技术领域
本发明涉及一种耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)菌株及其制备方法，尤其涉及一种表达IL-17A的重组耻垢分枝杆菌及其制备方法。
背景技术
免疫佐剂又称非特异性免疫增生剂，是一种与抗原同时或预先注射于机体、能够增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的辅助物资，其可以增加抗原表面积，使抗原易于被巨噬细胞吞噬、改变抗原物理性状，延长抗原作用时间、增强辅助T细胞的作用、刺激致敏淋巴细胞的分裂和浆细胞的产生、提高机体初次和再次免疫应答抗体的滴变、以及改变抗体产生类型和迟发型变态反应，并使其增强；因此，免疫佐剂在疾病的预防方面有着及其重要的作用。
铝盐佐剂是第一个被批准用于人的佐剂，主要功能为缓释作用，同时也具备对免疫细胞的激活作用，但是铝盐佐剂与某些抗原混合注射后会引起局部炎症反应，甚至形成肉芽肿。弗氏佐剂是一种含有分枝杆菌成分的佐剂，具有较强的免疫增强效应，是应用最广泛的试验用佐剂，由于弗氏佐剂注射部位强烈的副反应，因此该佐剂目前只用于实验目的的免疫研究。
细胞因子作为新型免疫佐剂已经在临床应用， IL-2、IFN-γ等重组卡介苗已成功应用于浅表性膀胱癌的治疗研究，如中国专利CN100360668C公开的一种分泌肿瘤坏死因子-α重组卡介苗，以及中国专利CN1710072A公开的分泌人白介素-2重组卡介苗，均能够有效预防和治疗浅表性膀胱肿瘤；中国专利CN100374548C公开还公开了一种重组干扰素卡介苗菌株，在增加免疫效果的同时，还可以减少BCG用量，降低毒副作用。但是，BCG生长缓慢的特性为转基因过程带来诸多不便。
耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)是具有与BCG相似抗原的分枝杆菌，也是常用的细胞免疫佐剂，同BCG相比，耻垢分枝杆菌具有生长快、非致病性的特点，其应用范围更为广泛。目前已有多种细胞因子在耻垢分枝杆菌中得到表达，如表达TNF-α的重组耻垢分枝杆菌应用于膀胱癌，并获得较好的增强免疫应答效果(Int. J. Cancer，2004，112(4)：653-660)；如专利CN1339583A公开的重组耻垢分枝杆菌，含有人结核杆菌热休克蛋白70启动子cDNA，也可用来治疗膀胱肿瘤；专利CN101875913A公开了一种结核分枝杆菌Ag85B和ESAT-6融合蛋白的重组耻垢分枝杆菌（CCTCC NO:M2010097）可用于预防和治疗结核病；又如表达IL-2和GLS的重组耻垢分枝杆菌可以增强小鼠抗肺结核菌感染的免疫应答(Vaccine，2007，25(4)：638-648)。但是表达IL-17A(白介素-17A，Interleukin 17A)的重组耻垢分枝杆菌尚未见有报道。
发明内容
本发明提供了一种表达IL-17A(SEQUENCE No.4)的重组耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis) IL-17A，通过穿梭表达载体构建了一种表达IL-17A的重组耻垢分枝杆菌，并制备该重组耻垢分枝杆菌疫苗，使重组疫苗刺激固有免疫和获得性免疫应答能力得到加强，提高免疫保护效力。
本发明耻垢分枝杆菌IL-17A已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.4446，保藏日期：2010年12月10日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；其中，表达IL-17A基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体在所述耻垢分枝杆菌IL-17A中表达。
本发明所述耻垢分枝杆菌制备方法如下：
步骤1，依据IL-17A基因序列设计扩增引物，经PCR扩增得到IL-17A基因表达片段，然后将所述IL-17A基因表达片段克隆至载体，获得重组载体；
步骤2，电转化所述重组载体至耻垢分枝杆菌，得到所述耻垢分枝杆菌IL-17A。
优选地，在所设计的上游引物在IL-17A基因上游引入BamHⅠ酶切位点；使所设计的下游引物在IL-17A基因下游引入Hind Ⅲ酶切位点。
其中，所述扩增引物由5’端至3’端寡核苷酸序列优选为：
上游引物：CAGGGATCCGCGGCTACAGTGAAGGC(SEQUENCE No.1)；
下游引物：AGTAAGCTTTTAGGCTGCCTGGCGGACAAT(SEQUENCE No.2)。
其中，所述上游引物中GGATCC(下划线部分)为BamHⅠ酶切位点；所述下游引物中AAGCTT(下划线部分)为Hind Ⅲ酶切位点。
其中，所述载体优选为大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体(SEQUENCE No.3)。
本发明还提供了所述耻垢分枝杆菌IL-17A在制备增强非特异性抗感染免疫的药物、疫苗或免疫佐剂中的应用。
