猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物及方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102071256 B (45)授权公告日 2012.08.29 CN 102071256 B *CN102071256B* (21)申请号 200910172716.9 (22)申请日 2009.11.25 C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/11(2006.01) G01N 21/64(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (73)专利权人 河南农业大学 地址 450002 河南省郑州市文化路 95 号 (72)发明人 魏战勇 胡慧 陈红英 崔保安 李明凤 郭显坡 贾艳艳 (74)专利代理机。

2、构 郑州中原专利事务所有限公 司 41109 代理人 张绍琳 CN 101260442 A,2008.09.10, 全文 . 李明凤等 . 猪伪狂犬病毒 SYBR-Green 实 时定量 PCR 检测方法的建立 .河南农业大学学 报 .2009, 第 43 卷 ( 第 3 期 ), 全文 . (54) 发明名称 猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒 2 型二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 检测引物及方法 (57) 摘要 本发明公开了猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒 2 型二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 检测引物及 方法， 设计与合成出引物， 利用引物检测猪伪狂犬 病毒与猪圆环病毒。

3、 2 型的二重 SYBRGreen I 实时 荧光 PCR 检测方法， 包括提取样品的 DNA 后， 利 用 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应体系和 SYBR Green I实时荧光PCR扩增程序对样品进行检测。 本发明能够同时检测出猪伪狂犬病毒与猪圆环病 毒 2 型两种 DNA 病毒， 不能检测出猪细小病毒、 猪 瘟病毒、 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒。 本发明具有较好的敏感性、 重复性与稳定性， 有利 于妊娠母猪繁殖障碍性病毒病的鉴别与诊断。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吴立 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页 (19)中华人民共和。

4、国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页 1/1 页 2 1.猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧光PCR检测引物， 其特征 在于 ： 猪圆环病毒 2 型引物的序列如下 ： 上游引物 P1 ： 5 -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3 ； 下游引物 P2 ： 5 -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3。 猪伪狂犬病毒引物的序列如下 ： 上游引物 P3 ： 5 -CAA CCC GCT CGT GCT C-3 ； 下游引物 P4 ： 5 -GCT GCT CCT CCA TGT C。

5、CT-3 权 利 要 求 书 CN 102071256 B 2 1/8 页 3 猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Green I实时荧 光 PCR 检测引物及方法 技术领域 0001 本发明涉及一种实时荧光 PCR 检测方法， 具体涉及猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒 2 型二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 检测引物及方法。 背景技术 0002 猪伪狂犬病病毒 (PRV) 的传染源以及自然贮存宿主。猪感染 PRV 后常引起初生仔 猪发病， 死亡率可达 100 ； 猪伪狂犬病可呈现典型的潜伏感染， 任何年龄的猪耐过急性感 染后， 均能形成潜伏感染， 病毒在猪体内终生潜伏， 一定条。

6、件下潜伏的病毒可以激活， 引起 复发性感染并向外散毒， 这种机制导致伪狂犬病很难根除。猪圆环病毒 2 型 (PCV2) 具有致 病性， 主要引起一种新发现的传染病 - 断奶仔猪多系统衰竭综合征， PCV2 感染猪可能不一 定发病， 但不良的生存环境以及不当的免疫刺激， 可促使猪圆环病毒病病症的出现 ； 猪圆环 病毒还可与其它病毒等病原常常混合感染， 使得疾病在诊断上变得更该加困难 ； 其可以抑 制猪的免疫系统， PCV2 能够进入巨噬细胞内而不被破坏。使得到目前为止， 尚没有统一、 快 速的诊断方法和针对该病预防疫苗和特效药物， 该病有时呈亚临床感染， 所以要做好该病 的诊断显得很重要。 00。

