一种从生物酶发酵液中提取甜菊糖苷的方法.pdf

一种从生物酶发酵液中提取甜菊糖苷的方法，以单糖生物酶发酵液为原料，提取高纯度甜菊糖苷RA，该提取方法包括单糖生物酶发酵液预处理和甜菊糖苷提纯。发酵液预处理包括发酵液加热、一次PH值调节、絮凝沉淀、离心分离、二次PH值调节、降温、膜过滤。甜菊糖苷提纯步骤包括大孔树脂吸附‑解析、阴阳离子交换、活性炭处理、脱溶‑浓缩、脱水干燥、一次晶体、二次晶体、脱水干燥、获得成品。本发明从单糖生物酶发酵液中所提取出的甜菊糖苷RA纯度高、色泽优、口感纯正，无异味。本提取方法节省能源，有利环保，降低高端甜菊糖的制造成本，同时将开辟新的原料供应渠道，实现甜菊糖苷原料质量更加稳定、数量更加充足。

1.一种从生物酶发酵液中提取甜菊糖苷的方法，其特征在于：以单糖生物酶发酵液为原料，提取高纯度甜菊糖苷RA，该提取方法包括单糖生物酶发酵液预处理和甜菊糖苷提纯：1)单糖生物酶发酵液预处理，处理工序包括：(1)首先采用饱和蒸汽将所述发酵液升温至95～100℃，维持15～20min；(2)对升温后的发酵液进行一次pH值调节，达到蛋白分子的等电点；(3)絮凝沉淀，在发酵液中添加8％的“天然有机高分子多糖复合絮凝剂”配置液；(4)离心分离，采用高分离因素的高速离心机对经过上述程序处理的发酵液进行一次除杂分离，获得一次澄清发酵液；(5)进行二次pH值调节，达到蛋白分子的等电点；(6)然后，采用循环冷却水将所述一次澄清发酵液温度降至≤50℃；(7)膜过滤，采用微滤膜将所述一次澄清发酵液进行二次动态过滤，获得二次澄清发酵液，收集过滤后的所述二次澄清发酵液，送至下一工序；2)甜菊糖苷提纯：分为粗提纯和后续的精提纯两步进行：粗提纯包括以下步骤：(1)首先进行大孔树脂吸附、解析，将所述二次澄清发酵液以5～6BV/h的流速流过大孔吸附树脂柱，上柱吸附，该树脂柱为四柱串联为一组，多组交替切换使用，取每组第四柱下排口为吸附终点监控点，实时检测，当排出液甜菊糖苷含量≥100ppm时，吸附饱和，停止上柱，切换下一组继续吸附；再用85％的甲醇对饱和组进行解析，并收集解析液，当解析液糖含量≤50ppm时，停止进醇；(2)阴、阳离子交换处理，采用SQD-913强碱性阴离子交换树脂，001×16苯乙烯强酸性阳离子交换树脂，阴、阳离子树脂各四柱为一组，依次串联，多组交替切换使用，处理时，使所述解析液以3～5BV/h的流速依次流经阴、阳离子树脂柱，进行交换处理；收集精制液，取每组第四柱下排口为交换终点监控点，实时检测，当排出液透光度≤95％且比吸光值≥0.1时，本组停止上柱交换，切换下一组继续交换运行；经多批次运行后，取样检测，获得精制液中甜菊糖苷总甙平均含量值和RA甙平均含量值；(3)精制液活性炭处理，精制液以40～60m/min的流速流经活性炭移动床，收集炭脱液；(4)脱溶、浓缩工序，采用膜分离和浓缩技术，实现炭脱液初步分离和糖液预浓缩，再用高纯度甲醇解析，得浓糖浆；(5)脱水干燥，所述浓糖浆经过无菌板过滤后，送入干燥机脱水干燥、粉碎，得初级产品，经取样检测，获得初级产品中甜菊糖苷总甙平均含量值；后续的精提纯包括以下步骤：(1)将所述甜菊糖苷粗提纯获得的初级产品放入乙醇中进行溶解，溶解温度80℃；降温结晶，将晶浆进行离心分离，获得一次晶体；(2)再用乙醇对所述一次晶体进行二次溶解；降温结晶，进行离心分离后获得二次晶体；(3)所述二次晶体经过干燥机脱水干燥、粉碎，获得产品。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在单糖生物酶发酵液预处理工序(2)中进行的一次pH值调节，采用加入柠檬酸调整发酵液pH值至3.5～5.0，达到蛋白分子的等电点；在预处理工序(5)中进行的二次pH值调节，采用在一次澄清发酵液中添加NaOH，调整pH值至7.0～9.0，达到蛋白分子的等电点。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在单糖生物酶发酵液预处理工序(4)中，采用分离因素≥5000的高速离心机对经处理的发酵液进行一次除杂分离，透光度≥80，分离停留时间1h。 4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在单糖生物酶发酵液预处理工序(7)中微滤膜的微孔径为0.2μm，所述微滤膜设置为多组微滤膜串联，一次澄清发酵液均匀连续的通过膜组件。 5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在甜菊糖苷粗提纯步骤(4)中采用的膜分离和浓缩技术是，使炭脱液首先经过有机膜，将甜菊糖苷和醇水进行初步分离，并将糖液浓度预浓缩至10～20％，然后，再将糖液浓缩至40～50％，采用蒸馏塔将醇水进行分离。 6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：在甜菊糖苷粗提纯步骤(5)中，将所述浓糖浆经过无菌板过滤后，送入干燥机脱水干燥，是送入真空微波干燥机脱水干燥；在精提纯步骤(3)中，所述二次晶体经过干燥机脱水干燥，是二次晶体经过真空微波干燥机脱水干燥。

