《辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性植株的特异引物对及其应用.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性植株的特异引物对及其应用.pdf（14页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)申请公布号 CN 102643805 A (43)申请公布日 2012.08.22 CN 102643805 A *CN102643805A* (21)申请号 201210129969.X (22)申请日 2012.04.27 C12N 15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (71)申请人 北京市农林科学院 地址 100097 北京市海淀区曙光花园中路 9 号 申请人 中国科学院遗传与发育生物学研究 所 江苏省农业科学院 (72)发明人 李常保 李传友 赵统敏 耿丽华 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (54)。
2、 发明名称 辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性植株的特异 引物对及其应用 (57) 摘要 本发明公开了一种辅助鉴定番茄黄化曲叶病 毒抗性植株的特异引物对及其应用。本发明提供 的特异引物对由序列表的序列 1 所示 DNA 片段和 序列表的序列 2 所示 DNA 片段组成。本发明提供 的特异引物对， 具有特异性好、 灵敏度高的优点， 可以从分子水平准确、 快速、 高效地检测植株中是 否为番茄抗黄化曲叶病毒抗病品种， 是否携带番 茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a。本发明的引物对可 以方便地应用到番茄杂交种种子纯度鉴定以及番 茄杂交种品种真实性鉴定 ； 可以方便地应用到抗 病毒育种材料的鉴定筛选以及抗病毒品新。
3、品种的 培育。这项技术将为 TYLCV 的综合防控和北京及 全国的蔬菜安全可持续生产提供强有力的科技支 撑。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 2 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 序列表的序列 1 所示 DNA 片段和序列表的序列 2 所示 DNA 片段组成的特异引物对。 2. 权利要求 1 所述特异引物对在辅助鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性中的应用。 3. 一种辅助鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒抗性的方法， 包括如下步骤 ： 以。
4、待测番茄的 基因组 DNA 为模板， 用权利要求 1 所述特异引物对进行 PCR 扩增， 如果 PCR 扩增产物中具有 454bp 的特异性条带、 待测番茄为候选的番茄黄化曲叶病毒抗病番茄， 如果 PCR 扩增产物中 不具有 454bp 的特异性条带、 待测番茄为候选的番茄黄化曲叶病毒感病番茄。 4. 权利要求 1 所述特异引物对在筛选番茄黄化曲叶病毒抗病番茄中的应用。 5. 一种筛选番茄黄化曲叶病毒抗病番茄的方法， 包括如下步骤 ： 以待测番茄的基因组 DNA 为模板， 用权利要求 1 所述特异引物对进行 PCR 扩增， 如果 PCR 扩增产物中具有 454bp 的特异性条带， 待测番茄为候。