7、03 SYBR Green 是非特异性结合于双链 DNA 的荧光染料， 可以和多种扩增序列结合。 SYBRGreen I 实时荧光 PCR 不仅可以对目的核酸进行比较准确的定量， 而且还可通过溶解 曲线分析， 利用目的片段的 Tm 值的不同， 能够在同一 PCR 管内进行多重 PCR 反应， 这就为同 时进行多种动物疾病的诊断提供了一种新的方法。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种同时检测猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒 2 型 两种病毒的二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 检测方法。 0005 本发明的技术方案是 ： 猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒2型二重SYBR Gree。

8、n I实时荧 光 PCR 检测引物的序列如下 ： 0006 猪圆环病毒 2 型引物的序列如下 ： 0007 上游引物 P1 ： 5 -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3 ； 0008 下游引物 P2 ： 5 -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3。 0009 猪伪狂犬病毒引物的序列如下 ： 0010 上游引物 P3 ： 5 -CAA CCC GCT CGT GCT C-3 ； 0011 下游引物 P4 ： 5 -GCT GCT CCT CCA TGT CCT-3。 0012 利用上述引物检测猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒 2 型的二重 SYBR Gree。

9、n I 实时荧 光 PCR 检测方法， 包括提取样品的 DNA 后， 按如下 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应体系和 SYBRGreen I 实时荧光 PCR 扩增程序对样品进行检测。 0013 所述 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应体系， 在 25l 体系中加入以下成份 ： 说 明 书 CN 102071256 B 3 2/8 页 4 0014 SYBR Green I PreMix 15l 0015 P1/P3 0.5+0.5l 0016 P2/P4 0.5+0.5l 0017 DNA 1+1l 0018 ddH2O 6l 0019 25l 0020 所述 。

10、SYBR Green I 实时荧光 PCR 扩增程序为 ： 95预变性 5min ； 进入循环， 95 变性 15s， 55退火 20s， 72延伸 20s， 40 个循环 ； 反应结束后先加热至 95， 然后再降至 65， 开始以 0.5 /s 递增至 95检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。 0021 本发明的有益效果是 ： 本发明能够同时检测 PCV2、 PRV 两种 DNA 病毒， 能最少检 测 180 拷贝猪伪狂犬病毒质粒和 215 拷贝猪圆环病毒 2 型质粒 ； 不能检测出猪细小病毒 (PPV)、 猪瘟病毒、 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒。 本发明具有较好的敏感性、 重复 性。

11、与稳定性， 有利于妊娠母猪繁殖障碍性病毒病的鉴别与诊断。 附图说明 0022 图 1 为 PCV2 蛋白基因部分核苷酸序列质粒 PCR 鉴定结果 ； 0023 图 2 为 PRV gH 蛋白基因部分核苷酸序列质粒 PCR 鉴定结果 ； 0024 其中， 图 1， 图 2 中， 1. 目的片段 M.DL 2000Marker 0025 图 3 为二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应溶解曲线 ； 0026 图 4 为二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应特异性试验溶解曲线 ； 0027 图 5 为二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应同浓度重复性试。

12、验溶解曲线 ； 0028 图 6 为二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应不同浓度重复性试验溶解曲线。 具体实施方式 0029 实施例 0030 猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒 2 型二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 检测引物的序 列如下 ： 0031 猪圆环病毒 2 型引物的序列如下 ： 0032 上游引物 P1 ： 5 -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3 ； 0033 下游引物 P2 ： 5 -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3。 0034 猪伪狂犬病毒引物的序列如下 ： 0035 上游引物 P3 ： 5 -CAA。

13、CCC GCTCGTGCTC-3 ； 0036 下游引物 P4 ： 5 -GCT GCT CCT CCA TGT CCT-3。 0037 利用上述引物检测猪伪狂犬病毒与猪圆环病毒 2 型的二重 SYBR Green I 实时荧 光 PCR 检测方法， 包括提取样品的 DNA 后， 按如下 SYBR GreenI 实时荧光 PCR 反应体系和 SYBRGreen I 实时荧光 PCR 扩增程序对样品进行检测。 0038 所述 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应体系， 在 25l 体系中加入以下成份 ： 0039 SYBR Green I PreMix 15l 0040 P1/P3 。

