技术领域
本发明涉及抑制粘着斑激酶（FAK）（也称为酪氨酸蛋白激酶2 （PTK2），和VEGFR3）的2,4,5-取代的嘧啶并且涉及含有此类化合物的 药物组合物。本发明还涉及使用此类化合物用于预防和/或治疗增生性疾病 （如癌症）的方法。
背景技术
定向细胞迁移在许多生理和病理过程（包括胚胎发育、伤口愈合、血 管生成、肿瘤侵入和转移）中是很重要的。刺激细胞定向移动的细胞外信 号转导可以通过许多方法来诱发，包括结合至细胞外基质蛋白的跨膜整联 蛋白和生长因子（例如EGF、IGF和VEGF）对其同源受体的胞外结构域 的作用。
FAK是介导来自跨膜整联蛋白和生长因子受体两者的信号的非受体 酪氨酸激酶。已经报道，FAK在协调这些不同的细胞外信号、以通过它们 的外部环境定向移动细胞的方式来整合它们中发挥核心作用(Tomarand Schlaepfer.CurrentOpinioninCellBiology:2009,21,676-683)。
整联蛋白聚集或生长因子受体(例如EGFR、IGF-1R、Her2和VEGFR) 的活化在Y397促进FAK自磷酸化。然后磷酸化的Y397FAK结合至c-Src (本文称为Src)并且在Y576和Y577发生Src介导的FAK磷酸化以产生活 性FAK-Src复合物。然后活性FAK-Src通过许多生化途径促进发信号，这 对以下过程有影响：如细胞粘附、迁移、侵入，细胞存活、增殖，获得化 疗耐受性和转移等(BruntonandFrame.CurrentOpinioninPharmacology: 2008,8,437-432andChatzizachariasetal.ExpertOpinioninTherapeutic Targets:2007,11(10),1315-1328)。
细胞粘附
解决FAK在细胞粘附中的作用的功能性研究表明其有助于粘着斑装 配(RichardsonandParsons.Nature:1996,380,538-540)和粘着斑翻转（focal adhesionturnover）(Finchametal.Oncogene:1995,10(11),2247-2252)。在 人类和小鼠细胞系中通过RNAi抑制FAK（导致了降低的FAK蛋白水平） 在体外已经证明降低了细胞对纤连蛋白/层粘连蛋白涂覆的孔板的粘附力 (Tsutsumietal.InternationalJournalofOncology:2008,33(1),215-224)。
细胞迁移
有较强的证据表明FAK是细胞迁移的关键调节因子(Angelucciand Bologna.CurrentPharmaceuticalDesign:2007,13,2129-2145和Mitraetal. NatureReviewsMolecularCellBiology:2005,6,56-68)。源自FAK-/-小鼠胚 胎的细胞由于受损的粘附翻转显示出降低的迁移(etal.Nature:1995, 377,539-544)。此外，从粘着斑移位FAK降低了细胞迁移(Gilmoreand Romer.MolecularBiologyoftheCell:1996,7(8),1209-1224)，而在CHO细 胞中的过表达刺激迁移(Caryetal.JournalofCellScience:1996,7, 1787-1794)。另外，在人类和小鼠细胞系中通过RNAi抑制FAK（导致降 低的FAK蛋白水平）在体外趋触性迁移测定中已经显示降低了细胞迁移 (Tsutsumietal.InternationalJournalofOncology:2008,33(1),215-224)。
细胞侵入
已经证明FAK活化增强了基质降解侵入行为。FAK-Src通过细胞凋 亡易感性蛋白(CAS)发信号(Liaoetal.JournalofExperimentalandClinical CancerResearch:2008,27:15)引起表达基质金属蛋白酶(MMP)，包括 MMP2和MMP9。FAK-Src活化也通过磷酸化endophilinA2来促进细胞表 面表达MMP14。然后MMP14通过切割pro-MMP2将MMP2活化成其活 性形式(SiesserandHanks.ClinicalCancerResearch:2006,12(11), 3233-3237)。高度侵袭性的癌细胞形成称为侵袭伪足(invadopodia)的特化的 富含肌动蛋白的细胞外基质降解膜突出物，其富含基质降解蛋白酶如 MMP。已经证明FAK和Src两者都有助于侵袭伪足的形成(Chanetal. JournalofChemicalBiology:2009,185(2),357-370)。
细胞存活
已经证明FAK在细胞存活中起重要作用。已经证明FAK的活化会抑 制失巢凋亡(对不适当的细胞外基质环境做出应答的凋亡)(Frischetal JournalofCellBiology.1996,134(3),793-799和XuetalCellGrowthand Differentiation.1996,7(4),413-418)。研究表明FAK在成纤维细胞和上皮细 胞中激活多个下游通路以抑制失巢凋亡(Zouqetal.JournalofCellScience: 2008,122,357-367)。在人类肠隐窝细胞中，通过FAK与β1整联蛋白的结 合发信号，并且随后结合Src通过PI3-K/Akt-1信号传导上调抗-凋亡蛋白 Bcl-XL和Mcl-1的表达。PI3-K/Akt-1信号传导还下调促凋亡激活剂Bax 和Bak的表达，引起促凋亡增敏剂Bad的磷酸化并拮抗p38β的活化。 FAK/Src的分离导致持续的/增强的p38β活化，该p38β是凋亡/失巢凋亡 驱动剂(Bouchardetal.Apoptosis:2008,13,531-542)。
细胞增殖
降低FAK或β1整联蛋白的表达并因此破坏β1-FAK信号轴导致降低 了分布于肺中的微转移细胞的初始增殖。使用3D培养的D2细胞观察到 在FAKY397和Y861的磷酸化与增殖能力之间具有较强相关性(Shibue andWeinberg.PNAS2009,106(25),10290-10295)。已经证明转染以过表达 FAK的HL-60细胞翻倍的速率比对照HL-60细胞快1.5倍。研究发现在过 表达FAK的细胞中，细胞周期蛋白D3表达和CDK活性的显著诱导。活 化PI3-K/Akt-1信号传导(在许多研究中与FAK活化有关的过程)被确定为 细胞周期蛋白表达/活化的一种可能原因(Yamamotoetal.CellularSignaling: 2003,15.575-583)。
获得化疗耐受性
使顺铂敏感性卵巢癌细胞系OAW42暴露于顺铂治疗和随后恢复的 重复循环，导致了化学耐受性OAW42-R细胞的形成。旨在确定该化学耐 受性的原因的研究发现，FAK在敏感性和化学耐受性细胞两者中具有构成 性活性(constituentlyactive)。然而，通过用顺铂治疗在OAW42细胞中诱导 了Y397FAK磷酸化的抑制，但在OAW42-R细胞中则没有(Poulain及其 同事.Gynaecologiconcology:2006,101,507-519)。还在体外和在体内使用 FAK抑制剂TAE226（单独地以及与多西紫杉醇联用），在紫杉烷敏感性 (SKOV3ip1和HeyA8)及紫杉烷耐受性(HeyA8-MDR)卵巢癌细胞系中研究 了FAK抑制对化学耐受性的影响。TAE226具有如下结构：
并且在WO2004/080980和WO2005/016894中进行描述。在体外，TAE226 在Y397和Y861位点抑制了FAK的磷酸化，以时间和剂量依赖方式抑制 细胞生长，并且分别在紫杉烷敏感型和紫杉烷耐受型细胞系中将多西紫杉 醇介导的生长抑制增强了10-倍和20-倍。在体内，与载体治疗的对照相比， 通过TAE226对FAK抑制显著地降低了HeyA8、SKOV3ip1和HeyA8-MDR 模型中的肿瘤负荷(46-64%)。然而，在所有三个模型中通过伴随给予 TAE226和多西紫杉醇，观察到了最大疗效(降低85-97%)。另外，TAE226 与多西紫杉醇的联用显著地延长了荷瘤小鼠的生存期(Halderetal.Cancer Res:2007,67(22),10976-10983)。
转移潜能
几项研究已经研究了动物模型中FAK蛋白水平的作用及其与肿瘤进 展的关系。在小鼠皮肤癌形成模型中，与FAK+/+野生型对照小鼠相比， 使用FAK+/-小鼠，降低了与减少的乳头瘤形成相关的FAK蛋白表达(46%) (McLeanetal.CancerResearch:2001,61,8385-8389)。使用人乳腺癌细胞， 研究人员发现在正位移植入裸鼠体内后，FAKsiRNA处理过的细胞被抑制 向肺部转移(Benlimameetal.JournalofCellBiology:2005,171,505-516)。 使用短发夹RNA(shRNA)针对4T1小鼠乳腺癌细胞中FAK的类似实验， 在正位移植入乳腺垫后，抑制了向肺部的转移(Mitraetal.Oncogene:2006, 25,4429-4440)。在4T1小鼠乳腺癌细胞中通过显性阴性表达抑制FAK， 在小鼠中降低了肿瘤的生长和血管生成(Mitraetal.Oncogene:2006,25, 5969-5984)。在乳腺癌的转基因模型的乳腺上皮细胞中使用Cre/loxP重组 系统来破坏FAK功能，证明FAK表达对于恶变前增生转变成癌症以及它 们随后的转移是需要的。所观察到的肿瘤发展的降低进一步与受损的乳腺 上皮细胞增殖相关，表明FAK在乳腺肿瘤发展中起着关键作用(Lahlouetal. PNASUSA:2007,104(51),20302-20307)。
