技术领域
本发明属于PCR检测技术领域，尤其涉及一种鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检 测试剂盒。
背景技术
鸭坦布苏病毒(DuckTembusuVirus，DTMUV)最早发现于中国的福建、浙江、江苏等 东部沿海主要蛋鸭养殖区，是一种新兴的致病性黄病毒。DTMUV感染鸭后可导致蛋鸭产蛋 量严重下降，产蛋率可从90％下降至10％以内，甚至绝产；感染雏鸭后可导致雏鸭出现 站立不稳，倒地不起等神经症状，进而导致雏鸭淘汰率升高，严重的甚至高达80％，因此 给养鸭业带来了严重的经济损失。禽流感病毒(Avianinfluenzavirus，AIV)属于正黏病 毒科A型流感病毒属，AIV为单股负链RNA，由8个独立的RNA节段组成。AIV根据致病性 的不同，可分为高致病性禽流感病毒(HPAIV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)。HPAIV(如 H5亚型)通常可引起感染鸭群的突然死亡和大量死亡；H9亚型AIV虽属LPAIV，但它分布 广泛，能造成鸭的免疫抑制并引发与其他鸭病的混合感染，产蛋鸭感染后也可造成产蛋量 的明显下降，极大影响了蛋鸭的经济效益，因此它对养鸭业的危害也不可忽视。
上述疾病都是极大危害养鸭业经济效益的鸭病毒性传染病，目前，对这两类病毒传统 的检测方法主要有病毒分离、血清学试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等，但这些 方法存在耗时长、敏感性差、难标准化等局限性，尤其是当这两种病毒混合感染时，更增 加了临床诊断的难度。因此，开发一种快速检测DTMUV和AIV且能同时进行H9亚型AIV 分型检测的技术具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种敏感性高、特异性强、操作简便快速的鸭坦布苏 病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR 检测引物组，包括三对特异性引物，分别是引物1和2(检测DTMUV)、引物3和4(检测 AIV分型H9亚型)、引物5和6(检测AIV)，它们分别具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6 的碱基序列。
引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为0.5-1∶0.5-1∶1∶1∶ 1∶1。
引物1、引物2、引物3、引物4、引物5、引物6的摩尔比为1∶1∶1∶1∶1∶1。
上述鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测引物组在PCR扩增方面的应用，PCR扩 增的退火温度为50.0℃-60.1℃。
PCR扩增的退火温度为53.0℃。
鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒，包括引物组、PCR缓冲液和水；
引物组包括三对特异性引物，分别是引物1和2、引物3和4、引物5和6，它们分别 具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的碱基序列，其浓度均为25μmol/mL，在PCR反 应体系中的终浓度分别为0.8μmol/mL-1.2μmol/mL、0.1μmol/mL-0.5μmol/mL、0.1μ mol/mL-0.5μmol/mL；
PCR缓冲液为2×TaqPCRMix。
引物1和2、引物3和4、引物5和6在PCR反应体系中的终浓度分别为0.8μmol/mL、 0.2μmol/mL、0.4μmol/mL。
上述鸭坦布苏病毒和禽流感病毒多重PCR检测试剂盒在PCR扩增方面的应用，PCR扩 增的退火温度为50.0℃-60.1℃。
PCR扩增的退火温度为53.0℃。
针对目前缺乏对DTMUV、所有亚型AIV和H9亚型AIV同时进行检测和诊断的有效可 靠的技术，发明人结合多重PCR一管多检、高通量、低成本、高效率等优点，研究设计了 三对特异性引物，据此建立了鸭坦布苏病毒和所有亚型禽流感病毒并能进行H9亚型AIV 分型检测的多重PCR检测方法，并制备了相应的检测试剂盒。实验证明，应用本发明可检 测DTMUV和所有亚型AIV并能进行H9亚型AIV分型检测，具有操作简便、敏感性高、特 异性强等优点。本发明用于H9亚型禽流感病毒感染造成的免疫力减低导致的鸭坦布苏病 毒的混合感染的检测诊断，既可以节约时间的成本，又可以减少污染。
附图说明