14、0.5+0.5l 说 明 书 CN 102071256 B 4 3/8 页 5 0041 P2/P4 0.5+0.5l 0042 DNA 1+1l 0043 ddH2O 6l 0044 25l 0045 所述 SYBR Green I 实时荧光 PCR 扩增程序为 ： 95预变性 5min ； 进入循环， 95 变性 15s， 55退火 20s， 72延伸 20s， 40 个循环 ； 反应结束后先加热至 95， 然后再降至 65， 开始以 0.5 /s 递增至 95检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。 0046 上述实施例中， 关于材料与方法 ： 0047 1 材料与方法 0048 1.1 材。

15、料 0049 1.1.1 毒株、 细胞株和菌株 0050 PK-15 细胞， 猪伪狂犬病毒标准毒株均购自中国兽药监察所 ； 猪细小病毒， 猪圆环 病毒 2 型， 猪繁殖与呼吸综合征病毒， 猪瘟病毒和猪流感病毒标准毒株均购自河南省动物 性食品安全重点实验室 ； 工程菌 DH5 感受态细胞购自大连宝生物工程有限公司。 0051 1.1.2 常用溶液及培养基 0052 LB 液体培养基 ； 氨苄青霉素 (Ampicillin， Amp) 贮存液， 100mg/ml ； IPTG 浓度为 100mg/ml ； X-gal 浓度为 20mg/ml， 保存于棕色瓶内或用铝箔包裹的瓶内， 以上溶液均贮存 于。

16、 -20备用。 0053 1.1.3 主要仪器及试剂 0054 紫外凝胶成像系统购自美国 ALPHA INNOTECH 公司 ； Rotor-Gene 3000 型实时定量 PCR 扩增仪购自澳大利亚基因公司、 PTC-200 型 PCR 仪购自美国 MJ 公司、 3K30 型高速冷冻 离心机购自德国 SIGMA 公司等。 0055 SYBR Green I PreMix ； EX TaqDNA聚合酶、 DNA marker DL2000购自大连宝生物工 程有限公司 ； Protein K 购自华美生物工程公司 ； DMEM 培养基购自 GIBCOBRL 公司 ； 胎牛血 清购自 Hyclon。

17、e 公司 ； 胰蛋白酶购自 LTI 公司 ； T4DNA 连接酶、 PGEM-T Easy 质粒载体均购 自Promega公司 ； DNA凝胶回收试剂盒购自杭州维特洁生物技术有限公司 ； 质粒提取试剂盒 购自北京博大泰克生物公司。 0056 1.2 方法 0057 1.2.1PCV2 的培养增殖 0058 将 PCV2 同步接种于未贴壁的 PK-15 细胞， 接毒量为培养液的 1/10， 将细胞置于 37， 5 CO2的培养箱中培养 72h 后， 终止培养并收毒。反复冻融 2 3 次， 收集病毒液， 直接进行病毒 RNA 的提取或 -80贮存备用。 0059 1.2.2PRV 的培养增殖 00。

18、60 当 PK-15 细胞达 90以上时， 接种 100TCID50 PRV， 37吸附 1h， 洗去未吸附病毒， 加入适量的细胞维持液， 待细胞病变达到 70时， 终止培养， 反复冻融 2 3 次， 收集病毒 液， 直接进行病毒 DNA 的提取或 -80贮存备用。 0061 1.2.3 引物设计与合成 0062 以 GenBank 公布的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因为参照序列 (AF027217)， 用 Primer Premier5.0 生物软件设计出 1 对上游引物和下游引物， 预计扩增片段为 171bp。引物的序 说 明 书 CN 102071256 B 5 4/8 页 6 列如。