根据上述观察，已经在许多人类癌症中报道FAKmRNA和/或蛋白的 过表达，包括结肠直肠癌(deHeer.EuropeanJournalofSurgicalOncology: 2008,34(11),1253-1261)、前列腺癌(Tremblay,L.,W.Hauck,etal. InternationalJournalofCancer:1996,68(2),164-171)、乳腺癌(Watermannet al.BritishJournalofCancer2005,93(6),694-698)和黑色素瘤(Hessetal. CancerResearch:2005,65(21),9851-60)。另外，FAK过表达经常与这些癌 症的更高侵入性的表型相关。
因此，有较强的证据表明，FAK抑制剂可以用于降低细胞粘附、细 胞迁移、细胞侵入、细胞增殖和化学耐受性。此外，FAK抑制剂可以适用 于诱导在不合适的细胞外基质环境中的细胞凋亡以及降低血管生成。
应当理解的是，其他酪氨酸激酶和丝氨酸/苏氨酸激酶的活性与FAK 活性相结合可以有利于治疗增生性疾病，如癌症。
例如，在黑素瘤患者中（在局部淋巴结中具有转移酶）过度表达血管 内皮生长因子受体VEGFR3(Flt4)(Mouawadetal.EuropeanJournalof Cancer:2009,45,1407-1414)。在许多人类癌症中还观测到内源性受体酪氨 酸激酶配体的异常表达水平。例如，在早期侵入性宫颈癌中，血管内皮生 长因子C和D(VEGF-C和VEGF-D)、VEGFR3配体，的表达水平显著地 与淋巴转移和淋巴管侵入相关(JournalofExperimental&ClinicalCancer Research2009,28)。
因此，选择性地抑制FAK和VEGFR3的化合物可以用来治疗增生性 疾病，如癌症。
经报道用于抑制FAK的两种化合物是PF-562,271和PF-573,228。
WO2004/056786、WO2004/056807、WO2005/023780、WO2007/063384 和Robertsetal.CancerRes2008,68(6),1935-1944中描述了PF-562,271。
Slack-Davisetal.J.Biol.Chem.2007,282(20),14845-14852中描述了 PF-573,228。
除了这些具体描述的化合物之外，在WO2008/129380、 WO2008/115369、WO2009/105498、US2010/113475、WO2009/143389、 WO2009/071535、WO2010/055117、WO2010/058030、WO2010/058032、 WO2007/140222和WO2009/024332中公开了其他类别的FAK抑制剂。
发明内容
本发明人已经发现特定类别的化合物，其可有效地作为FAK抑制剂， 并且还抑制VEGFR3。这些化合物可以显示FAK对激酶如VEGFR1、 IGF-1R(胰岛素样生长因子1受体)、IR(胰岛素受体)和CDK(细胞周期蛋白 依赖性激酶)的选择性。另外，本发明的化合物可以具有针对抑制细胞色 素p450酶，特别是2C9和3A4同种型，的增强选择性。此外，本发明的 化合物可以较少倾向于和谷胱甘肽形成加合物。
在第一方面,本发明提供了下式(I)的化合物：
其中：
R1选自：H和
其中：
RN1选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN2选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN3选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN4选自H和CH3；
RN7和RN8独立地选自H和CH3；
RN9选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN10选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN11选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
R2选自H和
其中：
RN5选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN6选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
以及其中R1和R2中仅一个是H；
或R1和R2一超形成基团–CH2-N(RN12)-C2H4-，其中RN12选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
R4选自CF3、卤素、CF2H和CN；以及
R5选自下式的组：
其中：
R6选自H、(CHRC1)n1C(O)N(RN13)Z1和(CH2)n2C(O)OZ2，其中：
n1是1；
RC1是H或Me；
RN13是H或CH3；
Z1是H、CH3或OCH3；
n2是1；以及
Z2是CH3；
并且其中RN13和Z1中仅一个可以是CH3；
R7，如果存在的话，选自H、和(CH2)m1C(O)N(RM1)Y1，其中：
m1是0或1；
RM1是H；以及
Y1是H、Me或OCH3；
其中当R6和R7均存在时，一个是H而另一个则不是H，并且其中仅 R6存在时，则它不是H；以及
R8，如果存在的话，是H，或，当R7是C(=O)NH2时，R8，如果存 在的话，选自H和C1-2烷基。
本发明的第二方面提供包含第一方面的化合物和药学上可接受的载 体或稀释剂的组合物。
本发明的第三方面提供第一方面的化合物用于治疗方法中。
本发明的第四方面提供第一方面的化合物在制备用于治疗通过抑制 FAK和VEGFR3而改善的疾病的药物中的用途。本发明的第四方面还提 供第一方面的化合物在治疗通过抑制FAKVEGFR3而改善的疾病的方法 中的用途。
本发明的另一方面提供如本文所述的活性化合物(优选为药物组合物 的形式)在人类或动物体的治疗方法中的用途。
本发明的另一方面提供在体外或在体内抑制FAK和VEGFR3的方 法，包括使细胞与有效量的如本文所述的活性化合物接触。
在下面将更详细地讨论每个基团R1～R8。
R1
R1可以具有以下结构之一：
当R1是H时，R2(下面讨论的)不是H。
RN1、RN2和RN3各自独立地选自H、C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1- 基和丙-2-基)和C(=O)Me以及RN4选自H或甲基。RN7是H或甲基。RN7和RN8独立地选自H和CH3。RN9、RN10和RN11也各自独立地选自H、C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2-基)和C(=O)Me。
R2
R2可以具有以下结构之一：
当R2是H时，R1(上面所讨论的)不是H。
RN5和RN6独立地选自H、C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2- 基)和C(=O)Me。
R1和R2
当R1和R2一超形成基团-CH2-N(RN12)-C2H4-时，
RN12选自H、C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2-基)和C(=O)Me。
R4
R4选自CF3、卤素基团(即F、Cl、Br、I)、CF2H和CN。
在一些实施方式中，卤素基团是Cl或Br。
R5
R5选自下式的组：
R6
R6选自H、(CHRC1)n1C(O)N(RN13)Z1和(CH2)n2C(O)OZ2；其中：
n1是1；
RC1是H或Me；
RN13是H或CH3；
Z1是H、CH3或OCH3；
n2是1；以及
Z2是CH3；
其中RN13和Z1中仅一个可以是CH3。
当R6是H时，R7(下面讨论的)不是H。
如果R6是(CHRC1)n1C(O)N(RN6)Z1，则它可以选自：CH2C(O)NH2、 CH2C(O)NHCH3、CH2C(O)NHOCH3、CH2C(O)NCH3OCH3、 CHCH3C(O)NH2、CHCH3C(O)NHCH3、CHCH3C(O)NHOCH3、和 CHCH3C(O)NCH3OCH3。
如果R6是(CH2)n2C(O)OZ2，则它是CH2C(O)OCH3。
R7
R7选自H、和(CH2)m1C(O)N(RM1)Y1，其中：
m1是0或1；
RM1是H；以及
Y1是H、Me或OCH3；
当R7是H时，R6(上面所讨论的)不是H。另外，当R7不存在时，R6(上 面所讨论的)不是H。
当R7是(CH2)m1C(O)N(RM1)Y1时，它可以选自C(O)NH2、C(O)NHCH3、 C(O)NHOCH3、CH2C(O)NH2、CH2C(O)NHCH3和CH2C(O)NHOCH3。