图1是多重PCR的特异性试验结果电泳图，图中，M：100bpDNAladder；11：阴 性对照(ddH2O)；1：H9AIV的cDNA+鸭坦布苏病毒的cDNA(等体积混合)；2：H9AIV 的cDNA；3：鸭坦布苏病毒的cDNA；4：H5AIV的cDNA；5：番鸭呼肠孤病毒的cDNA； 6：番鸭细小病毒的DNA；7：鸭圆环病毒DNA；8：鸭副粘病毒的cDNA；9：鸭肝炎病毒的 cDNA；10：鸭瘟病毒的DNA。
图2是多重PCR的敏感性试验结果电泳图，图中，M：100bpDNAladder；1：450ng/μL DTMUV、760ng/μLH9、760ng/μLM基因的cDNA；2：45ng/μLDTMUV、76ng/μLH9、76ng/μLM 基因的cDNA；3：6.4.5ng/μLDTMUV、7.6ng/μLH9、7.6ng/μLM基因的cDNA；4：450pg/μL DTMUV、760pg/μLH9、760pg/μLM基因的cDNA；5：45pg/μLDTMUV、76pg/μLH9、76pg/μLM 基因的cDNA；6：4.5pg/μLDTMUV、7.6pg/μLH9、7.6pg/μLM基因的cDNA。
图3是应用本发明多重PCR的部分临床样品检测结果电泳图，图中，M为100bpDNA ladder；1为阳性对照(H9亚型禽流感病毒cDNA+鸭坦布苏病毒cDNA)；2-17为实验室采集 的鸭病料。
具体实施方式
以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等， 如无特殊说明，均可从商业途径得到。具体所用材料和试剂如下：
鸭坦布苏病毒记载在“鸭坦布苏病毒与鸭瘟病毒二重RT-PCR检测方法的建立”，南方 农业学报，2014，45(2)：314-317，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸭瘟病毒AV1221购自中国兽医药品监察所；
鸭肝炎病毒AV2111株(以下简称为DHVI)购自中国兽医药品监察所；
番鸭细小病毒记载在“广西番鸭细小病毒的分离和鉴定”，广西畜牧兽医，2002， 18(6):5-7，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸭圆环病毒记载在“广西部分地区鸭圆环病毒感染情况调查”，中国畜牧兽医，2010， 37(11):156-158，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
鸭副粘病毒(鸭新城疫)记载在“鸭新城疫病毒和鸭圆环病毒二重PCR检测方法的建 立”，中国动物检疫，2012，29(5)：34-37，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
番鸭呼肠孤病毒记载在“番鸭花肝病病原的研究”，中国兽医科技，2003,5(33)： 7-8，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H5亚型禽流感病毒记载在“H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立”， 南方农业学报，2013,02:323-327，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得；
H9亚型禽流感病毒记载在“多重反转录聚合酶链反应快速检测鉴别H9亚型禽流感病 毒方法的建立”，中国人兽共患病学报，2006，(09):858-860，公众可从广西壮族自治区 兽医研究所获得；
100bpMarkerladder、2×TaqPCRMix(AS111-12)、DNA/RNA提取试剂盒、反转录试 剂均购自北京全式金生物技术有限公司。
实施例1、引物的设计与合成
根据GenBank中H9AIV的HA基因、AIV的M基因与DTMUV的NS2基因的保守序列， 采用DNAStar软件进行多序列比对，在保守区用primer5.0设计引物。引物由北京六合 华大基因科技股份有限公司合成。(表1)。
表1引物信息
实施例2、多重PCR检测
一、核酸的提取及RNA的反转录
参照DNA/RNA提取试剂盒说明书，提取番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭瘟病毒DNA， 同时对H5、H9、鸭副粘病毒、鸭肝炎病毒、番鸭呼肠孤病毒和DTMUV的RNA进行抽提，并 按反转录说明书将RNA反转录成cDNA，具体如下：采用10μL体系，于EP管中依次加 入2μL5×反转录缓冲液、10mmol/LdNTP1μL、5U/μLAMV0.5μL、20U/μLRNA 酶抑制剂0.5μL、自由引物0.5μL、待检总RNA模板2μL，用无RNA酶的灭菌水补 足体积为10μL，瞬离后置PCR仪中，42℃1h、85℃5min，制备的cDNA置-30℃保存 备用。