5、选的番茄黄化曲叶病毒抗病番茄。 6. 权利要求 1 所述特异引物对在辅助鉴定番茄是否携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a 中的应用。 7. 一种辅助鉴定番茄是否携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a 的方法， 包括如下步骤 ： 以待测番茄的基因组 DNA 为模板， 用权利要求 1 所述特异引物对进行 PCR 扩增， 如果 PCR 扩 增产物中具有 454bp 的特异性条带、 待测番茄疑似携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a， 如 果 PCR 扩增产物中不具有 454bp 的特异性条带、 待测番茄疑似不携带番茄抗黄化曲叶病毒 基因 Ty3a。 8. 权利要求 1 所述特异引物对在筛选携带番茄抗黄化。
6、曲叶病毒基因 Ty3a 的番茄中的 应用。 9. 一种筛选番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a 的番茄的方法， 包括如下步骤 ： 以待测番茄 的基因组 DNA 为模板， 用权利要求 1 所述特异引物对进行 PCR 扩增， 如果 PCR 扩增产物中具 有 454bp 的特异性条带、 待测番茄为候选的携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a 的番茄。 10. 权利要求 1 所述特异引物对在制备试剂盒中的应用 ； 所述试剂盒的功能为如下 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e)、 (f) 或 (g) ： (a) 辅助鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性 ； (b) 筛选番茄黄化曲叶病毒抗病番茄 ； (c)。
7、 辅助鉴定番茄是否携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a ； (d) 筛选携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a 的番茄 ； (e) 辅助鉴定番茄黄化曲叶病 毒抗病番茄的杂交种种子的纯度 ； (f) 辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗病番茄的杂交种品种 的真实性 ； (g) 番茄黄化曲叶病毒抗病番茄育种。 权 利 要 求 书 CN 102643805 A 2 1/6 页 3 辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性植株的特异引物对及其应 用 技术领域 0001 本发明涉及一种辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性植株的特异引物对及其应用。 背景技术 0002 番茄(Solanum lycopersicum)是一种重要的世界性蔬。
8、菜作物， 在我国设施蔬菜生 产中占有重要位置。以北京为例， 番茄、 黄瓜、 甜辣椒和茄子 4 种果类蔬菜的设施生产面积 25 万余亩， 其中番茄 12.8 万余亩。因此， 番茄的安全生产对于北京 “菜篮子” 工程起到举足 轻重的作用。 0003 病毒病是番茄生产中最常见且发病最普遍的病害之一， 其中番茄黄化曲叶病毒 (Tomato yellow leaf curl virus， TYLCV) 严重地威胁着番茄的安全生产。番茄黄化曲叶 病毒属于双生病毒科 (Geminiviridae) 菜豆金色花叶病毒属 (Begomoviruses)， 是一种双 生 DNA 病毒， 通过 “超级害虫” - 烟。
9、粉虱传播， 具有突发性和难以控制的特点。番茄黄化曲叶 病毒可以侵染茄科、 豆科等多种植物， 主要危害番茄、 辣椒、 茄子、 甘蓝和黄瓜等蔬菜以及烟 草等经济作物， 特别是在番茄上危害更重， 受害植物的症状 ( 发病表征 ) 表现如下 ： 生长缓 慢， 植株明显矮化 ； 顶部叶片皱缩、 叶周边向上卷曲， 叶片变厚变小， 叶片区域性黄化 ； 坐果 少， 果实硬小， 不能正常转色， 丧失商品性 ； 危害严重时不能开花坐果， 造成绝产。 0004 番茄黄化曲叶病毒是近几年新传入我国的有害生物。1964 年最早在以色列发生， 之后迅速扩散到中东、 地中海沿岸、 东亚、 南亚、 非洲、 欧洲、 美国、 中。