R8
R8是H，除了当R7是C(=O)NH2时，它可以可替代地是C1-2烷基， 即甲基或乙基。
包括其他形式
包括在上述中的是这些取代基的众所周知的离子、盐、溶剂化物和保 护的形式。例如，提及羧酸(-COOH)，还包括其阴离子(羧酸根)形式 (-COO-)、盐或溶剂化物以及常规的保护形式。类似地，提及氨基，包括 氨基的质子形式(-N+HR1R2)、盐或溶剂化物(例如，盐酸盐)以及氨基的常 规保护形式。类似地，提及羟基，还包括其阴离子形式(-O-)、盐或溶剂化 物，以及羟基的常规保护形式。
异构体、盐、溶剂化物、保护形式、和药物前体(前药，prodrug)
某些化合物能够以一种或多种特定的几何、光学、对映异构体、非对 映异构体、差向异构体、立体异构体、互变异构体、构象异构体或端基异 构体的形式存在，包括但不限于顺式-（cis-）和反式-（trans-）形式；E- 和Z-形式；c-、t-、和r-形式；内-和外-形式；R-、S-和内消旋-形式；D- 和L-形式；d-和l-形式；(+)和(-)形式；酮-、烯醇-、和烯醇化物-形式；顺 式-（syn-）和反式-（anti-）形式；向斜-和背斜-形式；α-和β-形式；轴向 和赤道形式（equatorialform）；船式-、椅式-、螺旋式-、信封式-和半椅式 -形式；及它们的组合，下文中统称为“异构体”(或“异构体形式”)。
需注意的是，除了如下面所讨论的互变异构形式之外，结构异构体(或 构造异构体)(即不同之处是原子之间的连接，而不仅仅是原子的空间位置 的异构体)明确地排除在如本文中所用的术语“异构体”之外。例如，提 及甲氧基-OCH3，不应被解释为提及其结构异构体羟甲基-CH2OH。类似地， 提及邻-氯苯基不应被解释为提及其结构异构体间-氯苯基。但是，提及一 类结构，可以良好地包括落在该类范围内的结构异构体形式(例如，C1-7烷 基，包括正丙基和异丙基；丁基包括正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基； 甲氧基苯基包括邻-、间-和对-甲氧基苯基)。
上述排除不涉及互变异构体，例如酮-、烯醇-、和烯醇化物形式，例 如在下面的互变异构体对中：酮/烯醇(如下所示)、亚胺/烯胺、酰胺/亚氨 基醇、脒/脒、亚硝基/肟、硫酮/烯硫醇、N-亚硝基/羟基偶氮、和硝基/酸 式-硝基。
需要注意的是，具体地包括在术语“异构体”中的是具有一个或多个 同位素取代的化合物。例如，H可以是任何同位素形式，包括1H、2H(D) 和3H(T)；C可以为任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可以为任 何同位素形式，包括16O和18O；等等。
除非另作说明，提及特定的化合物，包括所有此类异构体形式，包括 (全部地或部分地)其外消旋体和其他混合物。此类异构体形式的制备(例如 不对称合成)和分离(例如分步结晶和色谱方法)的方法为本领域所公知或 者通过适应本文所传授的方法、或公知的方法以公知的方式容易获得。
除非另作说明，提及特定的化合物还包括其离子、盐、溶剂化物和保 护形式，例如，如下所讨论。
可以方便地或希望地制备、纯化、和/或处理所述活性化合物的相应 盐，例如，药学上可接受的盐。药学上可接受的盐的例子在Bergeetal.J. Pharm.Sci.,66,1-19(1977)中进行讨论。
例如，如果该化合物是阴离子型或具有可以变成阴离子的官能团(例 如-COOH可以变成-COO-)，那么可以与适合的阳离子形成盐。合适的无 机阳离子的例子包括，但不限于，碱金属离子(例如Na+和K+)、碱土金属 阳离子(例如Ca2+和Mg2+)和其他阳离子(例如Al3+)。合适的有机阳离子的 例子包括，但不限于，铵离子(即NH4+)和取代的铵离子(例如NH3R+、 NH2R2+、NHR3+、NR4+)。一些合适的取代铵离子的例子是源于以下的那 些：乙胺、二乙胺、二环己基胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙 醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄基胺、胆碱、葡甲胺和缓血酸胺，以及氨基酸， 如赖氨酸和精氨酸。常见的季铵离子的例子是N(CH3)4+。
如果该化合物是阳离子型或者具有可以变成阳离子的官能团(例 如-NH2可以变成-NH3+)，那么可以与合适的阴离子形成盐。合适的无机阴 离子的例子包括，但不限于，源于以下无机酸的那些：盐酸、氢溴酸、氢 碘酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、亚硝酸、磷酸和亚磷酸。合适的有机阴离子 的例子包括，但不限于，源于以下有机酸的那些：乙酸、丙酸、琥珀酸、 乙醇酸、硬脂酸、棕榈酸、乳酸、苹果酸、双羟萘酸、酒石酸、柠檬酸、 葡糖酸、抗坏血酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、天冬氨酸、 苯甲酸、肉桂酸、丙酮酸、水杨酸、对氨基苯磺酸（磺胺酸）、2-乙酰氧 基苯甲酸、富马酸、苯基磺酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙磺酸、乙烷二磺酸、 草酸、泛酸、羟乙磺酸、戊酸、乳糖酸和葡糖酸。合适的聚合物阴离子的 例子包括，但不限于，源于以下聚合酸的那些：鞣酸、羧甲基纤维素。
可方便地或希望地制备、纯化和/或处理活性化合物的相应溶剂化物。 本文中使用术语“溶剂化物”在普通含义上是指溶质(例如活性化合物， 活性化合物的盐)与溶剂的复合物。如果溶剂是水，所述溶剂化物可以方 便地称为水合物，例如一水合物、二水合物、三水合物等等。
可以方便地或希望地制备、纯化和/或处理化学保护形式的活性化合 物。如本文所使用的术语“化学保护形式”涉及其中一个或多个反应性官 能团被保护以防止不希望的化学反应的化合物，即处于被保护基团或保护 基团的形式(也称为被屏蔽基团或屏蔽基团、或被封闭基团或封闭基团)。 通过保护反应性官能团，能够进行涉及其他未保护的反应性官能团的反 应，而不影响被保护基团；通常可以在后续步骤中去除所述保护基团，而 基本不影响分子中的其余部分。参见，例如，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis（有机合成中的保护基）(T.GreenandP.Wuts,Wiley,1999)。
例如，羟基可以作为醚(-OR)或酯(-OC(=O)R)而被保护，例如作为： 叔丁基醚；苄基、二苯甲基(二苯基甲基)或三苯甲基(三苯基甲基)醚；三 甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基醚；或乙酰酯(-OC(=O)CH3,-OAc)。
例如，醛或酮基团分别可以作为缩醛或缩酮而被保护，其中通过与例 如伯醇反应将羰基(>C=O)转化为二醚(>C(OR)2)。在酸存在下，使用大量 过量的水，可以容易地通过水解再生醛或酮基团。
例如，胺基可以例如作为酰胺或尿烷而被保护，例如作为：甲基酰胺 (-NHCO-CH3)；苄氧基酰胺(-NHCO-OCH2C6H5，-NH-Cbz)；作为叔丁氧酰 胺(-NHCO-OC(CH3)3，-NH-Boc)；2-联苯基-2-丙氧基酰胺 (-NHCO-OC(CH3)2C6H4C6H5，-NH-Bpoc)，作为9-芴基甲氧基酰胺 (-NH-Fmoc)，作为6-硝基藜芦基氧基酰胺(-NH-Nvoc)，作为2-三甲基甲硅 烷基乙氧基酰胺(-NH-Teoc)，作为2,2,2-三氯乙氧基酰胺(-NH-Troc)，作为 烯丙氧基酰胺(-NH-Alloc)，作为2(-苯基磺酰基)乙氧基酰胺(-NH-Psec)； 或在合适的情况下，作为N-氧化物(>NO·)。
例如，羧酸基团可以作为酯而被保护，例如作为：C1-7烷基酯(例如， 甲酯；叔丁基酯)；C1-7卤代烷基酯(例如，C1-7三卤代烷基酯)；三C1-7烷 基甲硅烷基-C1-7烷基酯；或C5-20芳基-C1-7烷基酯(例如，苄基酯；硝基苄 基酯)；或作为酰胺，例如，作为甲酰胺。
例如，硫醇基可以作为硫醚(-SR)而被保护，例如作为：苄基硫醚； 乙酰氨基甲基醚(-S-CH2NHC(=O)CH3)。
可以方便地或希望地制备、纯化和/或处理药物前体形式的活性化合 物。如本文中所使用的术语“药物前体”涉及当代谢(例如在体内)时产生 希望的活性化合物的化合物。典型地，所述药物前体是非活性的或与所述 活性化合物相比具有更低活性，但可提供有利的处理、给药或代谢特性。 例如，一些药物前体是活性化合物的酯(例如，生理上可接受的代谢不稳 定的酯)。在代谢过程中，酯基团(-C(=O)OR)被切割以产生活性药物。通 过酯化例如母体化合物中的任一羧酸基团(-C(=O)OH)来形成此类酯，在适 当时，提前保护了母体化合物中存在的任何其他反应性基团，然后如果需 要的话进行脱保护。此类代谢不稳定酯的例子包括以下那些，其中R为 C1-7烷基(例如-Me、-Et)；C1-7氨基烷基(例如氨乙基；2-(N,N-二乙基氨基) 乙基；2-(4-吗啉代)乙基)；和酰氧基-C1-7烷基(例如酰氧基甲基；酰氧基乙 基；例如新戊酰氧基甲基；乙酰氧基甲基；1-乙酰氧基乙基；1-(1-甲氧基 -1-甲基)乙基-羰氧基乙基；1-(苯酰氧基)乙基；异丙氧基-羰氧基甲基；1- 异丙氧基-羰氧基乙基；环己基-羰氧基甲基；1-环己基-羰氧基乙基；环己 氧基-羰氧基甲基；1-环己氧基-羰氧基乙基；(4-四氢吡喃氧基)羰氧基甲 基；1-(4-四氢吡喃氧基)羰氧基乙基；(4-四氢吡喃基)羰氧基甲基；和1-(4- 四氢吡喃基)羰氧基乙基)。