技术领域

本发明涉及对发酵液的处理技术，更涉及从发酵液中提取甜菊糖苷的处理技术，尤其涉及一种从单糖发酵液中提取高纯度甜菊糖苷RA(Rebaudioside A)的方法。

背景技术

当今人类存在对甜味食品的普遍偏好，然而由于大量摄取蔗糖能引起糖尿病、肥胖症、心脏病等各种成人病而成为社会问题。选择使用合适的甜味剂则无论是在我们的日常生活中还是在食品、饮料、医药工业中都具有非常重要的作用。

甜菊糖是从菊科草本植物甜叶菊中精提的新型天然甜味剂。它不仅具有高甜度、低热能、无毒副作用、无致癌性食用安全等特点，而且还独具预防高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病、龋齿等病症的食疗效果；因此，作为一款新型食品添加剂，甜菊糖已备受广大受众尤其是欧美高端市场青睐。

但是，目前甜菊糖行业都是从甜叶菊叶子提取甜菊糖苷的，相对于其它人工合成甜味剂而言，传统甜菊糖的生产制备存在着高纯度产品提纯难度大、价格居高不下以及原料受制于农业种植供应不稳定等的诸多难题。因此传统甜菊糖的生产制备已不能满足消费者的要求，需要寻求一种新的可解决现有难题且优于传统提取甜菊糖苷的技术手段。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种可实现将甜菊糖苷从单糖生物酶发酵液中快速清晰分离的方法，利用该方法能够获得性价比更加优化的甜菊糖苷RA，满足消费者日益增长的需求。

为了达到上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种从生物酶发酵液中提取甜菊糖苷的方法，以单糖生物酶发酵液为原料，提取高纯度甜菊糖苷RA，该提取方法包括单糖生物酶发酵液预处理和甜菊糖苷提纯：

1)单糖生物酶发酵液预处理，处理工序包括：(1)首先采用饱和蒸汽将所述发酵液升温至95～100℃，维持15～20min；(2)对升温后的发酵液进行一次PH值调节，达到蛋白分子的等电点；(3)絮凝沉淀，在发酵液中添加8％的“天然有机高分子多糖复合絮凝剂”配置液；(4)离心分离，采用高分离因素的高速离心机对经过上述程序处理的发酵液进行一次除杂分离，获得一次澄清发酵液；(5)进行二次PH值调节，达到蛋白分子的等电点；(6)然后，采用循环冷却水将所述一次澄清发酵液温度降至≤50℃；(7)膜过滤，采用微滤膜将所述一次澄清发酵液进行二次动态过滤，获得二次澄清发酵液，收集过滤后的二次澄清发酵液，送至下一工序；