本发明还提供了所述耻垢分枝杆菌IL-17A在制备获得性免疫的药物、疫苗或免疫佐剂中的应用。
其中，优选为在制备预防和控制因过敏性哮喘或呼吸道感染导致的哮喘气道损伤药物中的应用，尤其是在制备治疗和预防儿童过敏性哮喘药物中的应用。并进一步优选为在制备预防和控制因肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)感染导致的炎症损伤的药物中的应用。
综上所述，本发明提供了一种表达IL-17A的重组的耻垢分枝杆菌IL-17A及其制备方法，并提供了所述耻垢分枝杆菌IL-17A在制备药物中的应用。
IL-17A是一种调节固有免疫和获得性免疫的重要因子，通过促进趋化因子、炎症细胞因子表达等多种途径参与病原体感染的防御和清除过程；且在唤醒免疫接种后T细胞记忆效应方面具有重要的意义。因此构建表达IL-17A的分枝杆菌疫苗有助于增强疫苗接种激发的非特异性抗感染能力，有助于预防微生物感染导致的哮喘急性加剧；而且外源性IL-17A在低剂量时主要表现为抑制嗜酸性细胞募集和抑制Th2反应，动物实验显示外源性IL-17A剂量低于2.5μg/kg时几乎不加重哮喘小鼠中性粒细胞募集；而IL-17A抑制TNF-α诱导RANTES表达的能力是其激活TNF-α诱导IL-6、IL-8分泌的6倍，因此低剂量表达IL-17A的分枝杆菌疫苗在预防哮喘中具有明显的优势。
耻垢分枝杆菌与结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis)具有高度同源性，可作为抗结核药物的替代菌种，并且耻垢分枝杆菌为快生菌和非致病性菌，有着更好的应用前景。
本发明所述耻垢分枝杆菌IL-17A具有耻垢分枝杆菌和IL-17A的双重作用，使得重组后的分枝杆菌促进非特异性抗感染免疫和抑制过敏原介导的气道免疫炎症损伤的作用得到显著的增强，尤其在预防和控制过敏性哮喘或呼吸道感染导致的哮喘气道损伤中能够起到重要的作用。
附图说明
图1为耻垢分枝杆菌与本发明耻垢分枝杆菌IL-17A生长曲线图；
图2为WB鉴定IL-17A在本发明耻垢分枝杆菌IL-17A中的表达结果图；
图3为pMFA41-mIL-17a重组质粒在rM.smegmatis表达的PCR鉴定及酶切鉴定结果。
具体实施方式
本发明提供了一种表达重组白介素-17A的耻垢分枝杆菌菌株IL-17A，与已有耻垢分枝杆菌区别在于：表达IL-17A基因的大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体在耻垢分枝杆菌中表达。
其制备方法如下：
步骤1，依据已知IL-17A基因序列设计扩增引物，并在上下游引物中分别引入BamHⅠ酶切位点和Hind Ⅲ酶切位点；经PCR反应得到IL-17A基因表达片段；将所述IL-17A基因表达片段克隆至载体(如大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体，pMFA41载体)，获得重组载体；其中，IL-17A基因序列的获取和提纯可根据现有技术进行操作，操作条件在下面内容中介绍，在此不再赘述。
步骤2，耻垢分枝杆菌培养和制备感受态细胞，电转化所述重组载体至耻垢分枝杆菌，得到所述耻垢分枝杆菌IL-17A。
本发明所述耻垢分枝杆菌IL-17A已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.4446。
下面以小鼠白介素17-A、大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达载体pMFA41、和耻垢分枝杆菌M.smegmatis mc2155菌株为例，通过具体的实施例对本发明耻垢分枝杆菌IL-17A及其制备方法进行具体介绍，以更好的理解本发明，但下述实施例并不限制本发明范围。
实验材料：小鼠，M.smegmatis mc2155 (美国科罗拉多州立大学微生物系分枝杆菌研究室)，pMDTM18-T载体(TaKaRa公司)，pET28a载体(Novagen公司)，大肠杆菌E.coli、TOP10(市场购得)， pMFA41载体(自制)。
步骤1，依据IL-17 A基因序列设计扩增引物，经PCR反应得到IL-17 A基因表达片段；并将所述IL-17 A基因表达片段克隆至载体，获得重组载体；
1．1．小鼠脾细胞的制备与培养
6周龄雌性BALB/c小鼠的脾脏放入培养基中，并在200目不锈钢细胞筛中轻轻研压，制备细胞悬液。
取细胞悬液移入离心管中，1640培养基洗涤、1000r/min离心三次；弃上清，加入红细胞裂解液进行裂解，然后加入1640培养基轻轻振荡混匀，低温离心机水平转子离心10min(1000r/min)。
弃上清，加入10%胎牛血清及双抗(青霉素100U/ml，链霉素100U/ml)制成细胞悬液，接种于细胞培养板，加入PHA-P刺激细胞活化，培养24小时收获细胞。
1．2．小鼠IL-17A基因的扩增