此外，一些药物前体被酶活化以产生活性化合物或者以下的化合物， 该化合物在经过进一步的化学反应后产生活性化合物。例如，所述药物前 体可以为糖衍生物或其他糖苷偶联物，或者可以为氨基酸酯衍生物。
选择性
所述化合物抑制FAK和VEGFR3对其他激酶如IGF-1R、IR和CDK 的选择性可以通过生化测定结果来证明(参见，例如，以下描述的FAK激 酶测定和VEGFR3测定)。本发明的化合物还可以具有针对VEGFR1和/ 或VEGFR2的选择性。
可以使用标准抑制测定来确定所述化合物针对FAK对细胞色素p450 酶(特别是2C9和3A4同种型)的抑制的选择性。
可以通过Walker,etal.Biorg.Med.Chem.Letts.2008,18,6071-6077 中描述的方案来确定，本发明的化合物可能与谷胱甘肽形成加合物的倾向 性如何。
进一步的实施方式
在适当的情况下，下面的实施方式和优选项可以彼此结合。
在一些实施方式中，R2是H并且R1是：
其中RN1选自H、C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和 丙-2-基)和C(=O)Me。在这些实施方式的一些实施方式中，可以优选的是， RN1是C(=O)Me。在这些实施方式的其他实施方式中，可以优选的是，RN1是H、甲基或乙基。
在其他实施方式中，R2是H且R1是：
其中RN2选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和 丙-2-基)。在这些实施方式中，可以优选的是，RN2选自H和甲基。在这 些实施方式的其他实施方式中，可以优选的是，RN2是乙基。
在其他实施方式中，R2是H且R1是：
其中RN3选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙 -2-基)。在这些实施方式中，可以优选的是，RN3选自H和甲基。在这些 实施方式的其他实施方式中，可以优选的是，RN3是乙基。
在其他实施方式中，R2是H且R1是：
其中RN4选自H和甲基。在这些实施方式中，可以优选 的是，RN4是H。
在其他实施方式中，R2是H且R1是：
其中RN7和RN8均是H或均是甲基。在这些实施方 式的一些实施方式中，可以优选的是，RN7和RN8均是H。
在其他实施方式中，R2是H且R1是：
其中RN9选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2- 基)。在这些实施方式中，可以优选的是，RN9是H。
在其他实施方式中，R2是H且R1是：
其中RN10选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1- 基和丙-2-基)。在这些实施方式中，可以优选的是，RN10选自H和甲基。
在其他实施方式中，R2是H且R1是：
其中RN11选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和 丙-2-基)。在这些实施方式中，可以优选的是，RN11是H。
在一些实施方式中，R1是H且R2是：
其中RN5选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和 丙-2-基)。在这些实施方式中，可以优选的是，RN5选自H和甲基。
在一些实施方式中，R1是H且R2是：
其中RN6选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和 丙-2-基)。在这些实施方式中，可以优选的是，RN6选自H和甲基。
可以进一步优选的是，R1是H且R2是：
在一些实施方式中，当R1和R2一超形成基团-CH2-N(RN12)-C2H4-时， RN12选自H和C1-3烷基(即甲基、乙基、丙-1-基和丙-2-基)。在这些实施方 式中，可以优选的是，RN12选自H和甲基，以及可以更优选的是，RN12是甲基。
在一些实施方式中，R4选自CF3、Cl、Br、CF2H、和CN。
在进一步的实施方式中，R4选自CF3、Cl和CF2H。在进一步的实施 方式中，R4选自CF3和Cl。可以优选的是，R4是CF3。
在一些实施方式中，可以优选的是，R5是下式的组：
在一些实施方式中，R5是选自以下的组：
在这些实施方式中，R5可以优选地选自R5e他R5c，以及可以更优选 是R5e。
在一些实施方式中，R7是H且R6是(CHRC1)n1C(O)N(RN6)Z1。
在进一步的实施方式中，R7是H且R6选自CH2C(O)NH2、 CH2C(O)NHCH3、CHCH3C(O)NH2和CHCH3C(O)NHCH3。
可以优选的是，R7是H且R6选自CH2C(O)NH2、CHCH3C(O)NH2和 CH2C(O)NHCH3，且更优选地选自CH2C(O)NH2、和CHCH3C(O)NH2。
在一些实施方式中，R6是H且R7是(CH2)m1C(O)N(RM1)Y1。
在进一步的实施方式中，R6是H且R7选自C(O)NH2、C(O)NHCH3、 CH2C(O)NH2和CH2C(O)NHCH3。
可以优选的是，R6是H且R7是C(O)NH2。
在其中R6是H且R7是C(O)NH2的一些实施方式中，R8是甲基。
在一些实施方式中，可以优选的是，R5是下式的组：
在本发明的所选的实施方式中，化合物可以具有式Ia：
其中R1a选自：
其中：
RN2选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN3选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；以及
RN4选自H和CH3。
上文针对RN2、RN3和RN4所指出的优越项在这里也适用。
在本发明的所选的实施方式中，化合物可以具有式Ib：
其中R1b选自：
其中：
RN1选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN2选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN3选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN4选自H和CH3；
RN7和RN8独立地选自H和CH3；
RN9选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；
RN10选自H、C1-3烷基和C(=O)Me；以及
RN11选自H、C1-3烷基和C(=O)Me。
上文针对RN1、RN2、RN3、RN4、RN7、RN8、RN9、RN10和RN11所指出 的优越项在这里也适用。
尤其是，式Ib的化合物，其中R1b选自：
并且其中：
RN2b选自H、甲基和乙基；
RN3b选自H和甲基；
RN4b是H；
RN9b是H；以及
RN10选自H和甲基。
本发明的实施方式是示例的化合物，其包括化合物1至40。特别感 兴趣的实施方式包括化合物4、5、8、11和16。特别感兴趣的进一步的实 施方式包括化合物21、22、25、31和36。
一般合成方法
可以采用以下一般方法并且利用在实验部分中详细描述的程序来制 备本发明的化合物。提及的反应条件是说明性的而非限制性的。
可以通过下文概述的合成策略来制备如上文描述的式I的化合物，其 中上述定义适用：
方案A
式F1的化合物可以和式F2的取代的商用或合成苯胺(如在方案C、 D、E、F、G、H、I、J、K和L中所制备的)进行反应以形成式F3的中间 体，其中L1和L2可以是相同或不同的并且包括Cl、Br、I、SMe、SO2Me 以及R4=CF3、卤素、CF2H或CN。
商用苯胺的一个实例是：
其可用于制备化合物，其中，R1和R2一超形成基团 -CH2-N(RN12)-C2H4-。
可以制备式F1的化合物，其中L1和L2是不同的(参见方案B)以允许 区域选择性取代，或当L1=L2时，可以采用适当的反应条件(溶剂的选择， 反应温度，添加路易斯酸，例如处于乙醚中的ZnCl2)以允许L2选择性地 取代L1。在获得区域化学混合物和二取代的情况下，可以通过层析法来分 离区域异构体。
式F1的化合物，其中L1=L2，是市售的，例如2,4-二氯-5-(三氟甲基) 嘧啶、2,4-二氯-5-氟嘧啶、2,4,5-三氯嘧啶、2,4-二氯-5-溴嘧啶、2,4-二氯-5- 碘嘧啶、2,4-二氯-5-氰基嘧啶，或可以容易地由商用原料制备。在R4=CF3以及L1和L2的区别是所期望的情况下，可以采用在方案B中概述的方法。
方案B
在氯化锌(II)存在下，市售的2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶(G1)可以和硫 代甲醇钠选择性地反应，以产生2-硫代甲基-4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶(G2)。 可以进一步反应2-硫代甲基-4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶(G2)，例如通过在芬克 尔斯坦条件下转化成2-硫代甲基-4-碘-5-(三氟甲基)嘧啶(G3)和/或通过借 助于mCPBA进行氧化，以产生相应砜（如果2和4位置的进一步的区分 是所需要的或如果另外的激活是所期望的）。