19、下 ： 0063 上游引物 P1 ： 5 -TAA CTA CTC CTC CCG CCA TAC-3 ； 0064 下游引物 P2 ： 5 -GCC TAC GTG GTC TAC ATT TCC-3 ； 0065 根据 GenBank 登录的 Klupp 报道的猪伪狂犬病毒 gH 基因序列， 按照引物设计原 则， 应用 Primer Premier 5.0 生物软件设计出 1 对特异引物， 预计扩增片段为 187bp， 引物 序列如下 ： 0066 上游引物 P3 ： 5 -CAA CCC GCT CGT GCT C-3 ； 0067 下游引物 P4 ： 5 -GCT GCT CCT CC。

20、A TGT CCT-3 ； 0068 上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。 0069 1.2.4PRV、 PCV2、 PPV 病毒 DNA 的提取 0070 传统的蛋白酶 K 提取方法 ： 取增殖的病毒液各 450l， 加入等体积样品裂解缓冲 液 0.02mol/L Tris HCl(PH 7.5)， 0.03mol/L EDTA， 1 SDS， 混匀， 再加入蛋白酶 K( 终 浓度为 200g/m L)， 56水浴 1h， 然后加入等体积的平衡酚， 混匀， 10000rpm 离心 5min。 取上清， 经酚氯仿异戊醇 (25 24 1) 再次抽提后用 2 倍体积的异丙醇沉淀， -20 。

21、放置 30min， 12000rpm 离心 10min， 70乙醇洗涤 2 次， 干燥， 加入 25l 超纯水溶解， 贮存 于 -20备用。 0071 1.2.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒、 猪瘟病毒、 猪流感病毒 cDNA 的制备 0072 分别取400l的病毒液， 加入400l Trizol， 剧烈振荡 ； 加入100l氯仿异戊 醇 (24 1) 剧烈振荡 30s， 混匀 ； 放入台式离心机 12000rpm， 室温离心 5min ； 取上层水相， 小心转移至经 DEPC 水处理过的 1.5ml 无菌离心管中， 加入 150l 无水乙醇， 混匀 ； 将上步 中的溶液全部转移到UnLQ-10柱。

22、子中， 室温放置2min， 使溶液中的RNA尽可能的与柱子的滤 膜相结合， 8000rpm， 离心 1min ； 取出柱子弃去收集管中的废液， 将柱子放入收集管中并加 入 450lRPE Solution， 室温静置 2min， 10000rpm， 离心 30s， 并重复一次 ； 取出柱子， 弃去 废液， 12000rpm， 空离 3min ； 取出柱子， 放入经 DEPC 水处理过的 1.5ml 无菌离心管中， 于柱 内膜中央加入16l DEPC水， 5580放置2min ； 10000rpm， 离心1min， 收集管内溶液， 其 中含有所抽提的三种病毒的 RNA， 可立即使用或 -70贮存。

23、备用。 0073 在提取的三种病毒的 RNA 中分别加入反转录随机引物 (10pmol/l)， 4l dNTP(2.5mmol/L)， 70放置 5min， 冰浴 2min ； 加入 4l 反转录 Buffer， 2l 0.1M DTT， 1l Rnaseinfnibitor(40U/l)， 42放置 2min ； 加入 1lM-MLV 反转录酶 (200U/l)， 42作用 1h， 70放置 15min， 灭活反转录酶。将反转录后的 cDNA 于 -20贮存备用。 0074 1.2.6 质粒模板标准品的制备 0075 以提取的PCV2DNA和PRV DNA为模板， 用优化的条件扩增ORF2基。

24、因片段和gH基因 片段。在 50l 反应体系中依次加入 ： 10PCR 缓冲液 5l， MgCl2(3mmol/L)1.5l， dNTPs 浓度为 (10mmol/L)1.8l， Taq 酶 1U， 上、 下游引物 (50pmol/L) 各 0.5l， 模板 5l， 最后 用双蒸水补至 50l。将 EP 管置 PCR 仪， 按如下程序进行扩增 ： 95预变性 5min 后， 进人 循环 95 30s， 55 30s， 72 40s， 30 个循环后， 72延伸 10min ； 4结束反应。2.5琼脂 糖凝胶电泳。 0076 将扩增出目的片段按胶回收试剂盒回收， 按照载体连接试剂盒将目的片段与 。