Trizol法抽提小鼠脾细胞总RNA，然后制备cDNA。其中cDNA制备方法如下：RNA在65℃下预变性5分钟，立即置于冰上冷却；然后进行逆转录反应，逆转录反应体系如下：
逆转录反应条件：37℃反应15min，然后98℃反应5min，得到的cDNA。
设计引物扩增小鼠IL-17A，引物如下：
其中上游引物在小鼠IL-17A上游引入BamHⅠ酶切位点(下划线部分)，下游引物在小鼠IL-17A下游引入HindⅢ酶切位点(下划线部分)，进行PCR反应，反应体系如下：
PCR反应条件：PCR反应程序为95℃，5分钟—(94℃，30秒—52℃，30秒—72℃，1分钟) ×30次循环，72℃延伸5分钟，加入TaqDNA聚合酶延伸10min。
IL-17a基因PCR产物分离与纯化：PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下于约438bp处切下含目的DNA的琼脂糖凝胶块；将离心管加入凝胶前后分别称重，计算凝胶重量记为1个凝胶体积(GV，100mg=100μl体积)，加入3倍GV的溶胶液Buffer DE-A；65~75℃加热至胶块完全熔化；加1.5倍凝胶体积的Buffer DE-B，混匀；转移溶液至DNA吸附柱，5000rpm离心30秒；离心液重新倒入吸附柱，离心分离；将吸附柱转移至灭菌1.5ml离心管中，在吸附柱的膜中央处加入Eluent 25~30μl，65℃温育2分钟，离心洗脱DNA，按60%回收率计算回收后各DNA片段的浓度。
为了能方便的将IL-17A进行提纯以及与穿梭表达载体的重组，可以进行以下重组质粒的构建步骤：
1．3．重组pMDTM18-T-IL-17A质粒的构建
pMDTM18-T与IL-17A的PCR产物连接。反应体系如下：
其中，solutionⅠ指的是市售pMDTM18-T载体自带溶剂。
1．4．重组表达质粒pET28a-IL-17A的构建
抽提pMDTM18-T-IL-17A质粒，双酶切制备IL-17A基因片段；双酶切反应体系为：
双酶切反应条件，37℃，2小时。
pET28a加入TOP10感受态细菌细胞中，冰上放置30min，42℃加热90秒，冰上放置。LB培养基37℃培养；抽提，双酶切pET28a质粒制备pET28a载体大片段，双酶切反应体系为：
双酶切反应条件，37℃，2小时。
将双酶切得到的pET28a大片段与IL-17A基因片段22℃连接2小时，制得重组质粒pET28a-IL-17A，连接反应体系如下：
1．5．pMFA41-IL-17A重组载体的构建
37℃双酶切pET28a-IL-17A质粒得到IL-17A，双酶切反应体系如下：
pMFA41质粒加入TOP10感受态细胞中，冰上放置30min，42℃加热90秒，冰上放置；加入LB培养基37℃培养；然后抽提pMFA41质粒。
将pMFA41质粒进行37℃双酶切制得pMFA41载体大片段，双酶切反应体系如下：
其中，pMFA41质粒参照已有文献（Fan X Y，Ma H，et al.， A novel differential expression system for gene modulation in Mycobacteria，[J]. Plasmid，2009，61(1)：39~46，其中，Fan X Y为本申请发明人之一范小勇）进行构建。
pMFA41与IL-17A在22℃温度下连接2小时，连接反应体系如下：
步骤2，电转化所述重组载体至耻垢分枝杆菌
以耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)mc2 155菌种为例，LBG琼脂培养基中37℃培养3~5天，刮取单菌落接种至LBG培养基200rpm振荡培养至对数生长周期，回收菌体，并制备感受态细胞。
取感受态细胞加入pMFA41-IL-17A，冰上放置10min，转移至电击杯中，设置电转化仪(Gene Pulser Xcell Electioporation System，Bio-Rad)参数为2.5kv、25μF、1000Ω，放电后立即加入LBG培养基，37℃振荡温育4小时使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素基因。
将转化的感受态细胞涂布在含有KNA的LBG琼脂培养基上，倒置平皿37℃培养3~5天，得到耻垢分枝杆菌IL-17A(Mycobacterium smegmatis-IL-17A)。
步骤3，耻垢分枝杆菌IL-17A(Mycobacterium smegmatis-IL-17A，M.smegmatis-IL-17A)的鉴定
3.1．PCR鉴定
挑选形态饱满生长良好的菌落，采用步骤1中的引物进行PCR反应；PCR反应程序：95℃，5min—(94℃，30s—52℃，30s—72℃，1min)×30次—72℃延伸10min，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。PCR反应体系如下：