方案C
市售的1-(4-硝基苯基)哌嗪(G4)、或其盐可以和Boc酸酐反应以产生 4-(4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(G5)。在催化剂例如钯碳存在下，经由 氢化的随后还原产生相应的苯胺，4-(4-氨基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(G6)。
方案D
可以在用于产生4-(3-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(G8)的Buchwald 型反应中通过偶联市售的哌嗪-1-羧酸叔丁酯(G7)和式F4的化合物（其中 L3=I或Br）来制备4-(3-氨基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(G9)。在催化剂例如 钯碳存在下，借助于氢进行还原产生4-(3-氨基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯 (G9)。
方案E
可以通过一系列反应，以将市售的4-氧代哌啶-1-羧酸叔丁酯(G10)转 化成三氟甲磺酸乙烯酯G11开始，来制备相应的4-哌啶类似物G6。在 Suzuki型反应中，G11与(4-硝基苯基)硼酸(G12)偶联产生四氢吡啶(G13)。 在催化剂例如钯碳存在下，借助于氢化进行随后还原产生4-(4-氨基苯基) 哌啶-1-羧酸叔丁酯(G14)。
方案F
可以通过一系列反应，以将市售的4-氧代哌啶-1-羧酸叔丁酯(G10)转 化成三氟甲磺酸乙烯酯G11开始，来制备相应的4-(3-氨基苯基)哌啶类似 物G9。在Suzuki型反应中，G11与(3-硝基苯基)硼酸(G15)偶联产生四氢 吡啶(G16)。在催化剂例如钯碳存在下，借助于氢化进行随后还原产生4-(3- 氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(G17)。
方案G
可以在用于形成3-(4-硝基苯基)吡啶(G19)的Suzuki型反应中通过式 F5的市售化合物（其中L3=I或Br）与吡啶-3-基硼酸(G18)的反应来制备 G14的3-(4-氨基苯基)哌啶区域异构体。在催化剂例如氧化铂存在下借助 于氢进行的G19的还原产生4-(哌啶-3-基)苯胺(G20)，其可以利用Boc酸 酐加以保护以产生3-(4-氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(G21)。
方案H
可以在用于形成2-(4-硝基苯基)吡啶(G23)的Suzuki型反应中通过式 F5的市售化合物（其中L3=I或Br）与吡啶-2-基硼酸(G22)反应来制备G14 的2-(4-氨基苯基)哌啶区域异构体。在催化剂例如氧化铂存在下借助于氢 进行的G23的还原产生4-(哌啶-2-基)苯胺(G24)，其可以利用Boc酸酐加 以保护以产生2-(4-氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(G25)。
方案I
可以在用于产生(1-(4-硝基苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(G28)的 热条件下通过市售哌啶-4-基氨基甲酸叔丁酯(G26)和1-氟-4-硝基苯(G27) 的亲核芳族取代来制备(1-(4-氨基苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(G29)。 在催化剂例如10%钯碳存在下，借助于氢进行的G28的还原产生(1-(4-氨 基苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(G29)。
方案J
可以通过用哌嗪-1-羧酸叔丁酯(G7)对市售1-(溴甲基)-4-硝基苯(G30) 进行亲核置换来制备4-(4-氨基苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(G32)，以产生4-(4- 硝基苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(G31)。在催化剂例如10%钯碳存在下，借助 于氢进行的随后还原产生4-(4-氨基苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(G32)。
方案K
在三氟甲磺酸酰胺（triflamide）和适当碱（例如NaHMDS）存在下， 可以将市售3-氧代吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(G33)转化成三氟甲磺酸乙烯酯 (G34)和(G35)的混合物。在Suzuki条件下，混合物与(4-硝基苯基)硼酸(G12) 偶联产生二氢吡咯(G36)和(G37)。在催化剂例如10%钯碳存在下，利用氢 进行混合物的还原产生3-(4-氨基苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(G38)。
方案L
可以还原和环化市售2-溴-1-(4-硝基苯基)乙酮(G39)，以产生环氧化 物(G40)。借助于甲苯磺酰基酰胺来打开环氧化物，接着用(2-溴乙基)二苯 基锍三氟甲磺酸盐加以环化，来产生吗啉(G42)。氨磺酰的切割和借助于 Boc酸酐的随后的重新保护产生氨基甲酸酯(G44)。在氯化铁(III)存在下， 利用肼进行还原产生2-(4-氨基苯基)吗啉-4-羧酸叔丁酯(G45)。
方案M
可以使式F6的化合物反应以形成式F7的酯，其中X=Br或I，R8=H 或Me并且Y选自单键、-CH2-和-CHCH3-。当RO1=t-Bu时，可以采用Boc 酸酐，或在RO1=Me的情况下，在酸例如硫酸存在下，甲醇可以用来形成 所期望的酯。在Sonagashira型偶联中，式F7的酯可以和式F8的末端乙 炔反应以产生式F9的乙炔，其中R9=TMS、TES或(CH3)2COH。然后可以 除去R9以产生式F10的化合物。当R9=TMS或TES时碳酸钾或四正丁基 氟化铵可以用来诱导这种转化。当R9=(CH3)2C*OH时，可以使用处于回 流甲苯中的氢化钠。
方案N
在Sonagashira型偶联中，式F3的嘧啶可以和式F10的末端乙炔反应 以产生式F11的乙炔。在过渡金属催化剂存在下，利用氢气，可以将在式 F11化合物中的乙炔还原成式F26的烷。采用的催化剂和条件的确切选择 取决于R4的特性。例如，在R4=CF3的情况下，可以使用10%Pd/C，在 R4=Cl的情况下，则采用氧化铂。然后可以去保护式F12的酯，以产生式 F13的羧酸。在RO1=Me的情况下，可以采用氢氧化锂溶液。在RO1=t-Bu 的情况下，可以使用例如处于二氯甲烷中的三氟乙酸的酸性溶液。可以理 解的是，在酸性条件下还可以切割在R1和R2中的Boc保护基团。
方案O
在肽偶联剂例如HATU存在下，利用适宜的胺或铵盐，可以将式F13 的羧酸转化成式F14的酰胺。
方案P
可替换地，当RO1=Me时，在升高温度下，通过和胺反应，可以将式 F12的酯直接转化成式F14的酰胺。
方案Q
在需要分子与内酰胺融合至右手侧芳环的情况下，可以在Sonagashira 型偶联中，使式F15的化合物和式F8的末端乙炔反应，以产生式F16的 乙炔，其中R9=TMS、TES或(CH3)2C*OH。然后可以除去R9，以产生式 F17的化合物。当R9=TMS或TES时，可以采用碳酸钾或四正丁基氟化铵， 来诱导这种转化。当R9=(CH3)2C*OH时，可以使用处于回流甲苯中的氢 化钠。
然后可以将式F17的化合物偶联至式F3的化合物(如在方案N中)并 进一步加工（如上文描述的）。
方案R
然后可以在酸性条件下去保护式F14的化合物、或包含内酰胺的类 似物，其具有在R1或R2中存在的Boc保护基团(代替RN1至RN12)，例如 利用在二氯甲烷溶液中的三氟乙酸，以产生式F18的相应母体化合物。
方案S
然后可以通过胺官能团的衍生来进一步改性式F18的化合物。例如， 在三乙酰氧基硼氢化钠存在下，通过借助于甲醛的还原烷基化，可以制备 式F19的化合物，其中RN1、RN2、RN3、RN4、RN5、RN6、RN7、RN8、RN9、 RN10、RN11或RN12=Me。在三乙酰氧基硼氢化钠存在下，通过借助于乙醛 的还原烷基化，可以制备衍生物，其中RN1、RN2、RN3、RN5、RN6、RN7、 RN8、RN9、RN10、RN11或RN12=Et。通过式F18的化合物和适宜的酰化剂， 例如乙酸酐进行反应可以制备式F19的化合物，其中RN1、RN2、RN3、RN5、 RN6、RN7、RN8、RN9、RN10、RN11或RN12=乙酰基。
