时的罐发酵 ： 0057 将基础培养基 20L 注入发酵罐， 116， 30min 进行原位灭菌， 待基础培养基冷至室 温后， 按 35% 比例接入种子液。起始转速为 200rpm， 起始 pH 为 7.0， 起始罐压为 0.5 bar。 发酵过程中通过调节转速、 通气量及补料速率控制溶解氧不低于 30%， 且不高于 60% ； 实时 监控基础培养基葡萄糖含量， 当葡萄糖含量低于 0.1% 时， 按 100ml/h 的起始速率流加 25% 葡萄糖与0.5% MgSO4， 维持葡萄糖浓度在0.1%0.2%之间 ； 发酵过程根据溶解氧及菌浓变化 调整补料速。

35、率。菌浓在 OD600 约为 40 时， 加入 0.5mmol/L 的 IPTG 进行诱导， 诱导时间为 4h， 收菌浓度 OD600 达 55。经 SDS-PAGE 分析显示， 目的蛋白表达量不低于 15%， 可溶性蛋白 占总目的蛋白的 90% 以上， 表达产物自主形成粒径为 1820nm 的 VLP 颗粒。 0058 3-2， 以纯氧为气源时的罐发酵 ： 0059 将基础培养基 20L 注入发酵罐， 116， 30min 进行原位灭菌， 待基础培养基冷至 室温后， 按 35% 比例接入种子液。起始转速为 200rpm， 起始 pH 为 7.0， 起始罐压为 0.5 bar。发酵过程中通过调。

36、节转速、 通气量及补料速率控制溶解氧不低于 40% ； 实时监控基础 培养基葡萄糖含量， 当葡萄糖含量低于 0.1% 时， 按 100ml/h 的起始速率流加 25% 葡萄糖与 0.5% MgSO4； 发酵过程根据溶解氧及菌浓变化调整补料速率。菌浓在 OD600 约为 70 时， 加 入 0.5mmol/L 的 IPTG 进行诱导， 诱导阶段调整罐压至 0.7 bar， 增大通氧量及转速， 控制溶 氧不低于 50%， 诱导时间为 5h， 收菌浓度 OD600 达 96。经 SDS-PAGE 分析显示， 目的蛋白表达 量不低于 15%， 可溶性蛋白占总目的蛋白的 90% 以上， 表达产物自主形成。

37、粒径为 1820nm 的 VLP 颗粒。 说 明 书 CN 102643887 B 8 6/6 页 9 0060 如图 2 所示， 为本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白的发酵制备方法中 VLP 颗粒的电镜观察图 ； 可见生成的 VLP 颗粒的直径为 1820 nm， 与铝佐剂配制的疫苗有很 好的免疫原性。 实验结果显示， 所述P179蛋白与AL(OH)3佐剂配制的戊型肝炎疫苗 （20g/ 剂 /0.5ml） ， 免疫 4-5 周龄未孕雌性 NIH 小鼠 10 只， 皮下注射 0.5g/ 只， 4 周后采血， 用酶 联免疫法测定抗 -HEV IgG， 发现小鼠抗体阳转率为 100%，。

38、 表明 P179 蛋白免疫原性良好。 0061 本发明利用高密度发酵技术生产重组戊型肝炎疫苗抗原 P179 蛋白。其优点在于 ： （1） 在短时间内 （不超过 24h） ， 即可实现高密度发酵， 菌密度 (OD600) 达 5565， 湿菌重达 80100g/L ； 在优选的发酵条件下， 菌密度 (OD600) 达 80100， 湿菌重达 150180g/L ；（2） 发 酵过程中表达产物自主形成粒径为 1820nm 的 VLP 颗粒。 （3） 目的蛋白表达量不低于 15%， 如图3所示， 为本发明一种重组戊型肝炎疫苗抗原P179蛋白的发酵制备方法中发酵菌的可 溶性分析， 其可溶性蛋白占总目的。

39、蛋白的 90% 以上， 不需要变性和复性处理， 简化了纯化工 艺， 降低了生产成本， 易于产业化。 0062 应当理解的是， 对本领域普通技术人员来说， 可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。 说 明 书 CN 102643887 B 9 1/1 页 10 长春生物制品研究所有限责任公司 一种重组戊型肝炎疫苗 P179 蛋白的制备方法 20080502 1 PatentIn version 3.5 1 179 PRT 型戊型肝炎病毒 （Hepatitis E virus） 1 Val Ile Gln Asp Tyr Asp Asn Gln 。

40、His Glu Gln Asp Arg Pro Thr Pro 1 5 10 15 Ser Pro Ala Pro Ser Arg Pro Phe Ser Val Leu Arg Ala Asn Asp Val 20 25 30 Leu Trp Leu Ser Leu Thr Ala Ala Glu Tyr Asp Gln Thr Thr Tyr Gly 35 40 45 Ser Ser Thr Asn Pro Met Tyr Val Ser Asp Thr Val Thr Phe Val Asn 50 55 60 Val Ala Thr Gly Ala Gln Gly Val Ser Arg。

41、 Ser Leu Asp Trp Ser Lys 65 70 75 80 Val Thr Leu Asp Gly Arg Pro Leu Thr Thr Ile Gln Gln Tyr Ser Lys 85 90 95 Thr Phe Tyr Val Leu Pro Leu Arg Gly Lys Leu Ser Phe Trp Glu Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Lys Ala Gly Tyr Pro Tyr Asn Tyr Asn Thr Thr Ala Ser 115 120 125 Asp Gln Ile Leu Ile Glu Asn Ala Ala Gl。

42、y His Arg Val Cys Ile Ser 130 135 140 Thr Tyr Thr Thr Asn Leu Gly Ser Gly Pro Val Ser Ile Ser Ala Val 145 150 155 160 Gly Val Leu Ala Pro His Ser Ala Leu Ala Val Leu Glu Asp Thr Val 165 170 175 Asp Tyr Pro 序 列 表 CN 102643887 B 10 1/2 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102643887 B 11 2/2 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 102643887 B 12 。