电泳检测结果如图3所示，图中M1泳道为DL-2000 plus DNA标记；第1泳道为空白对照；第2泳道为M.smegmatis-IL-17A菌落PCR；第3泳道为重组载体pMFA41-IL-17A；第4泳道为重组载体pMFA41-IL-17A的BamH I-HindⅢ酶切产物；M2泳道为DL-250 DNA标记。
图中第3泳道可以看出本发明获得了与预期大小相符的基因扩增产物，即IL-17A基因正确克隆至所述耻垢分枝杆菌。
3.2．pMFA41-IL-17A质粒转化对Mycobacterium smegmatis-IL-17A生长曲线的影响
分别挑取Mycobacterium smegmatis、Mycobacterium smegmatis-IL-17A菌落接种于LBG培养基，37℃低转速振荡培养，定时取样测定OD600值，绘制生长曲线，如图1所示。
图1中，本发明Mycobacterium smegmatis-IL-17A比野生型细菌生长速度略为缓慢，约在接种14h后进入对数生长期，且可以维持对数生长10小时以上。
3.3．Western-Bolt(WB)鉴定IL-17A在Mycobacterium smegmatis-IL-17A中的表达
（1）Mycobacterium smegmatis-IL-17A菌体蛋白制备：取2 ml诱导后的菌液置微量离心管中，12000 rpm离心5 min收集菌体沉淀，经TBS洗涤2次后重悬于150μl的TBS中，冰浴中超声波破碎细胞至溶液澄清。在全菌体超声裂解液中加入50 ml 4倍稀释蛋白上样缓冲液。95℃热变性5 min后经12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品。
（2）SDS-PAGE电泳。
（3）半干法转膜：转膜方法同前，简述如下：制作凝胶、PVDF膜、滤纸三明治结构，平置于半干转移装置(Bio-Rad)中，设置电压为15 V，恒压模式转膜20 min。
（3）抗体孵育：封闭及洗膜方法同前，简述如下：将封闭后的PVDF膜，以大鼠抗小鼠IL-17A抗体（R&D system）为一抗，按1：4000稀释于样品稀释液(5%脱脂奶粉，1′TBS-T20)，PVDF膜浸入抗体液中4℃孵育过夜，弃一抗溶液，用1倍稀释的TBS-T洗膜5次；加入按1：10000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG (Santa Cruz Biotechnology Inc.) 37℃孵育1h，弃二抗溶液，1倍稀释的TBS-T洗膜5次。
（4）发光及显影：分别取300μl ECL底物A和底物B组分混匀后置于保鲜膜上，将PVDF转印膜正面覆盖其上，轻轻拖动PVDF膜，使之充分与底物反应。用镊子垂直夹住PVDF膜一角，滴干底物溶液，用另一保鲜膜包好正面朝上置于X光暗片夹中。暗室中取一张X光片置于膜上，合上片夹，依据荧光强度，曝光1 min，取出胶片投入显影液中，红色光下观察显影条带清楚后，夹出胶片投入定影液中，轻轻晃动洗涤，清水冲洗胶片，通风处晾干，扫描仪采集图像。
Western-Bolt鉴定结果如图2所示，其中，条带1为耻垢分枝杆菌细胞分解产物(total cell lysate of wild type Mycobacterium smegmatis)，条带2~5为耻垢分枝杆菌-17A细胞分解产物(total cell lysate of wild type Mycobacterium smegmatis-IL-17A)。从图中可以看出，约20kDa处出现阳性条带，标准对照株在此处无阳性条带，表明重组耻垢分枝杆菌成功表达了可与抗体特异性结合的目的蛋白。
通过上述鉴定结果可以看出，本发明所述方法制备出了目的产物耻垢分枝杆菌IL-17A。
步骤4，耻垢分枝杆菌IL-17A功能验证
4.1．增强RAW264.7细胞非特异性抗感染能力
分别以耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、耻垢分枝杆菌IL-17A刺激体外培养的RAW264.7细胞，72小时后以ELISA(enzyme-linked immuno sorbent assay)法检测培养上清中巨噬细胞炎症蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)-1α、MIP-2β、INF-γ以及IL-4的表达；以real-time荧光定量PCR检测培养细胞中Defensin β2、Eotaxin-1、MIP-1α、MIP-2β、IL-6、IL-10、以及IL-23mRNA的表达。
结果：耻垢分枝杆菌和耻垢分枝杆菌IL-17A均能促进Defensin β2、MIP-1α、MIP-2β、INF-γ、IL-4抑制Eotaxin-1在体外培养的RAW264.7细胞中表达，而本发明耻垢分枝杆菌IL-17A调节免疫应答能力较耻垢分枝杆菌提高。其中，本发明耻垢分枝杆菌IL-17A组与耻垢分枝杆菌组Defensin β2、MIP-1α、MIP-2β、IL-6倍数诱导率之比分别为80：20、2.5：1.5、2.5：1、3：1，