2)甜菊糖苷提纯：分为粗提纯和后续的精提纯两步进行：

粗提纯包括以下步骤：(1)首先进行大孔树脂吸附、解析，将所述二次澄清发酵液以5～6BV/h的流速流过大孔吸附树脂柱，上柱吸附，该树脂柱为四柱串联为一组，多组交替切换使用，取每组第四柱下排口为吸附终点监控点，实时检测，当排出液甜菊糖苷含量≥100ppm时，吸附饱和，停止上柱，切换下一组继续吸附；再用85％的甲醇对饱和组进行解析，并收集解析液，当解析液糖含量≤50ppm时，停止进醇；(2)阴、阳离子交换处理，采用SQD-913强碱性阴离子交换树脂，001×16苯乙烯强酸性阳离子交换树脂，阴、阳离子树脂各四柱为一组，依次串联，多组交替切换使用，处理时，使所述解析液以3～5BV/h的流速依次流经阴、阳离子树脂柱，进行交换处理；收集精制液，取每组第四柱下排口为交换终点监控点，实时检测，当排出液透光度≤95％且比吸光值≥0.1时，本组停止上柱交换。切换下一组继续交换运行；经多批次运行后，取样检测，获得精制液中甜菊糖苷总甙平均含量值和RA甙平均含量值；(3)精制液活性炭处理，精制液以40～60m/min的流速流经活性炭移动床，收集炭脱液；(4)脱溶、浓缩工序，采用膜分离和浓缩技术，实现炭脱液初步分离和糖液预浓缩，再用高纯度甲醇解析，得浓糖浆；(5)脱水干燥，所述浓糖浆经过无菌板过滤后，送入干燥机脱水干燥、粉碎，得初级产品，经取样检测，获得初级产品中甜菊糖苷总甙平均含量值；

后续的精提纯包括以下步骤：(1)将所述甜菊糖苷粗提纯获得的初级产品放入一定浓度的乙醇中进行溶解，溶解温度80℃；降温结晶，将晶浆进行离心分离，获得一次晶体；(2)再用乙醇对所述一次晶体进行二次溶解；降温结晶，进行离心分离后获得二次晶体；(3)所述二次晶体经过干燥机脱水干燥、粉碎，获得产品。

运行至此，从单糖生物酶发酵液提取甜菊糖苷RA的步骤结束，获得了高提纯度产品。其中，在粗提纯步骤(2)中，经取样检测，获得精制液中甜菊糖苷总甙平均含量为91～93％，RA甙平均含量为75～80％。在粗提纯步骤(5)中，经取样检测，初级产品中甜菊糖苷总甙平均含量为90～95％。在精提纯步骤(3)中，经取样检测，产品中甜菊糖苷总甙平均含量为98.5～100％，RA甙平均含量为96.2～99.8％。

较佳的是，在单糖生物酶发酵液预处理工序(2)中进行的一次PH值调节，采用加入适量柠檬酸调整发酵液PH值至3.5～5.0，达到蛋白分子的等电点；在预处理工序(5)中进行的二次PH值调节，采用在一次澄清发酵液中添加适量NaOH，调整PH值至7.0～9.0，达到蛋白分子的等电点。

较佳的是，在单糖生物酶发酵液预处理工序(4)中的高分离因素是，采用分离因素≥5000的高速离心机对经处理的发酵液进行一次除杂分离，透光度≥80，分离停留时间1h。

较佳的是，在单糖生物酶发酵液预处理工序(7)中微滤膜的微孔径为0.2μm，所述微滤膜设置为多组微滤膜串联，一次澄清发酵液均匀连续的通过膜组件。

较佳的是，在甜菊糖苷粗提纯步骤(4)中采用的膜分离和浓缩技术是，使炭脱液首先经过20～100A°有机膜，将甜菊糖苷和醇水进行初步分离，并将糖液浓度预浓缩至10～20％，然后，再将糖液浓缩至40～50％，采用蒸馏塔将醇水进行分离。