25、pGEM-TEasy载体相连接， 转化DH5感受态细胞， 挑选白色菌落， 进行菌液PCR鉴定后， 用质 说 明 书 CN 102071256 B 6 5/8 页 7 粒提取试剂盒提取质粒DNA， 送大连宝生物工程有限公司进行测序。 经测序验证的阳性质粒 作为模板标准品， 并分别命名为 pGEM-PCV2 和 pGEM-gH。 0077 1.2.7 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应体系条件的优化 0078 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应体系如下 ： 0079 在 25l 体系中加入以下成份 ： 0080 SYBR Green I PreMix 13l 00。

26、81 P1/P3 0.5+0.5l 0082 P2/P4 0.5+0.5l 0083 DNA 1+1l 0084 ddH2O 8l 0085 25l 0086 瞬时离心后， 将 EP 管置于荧光定量 PCR 仪上 95预变性 5min ； 进入循环， 95 变性 15s， 55退火 20s， 72延伸 20s， 40 个循环 ； 反应结束后先加热至 95， 然后再降至 65， 开始以 0.5 /s 递增至 95检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。同时设立无模 板的阴性对照。本试验反应条件的优化是在两种病毒质粒模板等量的条件下进行的。 0087 1.2.7.1 引物浓度的优化 0088 分别以 。

27、50pmol/l 的引物浓度 0.2l、 0.3l、 0.4l、 0.5l、 0.6l、 0.7l、 0.8l、 0.9l进行SYBR Green I实时荧光PCR反应， 以选取扩增该病毒的最佳引物浓度。 添加时取相等体积的引物量。 0089 1.2.7.2 退火温度的优化 0090 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 分别以 52、 53、 54、 55、 56、 57、 58 的退火温度进行反应， 以确定最佳的退火温度。 0091 1.2.7.3SYBR PreMix 浓度的优化 0092 试验中荧光染料预混酶 SYBR PreMix 的浓度是 5U/l， 固定 SYBR G。

28、reen I 实时 荧光 PCR 反应体系的总体积， 通过改变荧光染料预混酶 SYBR PreMix 的添加量来筛选 SYBR Green I实时荧光PCR反应体系中SYBR PreMix的最佳浓度。 分别以10l、 12.5l、 15l、 17.5l、 20l、 22.5l 的浓度进行筛选。 0093 1.2.8 特异性检验 0094 按照 SYBR Green I 实时荧光反应体系， 分别加入 PCV2、 PRV 细胞毒 DNA 1l( 约 20ng)， 猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞毒 cDNA 1l( 约 20ng)， 猪流感病毒细胞毒 cDNA 1l( 约 20ng)， 猪细小病毒细胞毒。

29、 DNA 1l( 约 20ng)， 猪瘟病毒细胞毒 cDNA 1l( 约 20ng)， 同时设阴性对照， 验证其特异性。 0095 1.2.9 重复性检验 0096 选取 PCV2、 PRV 同一浓度的质粒标准品进行二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反 应重复性试验， 反应重复 3 次 ； 将不同浓度的质粒标准品进行二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应重复性试验， 反应重复 3 次 ； 通过每种病毒的 Tm 值和溶解曲线的分析， 验证 PCV2、 PRV 二重 SYBRGreen I 实时荧光 PCR 方法的稳定性。 0097 1.2.10 实时荧光 PCR 。

30、敏感性测定 0098 分别将 PCV2、 PRV 的重组质粒测 OD260值， 计算出每微升的拷贝数， 然后进行 10 倍 说 明 书 CN 102071256 B 7 6/8 页 8 梯度稀释， 以此作为模板进行二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应， 进而确定二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应检测每种病毒的敏感性。 0099 1.2.11 疑似 PCV2、 PRV 病料样品检测及与常规 PCR 检测方法的比较 0100 取采自河南省新乡、 周口等地市猪场的疑似 PCV2、 PRV 感染的病料进行二重 SYBRGreen I 实时荧光 PCR 和常规 PC。