4.2．耻垢分枝杆菌IL-17A鼻粘膜免疫安全性和免疫原性
耻垢分枝杆菌IL-17A鼻粘膜接种免疫BALB/c小鼠，耻垢分枝杆菌、IL-17A蛋白作为对照，动态观察接种反应并检测体重增长情况；进行肺组织和脾组织匀浆中分枝杆菌CFU(colony-forming unit)计数、以及肺组织形态观察，评估耻垢分枝杆菌生存能力和接种安全性；ELISA法检测肺组织匀浆和血清中IL-17A、INF-γ以及IL-4的表达，评估其刺激非特异性免疫应答能力。
结果：表达IL-17A后对分枝杆菌体内体外生存能力没有明显影响，肺组织病理和病原体培养结果显示，本发明耻垢分枝杆菌IL-17A鼻粘膜接种是一种安全的免疫方式，不会造成肺组织病理损伤；同时鼻粘膜接种本发明耻垢分枝杆菌IL-17A诱导IL-17A和IFN-γ表达的作用强于耻垢分枝杆菌，调节免疫应答作用的维持时间比IL-17A显著增强。
4.3．耻垢分枝杆菌IL-17A接种抗MP感染致哮喘加重的作用
实验动物随机分为9组，分别接受不同处理干预：M.smegmatis+OVA组接受M.smegmatis接种和模拟感染；M.smegmatis+OVA+MP组接受M.smegmatis接种和MP感染；M.smegmatis+OVA+IL-17A+MP组接受M.smegmatis接种IL-17A免疫以及MP感染；耻垢分枝杆菌IL-17A+OVA组接受耻垢分枝杆菌IL-17A接种和模拟感染；耻垢分枝杆菌IL-17 A +OVA+MP 接受耻垢分枝杆菌IL-17 A接种和MP感染；PBS+MP组接受模拟接种和MP感染；IL-17A+MP组接受IL-17A免疫和MP感染；耻垢分枝杆菌IL-17 A +MP组接受耻垢分枝杆菌IL-17 A接种和MP感染。所有OVA处理组均接受OVA腹腔注射致敏和气雾吸入激发。除增加BALF和细胞培养上清中IL-17A的检测以及肺组织病理IL-17A的免疫组化检测外，其余指标检测和评价方法均同前。
结果：本发明表达IL-17A使得重组疫苗刺激IL-6、IL-23以及Defensin β2基因表达的能力，以及对肺炎支原体的清除能力得到加强。与M.smegmatist相比本发明耻垢分枝杆菌IL-17 A抑制Eotaxin-1表达、诱导Th1型免疫应答以及下调IgE介导的免疫变态反应的能力均得到了加强。
因此本发明耻垢分枝杆菌IL-17A具有增强非特异性抗感染免疫、调节免疫炎症反应等功能，能够用来制备预防和控制因过敏性哮喘或呼吸道感染导致的哮喘气道损伤药物；尤其针对目前卡介苗接种对儿童哮喘保护作用不确切的缺陷，本发明耻垢分枝杆菌IL-17A能够在预防和控制过敏性哮喘或呼吸道感染导致的哮喘气道损伤加剧中发挥重要作用。
本发明上述内容中，所述M.smegmatis和Mycobacterium smegmatis均指的是耻垢分枝杆菌；M.smegmatis-IL-17A和Mycobacterium smegmatis-IL-17A均指的是本发明耻垢分枝杆菌IL-17A。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，其中未提及的操作方法和手段应当理解为采用本技术领域常规方法和手段进行操作。同时上述实施例只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
SEQUENCE
<110> 上海市第六人民医院
<120> 耻垢分枝杆菌IL-17A及其制备方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 1
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<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR引物
<400> 2
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<210> 3
<211> 417
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 白介素-17A
<400> 3
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1 5 10 15
Cys Ala Gly Cys Ala Gly Cys Gly Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Cys
20 25 30
Thr Cys Ala Ala Ala Gly Cys Thr Cys Ala Gly Cys Gly Thr Gly Thr
35 40 45
Cys Cys Ala Ala Ala Cys Ala Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys Cys Ala
50 55 60