较佳的是，在甜菊糖苷粗提纯步骤(5)中，将过滤后的浓糖浆所述送入干燥机脱水干燥，是送入真空微波干燥机脱水干燥；在精提纯步骤(3)中，所述二次晶体经过干燥机脱水干燥，是二次晶体经过真空微波干燥机脱水干燥。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明根据生物酶单糖发酵的机理以及发酵液的内部特性，提出了一种从单糖生物酶发酵液中提取高纯度甜菊糖苷RA的可行技术方案，所提取出的甜菊糖苷纯度高、色泽优、口感纯正，无异味。本发明方法在单糖生物酶发酵液预处理工序中，采取了如下具有特色的技术措施：

1、在单糖生物酶发酵液预处理工序中，首先是加热发酵液，该升温步骤不仅可以杀灭活性生物酶及部分杂菌，防止过度发酵或发酵液腐败，还可以降低发酵液黏度，易于后续工序分离杂质，而且在升温过程中可促使部分水溶性蛋白产生变性沉淀。

2、在上述预处理工序中，对发酵液PH值进行的两次调节，是根据发酵液中酸性蛋白、碱性蛋白及杂蛋白的特性进行的，采取平衡等电点和盐析等理论进行处理，在最大限度的分离蛋白类杂质的同时，为下一步粗提纯工序树脂的稳定运行提供了可靠的保障，确保产品质量的均一性，延长了树脂使用寿命，降低了再生维护成本。

3、选用了合适的“天然有机高分子多糖复合絮凝剂”作为配置液，视为合适是因为：首先该絮凝剂完全符合生物酶发酵液粘度大、组分复杂的特点，该絮凝剂同时具有高分子架桥联接絮凝作用和电解质脱稳凝聚作用，能够几近完美的捕捉各类性质不同的杂质；其次，该絮凝剂几乎不存在传统复盐沉淀过程中Fe3+对产品造成的色变或水解反应，产品损失率和副作用最小；再次，该絮凝剂能够在极短的时间内完成絮凝作用，所允许的物料停留时间短，可以将发酵液中的生物酶、菌丝、色素、鞣质、杂蛋白、部分培养基等杂质进行快速捕捉、聚集、沉降。

4、采用高分离因素的离心过滤除杂技术，过滤分离精度＜2μm，能够长时间连续稳定运行，保证了滤过液的高度澄清。同时由于该技术的采用，彻底解决了传统的植物提取行业在过滤环节脏、乱、差的痼疾。

正是基于预处理工序中的诸多卓有成效的技术手段，致使精制液中甜菊糖苷总甙平均含量达到91～93％，RA甙平均含量为75～80％。而传统提取模式下精制液中甜菊糖苷总甙平均含量只能达到85～87％，RA甙平均含量仅为50～60％。该预处理工序为后续提纯提供了高质量的物料，确保了甜菊糖苷RA产品的高纯度。

本发明在甜菊糖苷粗提纯步骤中采用的膜分离和浓缩技术，实现了物料的常温溶剂初步分离和糖液预浓缩；在粗提纯和精提纯步骤中采用了微波脱水干燥技术，较之传统喷雾干燥，尾气排空量减少70％，节省热能55％，干燥产品风耗损失降低3～5％，从而进一步降低高端甜菊糖的制造成本。

本发明从生物酶发酵液中提取甜菊糖苷的方法，通过单糖生物酶发酵液预处理和甜菊糖苷提纯的多种工序，获得产成品实现了一步法做到产品中甜菊糖苷总甙平均含量为98.5～100％，RA甙平均含量为96.2～99.8％的结果。而传统提取模式下产成品中甜菊糖苷总甙平均含量只能达到97～98.5％，RA甙平均含量为95～97％。同时，本发明将开辟新的原料供应渠道，实现甜菊糖苷原料质量更加稳定、数量更加充足。

以下将结合实施例对本发明作进一步详细说明。该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限制。

具体实施方式

本实施例选用的单糖生物酶发酵液为酵母菌属的种发酵产生的发酵液。本发明从单糖发酵液中提取高纯度甜菊糖苷RA的方法，首先，对单糖生物酶发酵液进行预处理：

采用饱和蒸汽将发酵液3502毫升升温至95℃，维持20min。采用循环冷却水将一次澄清发酵液温度降至≤50℃。加入柠檬酸，调整单糖发酵液PH至4.0。添加8％的“天然有机高分子多糖复合絮凝剂”配置液，采用分离因素≥5000的高速离心机对经过上述预处理的发酵液进行一次除杂分离，透光度≥80，获得一次澄清发酵液。分离停留时间1h。