10、美洲、 澳大利亚等众多 国家和地区。2002 年传入我国南方省份。2005 年秋在广西番茄主产区百色市田阳镇大面 积爆发， 同年传入江浙一带。2007 年传入河南和山东。2008 年该病在全国多个省市发展蔓 延。2009 年该病在河北局部地区和山东寿光大爆发， 发生面积 10 多万亩， 番茄损失 8 万多 亩。 2009年夏秋季， 在北京郊区县陆续发生， 北京地区主栽的粉色大果番茄品种大多对该病 毒敏感， 该病害遍及通州、 大兴、 顺义、 平谷、 密云、 延庆、 昌平、 房山、 怀柔、 丰台、 朝阳、 海淀 等区县， 发病棚室一般病株率 5-10， 重病棚室病株率 20左右， 个别棚室发病率达。
11、 90 以上， 造成严重减产或绝收， 且病情发展迅速呈蔓延趋势。 0005 从世界各国番茄黄化曲叶病毒危害及防控的经验来看， 利用番茄植物自身的抗性 基因， 培育并推广抗病毒新品种是最经济有效防控番茄黄化曲叶病毒的根本途径。如何针 对性地快速准确地鉴定并利用番茄自身抗性基因培育抗病毒新品种， 以及快速准确便捷地 鉴定番茄抗病毒新品种的真实性和杂交种纯度， 这是番茄安全生产的迫切需求。 0006 在当前的研究中， 从番茄种质资源中已经鉴定到 6 个番茄黄化曲叶病毒抗性相关 基因， 依次命名为番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty1(又称Ty1基因)、 番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty2(又称Ty2基因)、 番茄。
12、抗黄化曲叶病毒基因Ty3(又称Ty3基因)、 番茄抗黄化曲叶病毒 基因 Ty3a( 又称 Ty3a 基因 )、 番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty4( 又称 Ty4 基因 ) 和番茄抗黄 化曲叶病毒基因 Ty5( 又称 Ty5 基因 )， 上述 6 个基因依次定位在番茄第 6 号染色体、 第 11 号染色体、 第 6 号染色体、 第 6 号染色体、 第 3 号染色体和第 4 号染色体上， 其中 Ty1 基因、 说 明 书 CN 102643805 A 3 2/6 页 4 Ty2 基因和 Ty3a 基因已应用于当前的抗病品种的培育中。目前根据材料的抗性表现， Ty3a 基因对于该病毒具有高抗性， 但是。
13、其具体序列未知。 发明内容 0007 本发明的目的是提供一种辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗性植株的特异引物对及 其应用。 0008 本发明提供了序列表的序列 1 所示 DNA 片段和序列表的序列 2 所示 DNA 片段组成 的特异引物对。 0009 所述特异引物对可用于辅助鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性。 0010 本发明还保护一种辅助鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒抗性的方法， 包括如下步 骤 ： 以待测番茄的基因组 DNA 为模板， 用所述特异引物对进行 PCR 扩增， 如果 PCR 扩增产物 中具有454bp的特异性条带、 待测番茄为候选的番茄黄化曲叶病毒抗病番茄， 如果PCR扩增 产物中不具有。
14、 454bp 的特异性条带、 待测番茄为候选的番茄黄化曲叶病毒感病番茄。 0011 所述待测番茄为番茄材料 M82 或其子代、 番茄材料 Gc171 或其子代、 苏粉 13 号或 其子代或罗曼娜 2 号或其子代。所述待测番茄具体可为番茄材料 M82、 番茄材料 Gc171、 或 番茄材料 M82 和番茄材料 Gc171 的子代。 0012 所述特异引物对可用于筛选番茄黄化曲叶病毒抗病番茄。 0013 本发明还保护一种筛选番茄黄化曲叶病毒抗病番茄的方法， 包括如下步骤 ： 以待 测番茄的基因组 DNA 为模板， 用所述特异引物对进行 PCR 扩增， 如果 PCR 扩增产物中具有 454bp 的特。