Ala Gly Gly Ala Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala
65 70 75 80
Thr Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Cys Cys Thr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Thr Cys Thr Thr Thr Ala Ala Cys Thr Cys Cys Cys
100 105 110
Thr Thr Gly Gly Cys Gly Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Ala Gly
115 120 125
Cys Thr Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Gly Cys Cys Cys Thr Cys Ala
130 135 140
Gly Ala Cys Thr Ala Cys Cys Thr Cys Ala Ala Cys Cys Gly Thr Thr
145 150 155 160
Cys Cys Ala Cys Gly Thr Cys Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys
165 170 175
Thr Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Thr Gly Ala Ala
180 185 190
Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Ala Thr Ala Gly Ala Thr Ala Thr Cys
195 200 205
Cys Cys Thr Cys Thr Gly Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala
210 215 220
Ala Gly Cys Thr Cys Ala Gly Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys
225 230 235 240
Cys Ala Gly Cys Gly Cys Thr Gly Thr Gly Thr Cys Ala Ala Thr Gly
245 250 255
Cys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala
260 265 270
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275 280 285
Gly Thr Thr Cys Thr Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly
290 295 300
Ala Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys Thr Gly Ala Ala
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Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Cys Cys Thr Gly Ala Gly Ala Gly Cys
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<210> 4
<211> 4395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pMFA41穿梭表达载体
<400> 4
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ttgccaatga tgttacagat gagatggtca gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc 360
ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga 420
tccccgggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg 480
ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt 540
ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg 600
ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag 660
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