将上述澄清发酵液添加适量NaOH，调整PH值至7.0～9.0，为下一步分离甜菊糖苷做准备。

采用0.2μm微滤膜将上述一次澄清发酵液再进行二次动态过滤，获得二次澄清发酵液。二次澄清发酵液透光度≥90％，二次澄清发酵液体积2000毫升。

接着，二次澄清发酵液进入以下甜菊糖苷粗提纯和精提纯程序，包括：

1、树脂柱的准备：采用D201型大孔吸附树脂，树脂柱直径2.5cm，长度35cm，每个柱装处理好的大树脂100ml，处理好的阴、阳离子树脂各50ml。做对比实验，阴、阳离子树脂各1根，将两根大孔树脂的编号分别标以A和B。

2、树脂柱吸附：

①编号A柱吸附上述二次澄清发酵液，流速为每小时250～300ml，当流出液300ml(即3倍柱体积)后，以100ml为一个单位，每100ml先取流出液10ml用微滤膜过滤后，直接进样检测，无甜菊糖组分检出，将剩余90ml流出液倒掉，再接取10ml检测，剩余90ml的流出液倒掉。倒到四次后，共吸附700ml的二次澄清发酵液时，有甜菊糖组分泄露出来，停止吸附，该吸附的过程需要2.5～3.0小时。吸附完毕后，树脂柱经无盐水、0.5％浓度的NaOH溶液、0.5％HCL溶液处理至PH5～6时，停止水洗。再用75％乙醇解析至解析完全。解析液颜色浑浊，量取解析液体积为164ml，固含量为1.90％，得甜菊糖3.11g。取10ml的解析液蒸干后恒重称一定质量检测，含量检测如下：

STV％ RC％ RA％ RD％ 总甙％ 解析液 8.18 8.63 74.92 0.29 92.02

②编号B柱吸附上述二次澄清发酵液，流速为每小时250～300ml，当流出液300ml(即3倍柱体积)后，以100ml为一个单位，每100ml先取流出液10ml用微滤膜过滤后，直接进样检测，无甜菊糖组分检出，将剩余90ml流出液倒掉，再接取10ml检测，剩余90ml的流出液倒掉。倒到四次后，共吸附700ml的澄清液时有甜菊糖组分泄露出来，停止吸附，该吸附的过程需要2.5～3小时。吸附完毕后树脂柱先经无盐水处理，再加入75％乙醇解析至解析完全。解析液颜色浑浊，量取解析液体积为172ml，固含量为1.77％，得甜菊糖3.04g。取10ml的解析液蒸干后恒重称一定质量检测(具体质量见液相色谱方法)，含量检测如下：

STV％ RC％ RA％ RD％ 总甙％ 解析液 7.94 8.50 73.90 0.30 90.64

3、阴、阳离子交换处理

3.1 A柱解析液150ml以此经过阳离子树脂(001×16苯乙烯强酸性阳离子交换树脂)、阴离子树脂(SQD-913强碱性阴离子交换树脂)脱盐脱色处理。阴、阳离子树脂各四柱为一组，依次串联。解析液流速每小时200～300ml，出甜味后开始收集。精制完毕后用无盐水顶洗阳离子、阴离子至无甜味后停止收集。共计得精制液480ml，精制液颜色澄清透明，固含量0.50％，得甜菊糖2.40g，含量检测如下：

STV％ RC％ RA％ RD％ 总甙％ 精制液 8.25 8.55 75.31 0.29 92.40

3.2 B柱解析液160ml以此经过阳离子树脂、阴离子树脂脱盐脱色处理，流速每小时200～300ml，出甜味后开始收集。精制完后用无盐水顶洗阳离子串联阴离子至无甜味后停止收集，共计得精制液520ml，精制液颜色澄清透明，固含量0.48％，得甜菊糖2.50g，含量检测如下：