可替换地，当化合物，其中R5=杂芳基，是所期望的杂芳基时，可以 如在方案T、U和V中概述来制备F10的类似物。可以将这些杂芳基乙炔 偶联至式F3的化合物，然后以上文在方案N、O、P、R和S中描述的类 似方式进行进一步加工。
方案T
对于包含吡嗪的类似物，可以在LiHMDS存在下，使2,3-二氯吡嗪 (G46)和乙酸乙酯反应，以产生酯G47。在Sonagashira条件下，G47和TMS 乙炔偶联以产生乙炔G48。利用TBAF来除去三甲基甲硅烷基以产生2-(3- 乙炔基吡嗪-2-基)乙酸乙酯(G49)。
方案U
对于嘧啶类似物，可以在钠金属存在下缩合琥珀酸二乙酯(G50)和甲 酸乙酯(G51)以产生醛G52。利用硫脲进行环化产生4-氧-2-硫代-1,2,3,4- 四氢嘧啶(G53)。利用兰尼镍进行的脱硫产生嘧啶酮G54，利用磷氯氧化 物，可以将其转化成4-氯嘧啶G55。在Sonagashira条件下，偶联TES-乙 炔，接着利用TBAF来除去三乙基甲硅烷基，以产生2-(4-乙炔基嘧啶-5- 基)乙酸乙酯(G57)。
方案V
对于乙酸-3-吡啶酯，可以将2-(吡啶-3-基)乙腈(G58)氧化成N-氧化物 G59。借助于磷氯氧化物的氯化产生2-氯吡啶G60，借助于氢氧化钠，可 以将其水解成乙酸G61。利用甲醇进行的酯形成产生2-氯吡啶酯G62。在 Sonagashira条件下，偶联TES-乙炔，接着利用TBAF来除去三乙基甲硅 烷基，以产生2-(2-乙炔基吡啶-3-基)乙酸甲酯(G64)。
可替换地，可以硼氢化类似于F10的杂芳基乙炔，以产生乙烯基硼 烷（如在方案W中）。可以利用Suzuki化学将它们偶联至式F3的化合物， 然后以上文在方案N、O、P、R和S中描述的类似方式进行进一步加工。
方案W
可以利用Sonagashira条件来偶联2-溴异烟酸甲酯(G65)以产生乙炔 G66。借助于TBAF来除去三甲基甲硅烷基以产生末端乙炔G67，其可以 被硼氢化以产生2-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)乙烯基) 异烟酸-(E)-甲酯(G68)。
用于形成式F12的化合物（其中R4=CF3并且R8=H）的一种可替换 策略是用来制备式F22的化合物，如在方案X中概述的。
方案X
在Sonagashira条件下，式F10的酯（其中R8=H）和4-碘-2-(甲硫 基)-5-(三氟甲基)嘧啶(G3)的偶联产生式F20的乙炔。利用MCPBA进行的 氧化产生式F21的砜。在催化剂例如10%钯碳存在下，利用氢进行的乙炔 还原产生式F22的化合物。
在酸性条件下，例如在三氟乙酸存在下，可以使式F22的化合物和 式F2的苯胺进行反应，以产生式F12的化合物，然后其可以被进一步加 工（如上文描述的）。
本发明的化合物的应用
本发明提供活性化合物，具体地为活性2,4,5-取代的嘧啶。
如本文中所使用的术语“活性”涉及能够抑制FAK活性以及VEGFR3 活性的化合物，并具体地包括具有固有活性(药物)的化合物以及此类化合 物的药物前体两者，所述药物前体本身可表现出很少的固有活性或无固有 活性。
可以用于评估由特定化合物提供的FAK和VEGFR3抑制的测定描述 于以下实施例中。
本发明还提供抑制细胞中FAK抑制以及VEGFR3活性的方法，包括 使所述细胞与有效量的活性化合物接触，优选地为药学上可接受组合物的 形式。该方法可以在体外和体内适用。
本发明还提供抑制FAK活性以及VEGFR3活性的活性化合物以及抑 制FAK活性以及VEGFR3活性的方法，该方法包括使细胞与有效量的活 性化合物接触（无论在体外或体内）。
活性化合物还可以用作体外测定的一部分，例如，用于确定侯选宿主 是否可能受益于用所讨论的化合物进行治疗。
本发明还提供活性化合物在人体或动物体的治疗方法中的用途。该方 法可包括给予受试者治疗有效量的活性化合物，优选地为药物组合物形 式。
如本文中在治疗病症的上下文中所使用的术语“治疗”，一般涉及治 疗和疗法，无论人类或动物（例如在兽医应用中），其中达到一些期望的 治疗效果，例如，抑制病症的进展，并且包括降低进展速率、停止进展速 率、改善病症、和治愈病症。还包括作为预防措施的治疗(即预防)。
如本文中所使用的术语“治疗有效量”，涉及活性化合物或包含活性 化合物的材料、组合物或剂型的量，其有效地用于产生一些所期望的治疗 效果，与合理的效益/风险比率相匹配。
癌症
本发明提供作为抗癌剂的活性化合物。本领域普通技术人员能够容易 地确定侯选化合物是否能够治疗任何特定细胞类型的癌症病症（单独或组 合）。
癌症的例子包括，但不限于，骨癌、脑干神经胶质瘤、乳腺癌、肾上 腺癌、肛门区的癌症、膀胱癌、内分泌系统的癌症、食道癌、头部或颈部 癌症、肾或输尿管癌、肝癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、小肠癌、甲状腺癌、 尿道癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、输卵管癌、肾盂癌、阴道癌、外阴癌、 慢性或急性白血病、结肠癌、皮肤或眼内黑色素瘤、血液系统恶性肿瘤、 霍奇金病、肺癌、淋巴细胞性淋巴瘤、中枢神经系统肿瘤(CNS)、卵巢癌、 胰腺癌、垂体腺瘤、原发性CNS淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、 软组织肉瘤、皮肤癌、脊髓轴肿瘤、胃癌和子宫癌。
可以治疗任何类型的细胞，包括但不限于肺、胃肠(包括例如肠、结 肠)、胸部(乳房)、卵巢、前列腺、肝(肝脏)、肾(肾脏)、膀胱、胰脏、脑 和皮肤。
在上文中所定义的抗癌治疗可以作为唯一的疗法应用或者除了本发 明的化合物外还可以包括常规手术或放射疗法或化学疗法。此类化学疗法 可以包括一种或多种以下类别的抗肿瘤剂：-
(i)如医学肿瘤学中使用的其他抗增殖药物/抗肿瘤药物以及它们 的组合，例如烷基化剂(例如顺铂、奥沙利铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、 美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、替莫唑胺和亚硝基脲)；抗代谢药物(例如 吉西他滨和抗叶酸盐，诸如氟嘧啶类如5氟尿嘧啶和替加氟、雷替曲塞、 甲氨蝶呤、阿糖胞苷、和羟基脲)；抗肿瘤抗生素(例如蒽环类如阿霉素、 博来霉素、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素-C、放 线菌素和光辉霉素)；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱类如长春新碱、长 春花碱、长春地辛和长春瑞滨以及紫杉烷类如紫衫醇和多西紫杉醇(泰索 帝)和马球激酶抑制剂)；和拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素类如依托泊 苷和替尼泊苷、安吖啶、托泊替康和喜树碱)；
(ii)细胞生长抑制剂，例如抗雌激素(例如他莫昔芬、氟维司群、托 瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬和碘酰芬(iodoxyfene))、抗雄激素(例如比卡 鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和环丙孕酮乙酸盐)、LHRH拮抗剂或LHRH激 动剂(例如戈舍瑞林、亮丙瑞林和布舍瑞林)、孕激素(例如甲地孕酮乙酸 盐)、芳香酶抑制剂(例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦) 和5*-还原酶的抑制剂如非那雄胺；
(iii)抗侵入剂(例如c-Src激酶家族抑制剂如4-(6-氯-2,3-亚甲基二氧 苯胺基)-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]-5-四氢吡喃-4-基氧基喹唑啉 (AZD0530；国际专利申请WO01/94341)、N-(2-氯-6-甲基苯基)-2-{6-[4-(2- 羟乙基)哌嗪-1-基]-2-甲基嘧啶-4-基氨基}噻唑-5-甲酰胺(dasatinib, BMS-354825；J.Med.Chem.,2004,47,6658-6661)和4-((2,4-二氯-5-甲氧基 苯基)氨基)-6-甲氧基-7-(3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基)喹啉-3-腈(bosutinib, SKI-606；Cancerresearch(2003),63(2),375-81)，和金属蛋白酶抑制剂如马 立马司他，尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂受体功能的抑制剂或类肝素酶的 抗体)；