15、异性条带， 待测番茄为候选的番茄黄化曲叶病毒抗病番茄。 0014 所述待测番茄为番茄材料 M82 或其子代、 番茄材料 Gc171 或其子代、 苏粉 13 号或 其子代或罗曼娜 2 号或其子代。所述待测番茄具体可为番茄材料 M82、 番茄材料 Gc171、 或 番茄材料 M82 和番茄材料 Gc171 的子代。 0015 所述特异引物对可用于辅助鉴定番茄是否携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a。 0016 本发明还保护一种辅助鉴定番茄是否携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a 的方 法， 包括如下步骤 ： 以待测番茄的基因组 DNA 为模板， 用所述特异引物对进行 PCR 扩增， 如 果 PCR。
16、 扩增产物中具有 454bp 的特异性条带、 待测番茄疑似携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a， 如果PCR扩增产物中不具有454bp的特异性条带、 待测番茄疑似不携带番茄抗黄化曲 叶病毒基因 Ty3a。 0017 所述待测番茄为番茄材料 M82 或其子代、 番茄材料 Gc171 或其子代、 苏粉 13 号或 其子代或罗曼娜 2 号或其子代。所述待测番茄具体可为番茄材料 M82、 番茄材料 Gc171、 或 番茄材料 M82 和番茄材料 Gc171 的子代。 0018 所述特异引物对可用于筛选携带番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a 的番茄。 0019 本发明还保护一种筛选番茄抗黄化曲叶病毒基因 。
17、Ty3a 的番茄的方法， 包括如下 步骤 ： 以待测番茄的基因组 DNA 为模板， 用所述特异引物对进行 PCR 扩增， 如果 PCR 扩增产 物中具有454bp的特异性条带、 待测番茄为候选的携带番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty3a的番 茄。 0020 所述待测番茄为番茄材料 M82 或其子代、 番茄材料 Gc171 或其子代、 苏粉 13 号或 其子代或罗曼娜 2 号或其子代。所述待测番茄具体可为番茄材料 M82、 番茄材料 Gc171、 或 说 明 书 CN 102643805 A 4 3/6 页 5 番茄材料 M82 和番茄材料 Gc171 的子代。 0021 所述特异引物对可用于制备试剂盒。
18、 ； 所述试剂盒的功能为如下 (a)、 (b)、 (c)、 (d)、 (e)、 (f) 或 (g) ： (a) 辅助鉴定番茄对番茄黄化曲叶病毒的抗性 ； (b) 筛选番茄黄化曲 叶病毒抗病番茄 ； (c)辅助鉴定番茄是否携带番茄抗黄化曲叶病毒基因Ty3a ； (d)筛选携带 番茄抗黄化曲叶病毒基因 Ty3a 的番茄 ； (e) 辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗病番茄的杂交种 种子的纯度 ； (f) 辅助鉴定番茄黄化曲叶病毒抗病番茄的杂交种的品种真实性 ； (g) 番茄黄 化曲叶病毒抗病番茄育种。 0022 所述番茄为番茄材料 M82 或其子代、 番茄材料 Gc171 或其子代、 苏粉 13 号或其子。
19、 代或罗曼娜 2 号或其子代。所述待测番茄具体可为番茄材料 M82、 番茄材料 Gc171、 或番茄 材料 M82 和番茄材料 Gc171 的子代。 0023 本发明提供的特异引物对， 具有特异性好、 灵敏度高的优点， 可以从分子水平准 确、 快速、 高效地检测植株是否为番茄抗黄化曲叶病毒抗病品种， 是否携带 Ty3a 基因。本发 明的引物对可以方便地应用到番茄杂交种种子纯度鉴定以及番茄杂交种品种真实性鉴定， 可以方便地应用到抗番茄黄化曲叶病毒育种材料的鉴定筛选以及抗番茄黄化曲叶病毒新 品种的培育。 本发明将为番茄黄化曲叶病毒的综合防控和北京及全国的蔬菜安全可持续生 产提供强有力的科技支撑。 。