STV％ RC％ RA％ RD％ 总甙％ 精制液 7.95 8.18 74.24 0.21 90.58

4.精制处理

精制液经大孔树脂处理、离子树脂处理后，再经活性炭处理、微波干燥后，粗产品中甜菊糖苷总甙平均含量90～95％，再进入醇溶、重结晶处理，获得高纯度甜菊糖苷，具体如下：

4.1以实验总甙折合成95样品实验

4.1.1用88％乙醇溶粉及结晶

量取新配置的88％的乙醇120ml，经加热后,加入甜菊糖20g至完全溶解后，65℃保温10～15分钟。之后搅拌至晶体析出，过滤得晶体22g，母液固含量4.72％，晶体及母液含量检测如下：

RA STV RB RD STB RUB RC RF 总甙 晶体 95.64 0.89 0.54 1.12 0 0 0.61 0.33 99.13 母液 28.03 16.25 / 1.84 / / 8.82 1.53 56.48

用上述晶体19g，量取新配置86％乙醇55ml。经加热至40℃时加入晶体继续加热搅拌至无颗粒状，停止加热。降室温后1h过滤，得晶体16g，母液固含量3.44％，晶体及母液检测结果如下：

RA STV RB RD STB RUB RC RF 总甙 晶体 97.59 0.18 / 1.01 0 0 0.26 0.18 99.22 母液 77.22 4.25 / 3.59 / / 2.62 1.18 88.86

晶体烘干得RA97糖10.7g，实验收率53.5％。

4.1.2用86％乙醇溶粉及结晶

量取新配置的86％乙醇80ml，经加热后加入甜菊糖20g，至完全溶解后，65℃保温10～15分钟。之后搅拌至晶体析出，过滤得晶体21g，母液固含量7.41％，晶体及母液主要组分含量检测如下：

用上述晶体19g，量取新配置86％乙醇55ml加热至40℃时，加入晶体继续加热搅拌至无颗粒状，停止加热。降至室温后1h过滤，得晶体15g，母液固含量3.45％，晶体及母液检测结果如下：

晶体烘干得甜菊糖9.8g，估计收率49％。

4.2实验总甙折合成90样品实验。此糖的溶解度很低，因此后面实验用的溶剂比例大。

4.2.1用90％乙醇溶粉及结晶

量取新配置的90％乙醇130ml经加热后加入甜菊糖20g，至完全溶解，65℃保温10～15分钟。之后搅拌至晶体析出，过滤得晶体22g，母液固含量3.87％，晶体及母液含量检测如下：

用上述晶体19g，量取新配置90％乙醇55ml，经加热至40℃时加入晶体继续加热搅拌至无颗粒状，停止加热，开始搅拌。降至室温后1h过滤，得晶体13g，母液固含量4.24％，晶体及母液检测结果如下：

4.2.2用88％乙醇溶粉及结晶

量取新配置的88％乙醇130ml经加热至65℃，保温10～15分钟。之后搅拌至晶体析出，得晶体19g，母液固含量4.14％，晶体及母液含量检测如下：

用上述晶体20g，量取新配置88％乙醇65ml加热至40℃时加入晶体继续加热搅拌至无颗粒状，停止加热，开始搅拌。降室温后1h过滤，得晶体14g，母液固含量2.92％，晶体及母液检测结果如下：

4.2.3用86％乙醇溶粉及结晶

量取新配置的86％乙醇120ml经加热至65℃，大约45～50℃时加入上述甜菊糖20g至完全溶解，之后搅拌至晶体析出，过滤得晶体19g，母液固含量6.70％，晶体及母液含量检测如下：

用上述晶体17g，量取新配置86％乙醇加热至40℃时，加入晶体继续加热搅拌至无颗粒状，停止加热，开始搅拌。降室温后1h过滤，得晶体12g，母液固含量3.59％，晶体及母液检测结果如下：

以上二次晶体经过真空微波干燥机脱水干燥、粉碎，获得终产品。

本方案经过多批次运行后，平行取样该干燥产品经HPLC检测，平均数据如下：

RA STV RB RD RC RF 总甙 99.82％ 0.08％ 0.05％ 0.01％ 0.02％ 0.01％ 99.99％

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。