(iv)生长因子功能的抑制剂：例如此类抑制剂包括生长因子抗体和 生长因子受体抗体(例如抗erbB2抗体曲妥珠单抗[HerceptinT]、抗-EGFR 抗体帕尼单抗、抗erbB1抗体西妥昔单抗[Erbitux,C225]和由Sternetal. Criticalreviewsinoncology/haematology,2005,Vol.54,pp11-29公开的任何 生长因子或生长因子受体抗体)；此类抑制剂还包括酪氨酸激酶抑制剂， 例如表皮生长因子家族的抑制剂(例如EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂如 N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(gefitinib, ZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(erlotinib, OSI774)和6-丙烯酰氨基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)-喹唑啉 -4-胺(CI1033)，erbB2酪氨酸激酶抑制剂如拉帕替尼，肝细胞生长因子家 族的抑制剂，血小板源性生长因子家族的抑制剂如伊马替尼，丝氨酸/苏氨 酸激酶的抑制剂(例如Ras/Raf信号抑制剂如法尼基转移酶抑制剂，例如索 拉非尼(BAY43-9006))，通过MEK和/或AKT激酶的细胞信号抑制剂，肝 细胞生长因子家族的抑制剂，c-kit抑制剂，abl激酶抑制剂，IGF受体(胰 岛素样生长因子)激酶抑制剂；极光激酶抑制剂(例如AZD1152、PH739358、 VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528和AX39459)和细 胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂如CDK2和/或CDK4抑制剂；
(v)抗血管生成剂如抑制血管内皮生长因子作用的那些，[例如抗血 管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗(AvastinT)和VEGF受体酪氨酸激酶抑 制剂如4-(4-溴-2-氟苯胺)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉 (ZD6474；WO01/32651中的实施例2)，4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6- 甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171；WO00/47212中的实 施例240)，瓦他拉尼(PTK787；WO98/35985)和SU11248(sunitinib；WO 01/60814)，如公开于国际专利申请WO97/22596、WO97/30035、WO 97/32856和WO98/13354中的那些化合物以及通过其他机制起作用的化 合物(例如利诺胺，整联蛋白avb3功能的抑制剂和血管生成抑制因子)]；
(vi)血管损伤剂，如考布他汀A4和公开于国际专利申请WO 99/02166、WO00/40529、WO00/41669、WO01/92224、WO02/04434和 WO02/08213中的化合物；
(vii)反义疗法，例如针对以上列举的靶的那些如ISIS2503、抗-ras 反义；
(viii)基因治疗方法，包括例如用于替换异常基因(如异常p53或异常 BRCA1或BRCA2)的方法，GDEPT(基因定向酶药物前体治疗)方法如使 用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些，以及用于提高患者 的化疗或放疗耐受性的方法如多药耐药性基因治疗；和
(ix)免疫治疗方法，包括例如用于增加患者肿瘤细胞的免疫原性的 体外和体内方法，例如用细胞因子(如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细 胞巨噬细胞集落刺激因子)转染；减少T细胞无反应性的方法；使用转染 的免疫细胞(如细胞因子转染的树突细胞)的方法；使用细胞因子转染的肿 瘤细胞系的方法和使用抗个体基因型抗体的方法。
特别感兴趣的是与多西紫杉醇的组合。感兴趣的是包括与吉西他滨、 顺铂和喜树碱药物前体伊立替康的其他可能的组合。
给药
所述活性化合物或包含所述活性化合物的药物组合物可以通过任何 方便的给药途径给予受试者，不论是全身性/外周性或在需要起作用的位 点，包括，但不限于，口服(例如通过摄食)；局部给药(包括例如透皮、鼻 内、眼、颊和舌下)；肺部给药(例如通过吸入或吹入疗法，使用例如气溶 胶，例如通过口或鼻)；直肠给药；阴道给药；胃肠外给药，例如，通过 注射，包括皮下、皮内、肌内、静脉内、动脉内、心内、鞘内、脊柱内、 囊内、囊下、眼内、腹膜内、气管内、表皮下、关节内、蛛网膜下和胸骨 内；通过植入储留药物(depot)，例如皮下或肌内。受试者可以为真核生物、 动物、脊椎动物、哺乳动物、啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、 鼠科(例如小鼠)、犬科(例如狗)、猫科(例如猫)、马科(例如马)、灵长类动 物、类人猿(例如猴子或猿)、猴子(例如狨猴、狒狒)、猿(例如大猩猩、黑 猩猩、猩猩、长臂猿)、或人类。
配方
虽然所述活性化合物可以单独给药，但优选以药物组合物(例如配制 品)的方式提供，所述药物组合物包含至少一种如上定义的活性化合物以 及一种或多种药学上可接受的载体、佐剂、赋形剂、稀释剂、填料、缓冲 剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域技术人员熟知的其他材料和可选的 其他治疗剂或预防剂。
因此，本发明进一步提供如上所定义的药物组合物和制备药物组合物 的方法，该方法包括将至少一种如上定义的活性化合物与一种或多种药学 上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂、佐剂、稳定剂或如本文所述其他材料 一起进行混合。
如本文中所使用的术语“药学上可接受的”涉及在合理的医学判断范 围内，适合用于接触受试者(例如人类)的组织而没有过多的毒性、刺激性、 过敏性反应或其他问题或并发症的化合物、材料、组合物和/或剂型（与合 理的效益/风险比率相匹配）。在与配制品的其他成分相容的意义上，每种 载体、赋形剂等也必须是“可接受的”。
合适的载体、赋形剂等可以在标准药物文本中找到，例如, Remington’sPharmaceuticalSciences,18thedition,MackPublishing Company,Easton,Pa.,1990。
该配制品可方便地以单位剂量的形式提供并且可以通过药学领域中 任何熟知的方法来制备。此类方法包括使所述活性化合物与一种或多种辅 助成分构成的载体进行结合的步骤。一般说来，通过均匀地且紧密地使所 述活性化合物与液体载体或细分的固体载体或该两者相结合并且然后如 有必要时将产物成形来制备该配制品。
配方的形式可以是液体、溶液、悬浮液、乳液、酏剂、糖浆、片剂、 锭剂、颗粒、粉末、胶囊、扁囊剂、丸剂、安瓿、栓剂、子宫托、软膏、 凝胶、糊剂、乳膏剂、喷雾剂、水雾剂（mist）、泡沫、洗剂、油、大丸剂、 干药糖剂或气溶胶。
适合于口服(例如通过摄食)的配制品可以作为离散的单位提供，例如 胶囊、扁囊剂或片剂，各自含有预定量的活性化合物；作为粉末或颗粒； 作为处于水溶液或非水溶液中的液体或悬浮液；或作为水包油型液体乳液 或油包水型液体乳液；作为大丸剂；作为干药糖剂；或作为糊剂提供。
片剂可以通过常规方法来制造，例如，可选地与一种或多种辅助成分 一起进行压制或模制。压缩片剂可以在适合的机器中通过压缩自由流动形 式的活性化合物（如粉末或颗粒）来制备，可选地与一种或多种粘合剂(例 如聚维酮、明胶、阿拉伯胶、山梨糖醇、黄蓍胶、羟丙基甲基纤维素)； 填充剂或稀释剂(例如乳糖、微晶纤维素、磷酸氢钙)；润滑剂(例如硬脂酸 镁、滑石粉、二氧化硅)；崩解剂(例如淀粉羟基乙酸钠、交联聚维酮、交 联羧甲基纤维素钠)；表面活性剂或分散剂或润湿剂(例如，月桂基硫酸钠)； 和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、山梨酸)混合。模 压片可以在合适的机器中通过模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物 的混合物来制造。该片剂可以可选地被包衣或刻痕且可以被配制以提供缓 释或控释其中的活性化合物，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提 供所需的释放曲线。片剂可以可选地提供有肠溶衣，以提供在胃以外的肠 道的部分中释放。
适合于局部给药(例如透皮、鼻内、眼、颊和舌下)的配制品可以配制 为软膏、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾剂、气溶 胶或油。可替代地，配制品可以包含贴剂或敷料，如用活性化合物和可选 的一种或多种赋形剂或稀释剂浸渍的绷带或胶布（adhesiveplaster）。
适合于在口中局部给药的配制品包括锭剂，其在调味基料(通常为蔗 糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中包含所述活性化合物；软锭剂，其在惰性基料(例 如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)中包含所述活性化合物；和漱口药， 其在适合的液体载体中包含所述活性化合物。