20、附图说明 0024 图 1 为实施例 2 中的琼脂糖凝胶电泳图。 0025 图 2 为实施例 3 中苗期的症状表现图。 0026 图 3 为实施例 3 中的琼脂糖凝胶电泳图。 0027 图 4 为实施例 3 中成株的症状表现图。 0028 图 5 为实施例 4 中的琼脂糖凝胶电泳图。 0029 图 6 为实施例 6 中的琼脂糖凝胶电泳图。 0030 图 7 为实施例 7 中的琼脂糖凝胶电泳图。 具体实施方式 0031 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试。
21、剂商店购买得到的。实施例中病毒接种植株的方法参见文献 ： 番茄黄化曲叶病 毒病抗性鉴定技术研究， 分子植物育种， 2011， 9(2) ： 210-217。 0032 番茄材料 M82 获自美国番茄遗传资源中心 (The C.M.Rick Tomato Genetics Resource Center)， 种质编号为 LA3475， 为番茄黄化曲叶病毒感病品种， 不含有包括 Ty3a 基因在内的任何番茄黄化曲叶病毒抗性相关基因。 0033 番茄材料 Gc171 获自美国番茄遗传资源中心 (The C.M.Rick Tomato Genetics Resource Center)， 种质资源编号。
22、为 LA1932， 为番茄黄化曲叶病毒抗病品种， 含有 Ty3a 基 因。 0034 番茄黄化曲叶病毒 ： 公众可从北京市农林科学院、 中国科学院遗传与发育生物学 研究所或江苏省农业科学院获得 ； 参考文献 ： 上海地区番茄黄化曲叶病毒病的鉴定及嫁接 说 明 书 CN 102643805 A 5 4/6 页 6 接种法研究， 基因组学与应用生物学， 2009， 28(1) ： 115-118。 0035 实施例 1、 特异引物对的设计 0036 根据对抗病番茄种质资源和感病番茄种质资源进行大量的攻毒试验、 分子鉴定以 及序列比对， 设计一对用于鉴定抗病番茄和感病番茄的特异引物对如下 ( 引物对。
23、的靶序列 为 Ty3a 基因的片段 ) ： 0037 Ty3a-1F( 序列表的序列 1) ： 5 -CAATAGTTCTAGAATGGGTAAAA-3 ； 0038 Ty3a-1R( 序列表的序列 2) ： 5 -GTGTGATATGAGAGGTAGGATT-3 。 0039 实施例 2、 应用特异引物对鉴定番茄是否携带 Ty3a 基因 0040 将番茄材料 M82 和番茄材料 Gc171 分别进行如下实验 ： 0041 1、 提取叶片的基因组 DNA。 0042 2、 以步骤 1 的基因组 DNA 为模板， 用 Ty3a-1F 和 Ty3a-1R 组成的引物对进行 PCR 扩增， 得到 P。
24、CR 扩增产物。 0043 PCR 扩增条件 ： 94预变性 3min， 94变性 30sec， 56退火 30sec， 72延伸 30sec， 共 30 个循环， 72延伸 10min。 0044 3、 将步骤 2 的 PCR 扩增产物进行 1琼脂糖凝胶电泳， 见图 1。图 1 中， DL2000 为 分子量标准， 空白对照为用水代替基因组 DNA 作为模板的 PCR 扩增产物， Gc171 为以番茄材 料 Gc171 的基因组 DNA 为模板的 PCR 扩增产物， M82 为以番茄材料 M82 的基因组 DNA 为模 板的 PCR 扩增产物。 0045 与番茄材料 M82 相比， 番茄材料。
25、 Gc171 的 PCR 扩增产物显示一条特异性条带。 0046 4、 回收步骤 3 中的特异性条带并测序， 其大小为 454bp， 如序列表的序列 3 所示。 0047 以上结果表明 ： 应用实施例1设计的特异引物对， 根据PCR扩增产物中是否具有约 454bp的特异性条带， 即可判断待测番茄是否携带Ty3a基因， 如果具有约454bp的特异性条 带、 待测番茄携带 Ty3a 基因， 如果不具有约 454bp 的特异性条带、 待测番茄不携带 Ty3a 基 因， 也就是说实施例 1 设计的特异引物对的靶序列为与 Ty3a 基因紧密连锁的标记序列。 0048 实施例 3、 应用特异引物对鉴定抗病。