31、R 检测， 以证实该方法的实用性。 0101 2 结果 0102 2.1 质粒 PCR 扩增 0103 如图 1， 图 2PCV20RF2 部分基因、 PRV gH 部分基因质粒 PCR 鉴定结果所示， 分别扩 增出了与预计大小相一致的 171bp 和 187bp 的片段。经鉴定得到产物与预期的条带一致。 测序与国内流行的毒株相比， 核苷酸同源性分别在 99.6、 99.8以上。 0104 测得提取的 PRV、 PCV2 质粒 DNA 浓度分别为 ： pGEM-gH 质量浓度 82.5g/ml， pGEM-PCV2 质量浓度 77.5g/ml， pGEM-gH 质粒浓度为 4.781013拷贝。

32、 /ml， pGEM-PCV2 质粒浓度为 4.531013拷贝 /ml 0105 2.2 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应条件的优化结果 0106 2.2.1 引物浓度优化结果 0107 PCV2、 PRV 引物均采用 50pmoL/l 0.5l 的量在 25l 体系中进行反应， 能够产 生特异性的单一峰值， 阴性对照无特异性峰值产生。PCV2、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧 光 PCR 反应的最佳引物浓度为 0.5l。 0108 2.2.2 退火温度优化结果 0109 PCV2、 PRV 在退火温度 55时， 均产生了特异性的峰值。PCV2Tm 值分。

33、别为 81.5， 81.5， 81.3； PRV Tm 值分别为 87.7， 87.7， 87.2。阴性对照均无特异性峰值产生。 PCV2、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应的最佳退火温度为 55。 0110 2.2.2SYBR Green I PreMix 浓度的优化结果 0111 PCV2、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应中 SYBR Green I PreMix 添加量 在 15l 时， 二者均可产生特异性的峰值， 阴性对照无特异性峰值产生。 0112 2.3 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应体系的确定 。

34、0113 通过各个反应条件的优化， 最终确定了 PPV、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应体系， 在 25l 体系中加入以下成份 ： 0114 SYBR Green I PreMix 15l 0115 P1/P3 0.5+0.5l 0116 P2/P4 0.5+0.5l 0117 DNA 1+1l 0118 ddH2O 6l 0119 25l 0120 该反应的循环参数最终确定为 ： 95预变性 5min ； 进入循环， 95变性 15s， 55 退火 20s， 72延伸 20s， 40 个循环 ； 反应结束后先加热至 95， 然后再降至 65， 开始以 0.5 。

35、/s 递增至 95检测荧光信号得出扩增产物的溶解曲线。同时设立无模板的阴性对 照。2.4 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 扩增产物的溶解曲线及 PCV2、 PRV Tm 值的确定 0121 本发明利用 Tm 值的不同进行核酸片段的区分， 核酸片段的 Tm 值主要与 GC 含量、 说 明 书 CN 102071256 B 8 7/8 页 9 序列长度和序列结构有关。 PRV的扩增片段基因序列GC含量比一般病毒高， 因此其Tm值最 高， 达到了 87左右， 很容易与其他病毒区分。PCV2 的 GC 含量相对较低， 况且 PRV 与 PCV2 扩增产物的长度不同， 所以 PRV、 。

36、PCV2 的 Tm 值可以很好的区分。 0122 按照 PCV2、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应条件， 以 PCV2、 PRV 的重组质 粒为模板， 进行 PCR 反应， 经软件 Rotor-gen6.0 分析后得到溶解曲线， 如图 3 所示， 从图中 可以看出2个特异性的峰值所对应的温度即为PCV2、 PRV的Tm值。 阴性对照则无峰值产生。 PRV 扩增片段的 Tm 值和 PCV2 扩增片段的 Tm 值并不是固定不变的， 它们的 Tm 值会在一定 的温度范围内变动， 我们总结了多次试验结果的数据发现， PRV 的 Tm 值变化范围为 85.7 87.2， 。