二、多重PCR扩增体系的建立
总反应体积为50μL，其中2×PCRMasterMix25μL，H9亚型AIVcDNA和DTMUV cDNA共20μL作为混合模板，引物H9-F、H9-R、DTMUV-F、DTMUV-R、AIVM-F、AIVM-R 适量，最后用双蒸水补至50μL。对多重PCR的各引物浓度及PCR反应的各参数(温度、 时间)进行优化，以筛选出二重PCR反应体系中最佳的反应模式。
对H9亚型禽流感病毒引物、鸭坦布苏病毒引物、模板等用量进行优化，最终确定多 重PCR反应体系为50μL：2×PCRMasterMix(北京全式金，AS111-12)25μL、H9AIV上 下游引物各0.4μL(引物浓度均为25μmol/mL，在反应体系中的终浓度均为0.2μmol/mL)、 DTMUV上下游引物各1.6μL(引物浓度均为25μmol/mL，在反应体系中的终浓度均为0.8 μmol/mL)、AIVM上下游引物各0.8μL(引物浓度均为25μmol/mL，在反应体系中的终 浓度均为0.4μmol/mL)，模板各10μL，加水至50μL。
按照上述反应体系，模板为鸭坦布苏病毒和H9亚型禽流感病毒的cDNA等体积混合物， 将退火温度按50.0℃-60.1℃依次递增，多次重复试验后确定最佳退火温度。最终确定最 佳的反应条件：94℃3min；94℃30s；53℃30s；72℃30s，35个循环；72℃10min。 三、多重PCR特异性试验
按照上述优化的PCR反应体系和优化的反应条件进行多重PCR扩增，不同的模板分别 如下：H9AIV的cDNA+鸭坦布苏病毒的cDNA(等体积混合)、提取番鸭细小病毒、鸭圆环 病毒、鸭瘟病毒和鸭减蛋综合症病毒的DNA，H5、H9、鸭副粘病毒、鸭肝炎病毒和TMUV的 cDNA。结果如图1所示，1-4有285bp、366bp和564bp的目的片段，其余均没有目的 片段。说明，本发明的引物和方法有高特异性。
因此，上述引物和方法可应用于鉴定未知样本是否感染禽流感病毒和鸭坦布苏病毒并 能进行H9亚型AIV分型检测：
若得到285bp和564bp的片段，则样本中含有H9亚型禽流感病毒，反之则没有；
若得到285bp的片段，则样本中含有禽流感病毒，反之则没有；
若得到366bp的片段，则样本中含有鸭坦布苏病毒，反之则没有；
若得到285bp和366bp的片段，则样本中含有禽流感病毒和鸭坦布苏病毒，反之则没 有；
若得到285bp、366bp和564bp的片段，则样本中含有H9亚型禽流感病毒和鸭坦布苏 病毒，反之则没有。
四、多重PCR的敏感性试验
用ThermoScientificNanoDrop2000超微量分光光度计测得H9亚型禽流感病毒和 鸭坦布苏病毒的核酸浓度分别为760ng/μL和450ng/μL，将二者分别进行10倍梯度稀 释后等体积混合作为模板，按照前述二优化的PCR反应体系和优化的反应条件进行多重PCR 扩增，结果如图2所示，1-6均有目的片段扩出，因此建立的多重PCR方法对H9亚型禽 流感病毒的核酸最低检出限为7.6pg；对所有亚型禽流感病毒最低检出限为76pg，对鸭坦 布苏病毒的核酸最低检出限为45pg。
实施例3、检测试剂盒的组装
根据实施例1和2的研究结果，组装检测试剂盒以方便使用。
试剂盒包括引物组、PCR缓冲液和水；引物组包括三对特异性引物，分别是引物1和 2、引物3和4、引物5和6，其浓度均为25μmol/mL(在PCR反应体系中的终浓度分别为 0.8μmol/mL、0.2μmol/mL、0.4μmol/mL)；PCR缓冲液为2×TaqPCRMix。
PCR检测中的其他试液可现场配置或直接使用商品化试剂。
实施例4、多重PCR检测临床样本
取实验室采集的156份鸭病料，提取鸭病料的RNA，并将RNA反转录得到cDNA。分别 将得到的cDNA作为模板，使用实施例3的试剂盒，按照实施例2优化的PCR反应体系和 优化的反应条件进行多重PCR扩增。部分检测结果如图3所示，4有366bp目的片段，9 有285bp和366bp目的片段，11、16有564bp目的片段，其余均无其他目的片段。156份 鸭病料中检出5份鸭坦布苏病毒，含有鸭坦布苏病毒病毒的感染率为3.2％(5/156)，156 份鸭病料中检出3份禽流感病毒和鸭坦布苏病毒混合感染，含有禽流感病毒和鸭坦布苏病 毒病毒的感染率为1.9％(3/156)，156份鸭病料中检出7份H9亚型禽流感病毒,含有H9 亚型禽流感病毒的感染率为5.4％(7/156)。