26、番茄和感病番茄 0049 将番茄材料 M82 和番茄材料 Gc171 分别进行如下实验 ： 0050 一、 接种用番茄黄化曲叶病毒 0051 用番茄黄化曲叶病毒接种 20 株番茄幼苗， 作为实验组 ； 用等体积无菌水代替番茄 黄化曲叶病毒接种 20 株番茄幼苗， 作为对照组。 0052 二、 苗期形态观察和发病率统计 0053 接种 20 天后， 观察苗期表型并拍照， 出现发病表征的植株即为发病植株， 计算发 病率。 0054 实验组中， 番茄材料 M82 的发病率为 100， 番茄材料 Gc171 的发病率为 0。对 照组中， 番茄材料 M82 的发病率为 0， 番茄材料 Gc171 的发病。
27、率为 0。实验组中， 番茄材 料 Gc171 的照片见图 2A。实验组中， 番茄材料 M82 的照片见图 2B。 0055 三、 分子鉴定 0056 接种 20 天后， 每组随机取三株植株进行分子鉴定， 方法同实施例 2。 0057 1琼脂糖凝胶电泳图见图 3。图 3 中， DL2000 为分子量标准， 空白对照为用水代 替基因组 DNA 作为模板的 PCR 扩增产物， 阴性对照为用其它感病番茄的基因组 DNA 为模板 说 明 书 CN 102643805 A 6 5/6 页 7 的 PCR 扩增产物， 阳性对照为用其它抗病番茄的基因组 DNA 为模板的 PCR 扩增产物， 三个 Gc171分。
28、别为以三株番茄材料Gc171的基因组DNA为模板的PCR扩增产物， 三个M82分别为 以番茄材料 M82 的基因组 DNA 为模板的 PCR 扩增产物。 0058 对于番茄材料 M82， 实验组植株的叶片和对照组植株的叶片均未显示约 454bp 的 特异性条带。对于番茄材料 Gc171， 实验组植株的叶片和对照组植株的叶片均显示约 454bp 的特异性条带 ( 测序结果表明， 各个特异性条带大小均为 454bp)。 0059 以上结果表明 ： 应用实施例1设计的特异引物对， 根据PCR扩增产物中是否具有约 454bp 的特异性条带， 即可判断待测番茄为番茄黄化曲叶病毒抗病番茄还是番茄黄化曲叶 。
29、病毒感病番茄， 如果具有约 454bp 的特异性条带、 待测番茄为候选的番茄黄化曲叶病毒抗 病番茄， 如果不具有约 454bp 的特异性条带、 待测番茄为候选的番茄黄化曲叶病毒感病番 茄。 0060 四、 成株形态观察 0061 接种 40 天后， 观察成株表型并拍照， 见图 4。番茄材料 Gc171 的生长状态正常。与 番茄材料 Gc171 相比， 番茄材料 M82 的坐果少， 果实硬小， 不能正常转色。 0062 实施例 4、 应用特异引物对鉴定杂交种种子纯度 0063 由于番茄黄化曲叶病毒对番茄生产造成灾难性的损失， 推广应用抗病毒品种是防 控病害发生、 确保番茄安全生产的根本途径。抗病。
30、毒品种的真实性和种子纯度是种业的生 命线， 如何快速准确鉴定种子的纯度是种业运营和番茄安全生产的基本需求。 0064 苏粉 13 号是江苏省农业科学院培育的番茄黄化曲叶病毒抗病品种 ( 携带番茄抗 黄化曲叶病毒基因Ty3a)。 为了尽早满足种子经销商的需求， 利用Ty3a-1F和Ty3a-1R组成 的引物对对随机抽样的 200 粒苏粉 13 号种子进行分子检测 ( 方法同实施例 2)。 0065 部分样本的电泳结果见图 5。图 5 中， DL2000 为分子量标准， 阳性对照为苏粉 13 号的抗病亲本 ； 阴性对照为苏粉 13 号的感病亲本， 其余泳道为部分待测样本。200 份番茄 样本中， 。
31、196 份的 PCR 扩增产物中具有约 454bp 的特异性条 ( 测序结果表明， 各个特异性条 带大小均为454bp)， 占总样本数的98， 4份的PCR扩增产物中不具有约454bp的特异性条 带。这说明该品种种子纯度为 98， 符合种子质量标准， 可以投放生产。 0066 实施例 5、 应用特异引物对鉴定杂交后代中的抗病番茄和感病番茄 0067 1、 将 1 株番茄材料 M82 和 1 株番茄材料 Gc171 进行杂交， 收获 F1 代种子。 0068 2、 将 F1 代种子培育为植株， 即为 F1 代植株。 0069 3、 将 F1 代植株进行自交， 收获 F2 代种子。 0070 4、。