37、PCV2 的 Tm 值变化范围为 80.5 82.7， 两种病毒的平均 Tm 值相差 5.2， 最低 Tm 值与最高 Tm 值相差超过 6， 因此， 可以利用二者扩增产物片段 Tm 值的不同及溶解曲线 的两个特异性的峰进行诊断与鉴别区分。 0123 2.5 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 特异性检验结果 0124 从 PCV2、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 特异性试验结果如图 4 所示， 从图 中可以看出， 对照组中猪繁殖与呼吸综合征病毒、 猪瘟病毒、 猪流感病毒、 猪细小病毒及阴 性对照均无特异性峰值产生。只有试验组中的 PCV2、 PRV 二。

38、重荧光 PCR 产生了特异性的两 个峰值。PCV2Tm 值为 80.8， PRV Tm 值为 86.7。 0125 2.6 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 重复性试验结果 0126 2.6.1 同一浓度的 PCV2、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 重复性试验结果 0127 3 次重复性试验中， 各个病毒的 Tm 值都较为稳定。对照组中猪繁殖与呼吸综合征 病毒、 猪瘟病毒、 猪流感病毒、 猪细小病毒及阴性对照均无特异性峰值产生， 如表 1， 图 5 所 示。同浓度的 PCV2、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应具有很好的。

39、稳定性。 0128 表 1 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 的同一浓度重复性试验分析 0129 0130 2.6.2 不同浓度的 PCV2、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 重复性试验结果 0131 在不同浓度重复性试验中， 各个病毒的 Tm 值都较为稳定。对照组中猪繁殖与呼吸 综合征病毒、 猪瘟病毒、 猪流感病毒、 猪细小病毒及阴性对照均无特异性峰值产生， 如表 2， 图 6 所示。不同浓度的 PCV2、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 反应同样具有很好的稳 定性。 0132 表 2 二重 SYBR Green I 实时荧。

40、光 PCR 的不同浓度重复性试验分析 0133 说 明 书 CN 102071256 B 9 8/8 页 10 0134 2.7PCV2、 PRV 二重 SYBR Green I 实时荧光 PCR 敏感性试验验 0135 pGEM-gH 和 pGEM-PCV2 两种质粒的浓度分别为 82.5g/ml、 77.5g/ml ； 取等体 积的两种质粒混匀后， 进行10倍梯度稀释， 以此作为模板进行二重SYBR Green I实时荧光 PCR 反应。PCV2 重组质粒的敏感性可以达到 215 拷贝 /l， PRV 重组质粒的敏感性可以达 到 180 拷贝 /l。 0136 2.8 实时荧光 PCR 与。

41、常规 PCR 检测比较 0137 将疑似患 PCV2、 PRV 仔猪组织病料 30 头份， 阴性对照 2 头份提取 DNA 后， 分别进 行 PCR 和实时荧光 CR 检测， 在 30 份病料中， 常规 PCR 检出 11 份 PRV 阳性病料， 检出率为 36.7； 检出 16 份 PCV2 阳性病料， 检出率为 53.3； 二重实时荧光 PCR 同样能够检测出常 规 PCR 所检出的阳性病料， 二者符合率达 100 ； 二重实时荧光 PCR 中， PRV 检出 20 份阳性 病料， 检出率为 66.7， 比常规 PCR 的检出率高 30 ； PCV2 检出 26 份阳性病料， 检出率为 86.7， 比常规 PCR 的检出率高 33.4。实时荧光 PCR 检测灵敏度高于常规 PCR， 能检测出 常规 PCR 不能检测的病料， 而同样对于阴性样品均不能检测出。 说 明 书 CN 102071256 B 10 1/3 页 11 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102071256 B 11 2/3 页 12 图 5 图 6-A 图 6-B 说 明 书 附 图 CN 102071256 B 12 3/3 页 13 图 6-C 说 明 书 附 图 CN 102071256 B 13 。