32、 将 F2 代种子培育为植株， 即为 F2 代植株。 0071 5、 将 168 株 F2 代植株幼苗接种番茄黄化曲叶病毒。 0072 6、 步骤 5 中接种 20 天后， 观察苗期表型并拍照， 出现发病表征的植株即为发病植 株， 168 株植株中有 52 株为发病植株， 其余为抗病植株。 0073 7、 步骤 5 中接种 20 天后， 取植株叶片进行分子鉴定， 方法同实施例 2， 步骤 6 鉴定 为抗病植株的 PCR 扩增产物中具有约 454bp 的特异性条 ( 测序结果表明， 各个特异性条带 大小均为 454bp)， 而步骤 6 鉴定为感病植株的 PCR 扩增产物中均不具有约 454bp 。
33、的特异性 条。 0074 实施例 6、 应用特异引物对鉴定品种真实性 说 明 书 CN 102643805 A 7 6/6 页 8 0075 针对目前种子市场上假冒伪劣种子的现象， 利用实施例 1 设计的特异引物对， 可 以快速方便地检测种子的真实性。 0076 对种植在山东省寿光市蔬菜博览会展示园的番茄品种罗曼娜 2 号和寿光市稻田 镇田家村的罗曼娜 2 号的番茄黄化曲叶病毒发生情况分别进行现场调查， 发现展示园的罗 曼纳 2 号没有出现典型的番茄黄化曲叶病毒症状， 而田家村的罗曼纳 2 号部分植株出现典 型的番茄黄化曲叶病毒症状 ( 发病率 31 )。 0077 分别对这两个地点的罗曼娜 。
34、2 号品种进行了抽样， 利用 Ty3a-1F 和 Ty3a-1R 组成 的引物对进行分子检测 ( 方法同实施例 2)。 0078 部分样本的结果见图 6。图 6 中， DL2000 为分子量标准， 空白对照为水， 阴性对照 为番茄材料 M82， 阳性对照为番茄材料 Gc171。结果表明， 展示园的样本的 PCR 扩增产物中 均具有约454bp的特异性条(测序结果表明， 各个特异性条带大小均为454bp)， 而田家村的 样本的 PCR 扩增产物中均不具有约 454bp 的特异性条。这说明田家村的罗曼娜 2 号与展示 园的罗曼娜 2 号不是同一番茄品种， 田家村的罗曼娜 2 号为假冒伪劣种子。 0。
35、079 实施例 7、 特异性引物对在抗病毒品种培育上的应用 0080 利用实施例 1 设计的特异引物对， 可以快速方便地确定育种者所搜集和转育的育 种材料中是否含有 Ty3a 基因， 是否为番茄黄化曲叶病毒抗病品种， 提高抗病毒品种的选育 的准确性， 加快育种进程， 提升育种水平。 0081 随机采集番茄种质资源 488 份， 利用 Ty3a-1F 和 Ty3a-1R 组成的引物对进行分子 检测 ( 方法同实施例 2)。部分结果见图 7。图 7 中， DL2000 为分子量标准， 阴性对照为番 茄材料 M82， 阳性对照为番茄材料 Gc171。488 份番茄种质资源中的 8 份具有约 454b。
36、p 的特 异性条带 ( 测序结果表明， 各个特异性条带大小均为 454bp)。 0082 将以上 8 份种质资源通接种病毒并观察表型 ( 方法同实施例 3)， 该 8 份种质资源 确实为抗病品种， 这为培育抗病毒品种奠定了物质基础。 说 明 书 CN 102643805 A 8 1/2 页 9 0001 0002 序 列 表 CN 102643805 A 9 2/2 页 10 序 列 表 CN 102643805 A 10 1/4 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102643805 A 11 2/4 页 12 图 3 说 明 书 附 图 CN 102643805 A 12 3/4 页 13 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102643805 A 13 4/4 页 14 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102643805 A 14 。