适合于向眼中局部给药的配制品还包含滴眼剂，其中所述活性化合物 溶解或悬浮于适合的载体中，特别是用于该活性化合物的水性溶剂。
适合于鼻部给药的配制品（其中载体为固体），包括粗粉，其具有例 如在约20～约500微米范围内的粒度，其以用鼻子吸入的方式给药，即通 过从放置接近鼻子的该粉末的容器中通过鼻腔通道快速吸入。其中载体为 液体的适合给药的配制品，像例如鼻喷雾剂、滴鼻剂、或通过喷雾器给予 气溶胶，包括所述活性化合物的水溶液或油溶液。
适合于通过吸入给药的配制品包括以使用适合的推进剂(例如二氟二 氯甲烷、三氯氟甲烷、二氯-四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体)从加 压包中喷出气溶胶而提供的那些。
适合于通过皮肤局部给药的配制品包括软膏、乳膏和乳液。当配制成 软膏时，所述活性化合物可以可选地与链烷基料或可与水混溶的软膏基料 一起使用。可替代地，所述活性化合物可以与水包油型乳膏基料一起配制 成乳膏。如果需要，乳膏基料的水相可以包括例如至少约30%w/w的多 元醇，即具有两个或更多个羟基的醇，例如丙二醇、丁-1,3-二醇、甘露糖 醇、山梨糖醇、甘油和聚乙二醇及它们的混合物。该局部配制品可以可取 地包括增强所述活性化合物通过皮肤或其他受影响区域的吸收或渗透的 化合物。此类皮肤渗透增强剂的例子包括二甲亚砜和相关类似物。
当配制为局部乳液时，油相可以可选地仅包含乳化剂（emulsifier）(或 者称为乳化剂（emulgent）)，或者其可以包含至少一种乳化剂与脂肪或油 或与脂肪和油两者的混合物。优选地，亲水性乳化剂与亲油性乳化剂包括 在一起，该亲油性乳化剂充当为稳定剂。还优选包含油和脂肪两者。共同 地，乳化剂与或不与稳定剂组成所谓的乳化蜡，并且该蜡与油和/或脂肪一 起组成所谓的乳化软膏基料，其形成乳膏配制品的油性分散相。
适合的乳化剂和乳液稳定剂包括土温60、Span80、十六十八醇、肉 豆蔻醇、单硬脂酸甘油酯和月桂基硫酸钠。合适于配制品的油或脂肪的选 择是基于实现所需的化妆品性质，因为所述活性化合物在可能用于药物乳 液配制品中的大多数油中的溶解度可能非常低。因此，乳膏可以优选为不 油腻、不染色且可洗掉的产品，并且具有合适的稠度以避免从管或其他容 器中泄漏。可以使用直链或支链的一元或二元烷基酯，例如二异己二酸酯、 硬脂酸异鲸蜡基酯、椰子脂肪酸的丙二醇二酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸癸 酯、棕榈酸异丙酯、硬脂酸丁酯、棕榈酸2-乙基己基酯或称为CrodamolCAP 的支链酯的混合物，其中最后三种是优选的酯。根据所需要的特性，这些 可以单独使用或组合使用。
可替代地，可以使用高熔点脂类，如白色软石蜡和/或液体石蜡或其 他矿物油。
适合于直肠给药的配制品可以提供为具有适合的基料的栓剂，所述基 料包含例如可可脂或水杨酸酯。
适于阴道给药的配制品可以提供为阴道栓剂、棉塞、乳膏、凝胶、糊 剂、泡沫或包含除了所述活性化合物之外本领域中认为适合的载体的喷雾 剂配制品。
适用于肠胃外给药(例如通过注射，包括皮肤、皮下、肌内、静脉内 和皮内)的配制品包括：水性和非水性的等渗性、无热原的、无菌注射溶 液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、防腐剂、稳定剂、抑菌剂和使得配制品 与预定接受者的血液等渗的溶质；和水性和非水性的无菌悬浮液，其可含 有助悬剂和增稠剂；和脂质体或设计成将化合物靶向血液组分或一个或多 个器官的其他微粒系统。合适用于此类配制品的等渗载体的例子包括氯化 钠注射液、林格氏溶液或乳酸盐林格注射液。典型地，溶液中活性化合物 的浓度为约1ng/ml～约10μg/ml，例如约10ng/ml～约1μg/ml。所述配制 品可以提供在单位剂量或多剂量密封的容器中，例如，安瓿瓶或小管，并 且可以在仅需要在使用前立即加入无菌液体载体(例如注射用水)的冷冻干 燥(冻干)条件下进行贮存。可以由无菌粉末，颗粒和片剂来制备临时注射 溶液和悬浮液。配制品可以为脂质体形式或设计成将所述活性化合物靶向 血液组分或一个或多个器官的其他微粒系统的形式。
剂量
可以理解的是所述活性化合物和包含所述活性化合物的组合物的合 适剂量在患者之间可以不同。确定最佳剂量一般涉及平衡本发明的疗效水 平相对于治疗的任何危险或有害的副作用。所选择的剂量水平将取决于多 种因素，包括但不限于特定化合物的活性、给药的途径、给药时间、化合 物的排泄速率、治疗的持续时间、组合使用的其他药物、化合物和/或材料、 以及患者的年龄、性别、体重、病情、一般健康状况和前病史。化合物的 量及给药途径最终将由医生来判断，尽管一般地该剂量在作用位点将达到 局部浓度，其可以达到预期的效果而不会造成实质性损害性的或有害的副 作用。
在整个治疗过程中，可以一次性地、连续地或间歇地(例如在适当的 时间间隔以分开的剂量)实行体内给药。确定最有效的给药方法和给药剂 量的方法为本领域技术人员所公知，并且将随用于治疗的配制品、治疗的 目的、受治疗的靶细胞和受治疗的患者而不同。可以用由治疗医生选择的 剂量水平和模式来进行单次给药或多次给药。
一般来说，所述活性化合物的合适剂量范围为约100μg～约250mg/ 受试者千克体重/天。在所述活性化合物为盐、酯、药物前体等的情况下， 给药量是基于母体化合物来计算的并且因此按比例增加有待使用的实际 重量。
具体实施方式
以下为实施例，其仅用来说明本发明而不旨在限制如本文描述的本发 明的范围。
缩写词
为方便起见，利用众所周知的缩写词来表示许多化学部分，包括但不 限于甲基(Me)、乙基(Et)、正丙基(nPr)、异丙基(iPr)、正丁基(nBu)、叔丁 基(tBu)、正己基(nHex)、环己基(cHex)、苯基(Ph)、联苯基(biPh)、苄基(Bn)、 萘基(naph)、甲氧基(MeO)、乙氧基(EtO)、苯甲酰基(Bz)、和乙酰基(Ac)。
为方便起见，利用众所周知的缩写词来表示许多化合物，包括但不限 于甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、异丙醇(i-PrOH)、甲乙酮(MEK)、醚或乙醚 (Et2O)、乙酸(AcOH)、二氯甲烷(甲叉二氯，DCM)、三氟乙酸(TFA)、二 甲基甲酰胺(DMF)、四氢呋喃(THF)、二甲亚砜(DMSO)、间氯过氧苯甲酸 (mCPBA)、叔丁氧基羰基(Boc)、三甲基甲硅烷基(TMS)、三乙基甲硅烷基 (TES)、2-(1H-7-氮杂苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸盐 (HATU)、二苯基磷酰基叠氮化物(DPPA)、1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一-7-烯 (DBU)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCl)、4-二甲基氨基吡啶 (DMAP)、四正丁基铵氟化物(TBAF)、N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)、1-羟 基苯并三唑(HOBt)、和1,2-二氯乙烯(DCE)。
一般实验细节
除另有说明外，使用以下概述。
在BrukerAvanceDRX300(300MHz)、BrukerUltrasheildplus(400 MHz)或VarianUnityInova600(600MHz)分光计上记录1NMR谱。通过以 下缩写词来指定信号的多重性：s，单峰；d，双峰；t，三重峰；q，四重 峰；br，宽峰；m，多重峰。以Hertz为单位来报道所有观测到的偶合常 数，J。在BrukerAvanceDRX300(75MHz)、BrukerUltrasheildplus(100 MHz)或VarianUnityInova600(150MHz)分光计上以宽带去偶方式，来记 录13CNMR。
利用FinniganLCQAdvantageMax(LCMS-A)、WatersZQ3100系统 (LCMS-B)或Agilent6100SeriesSingleQuadLC/MS(LCMS-C)来产生 LC/MS数据。
LCMS方法A(LCMS-A)
仪器：FinniganLCQAdvantageMax
泵：FinniganSurveyorLC泵
FinniganSurveyor自动取样器
FinniganSurveyorPDA检测器
LC条件：
反相HPLC分析
柱：Gemini3μC1820x4.0mm110A
注射体积10μL
溶剂A：水0.1%甲酸
溶剂B：乙腈0.1%甲酸
梯度：10-100%B，经过10分钟
检测：100-600nm
MS条件：
离子源：离子阱
离子模式：ES阳性
温度：300℃
毛细管V-25
检测：离子计数
扫描范围：80-1000Amu
扫描时间：0.2秒
采集时间：10分钟
LCMS方法B(LCMS-B)
仪器：WatersZQ3100-质量检测器
Waters2545-泵
WatersSFO系统流体组织器
Waters2996二极管阵列检测器
Waters2767样品管理器
LC条件：
反相HPLC分析
柱：XBridgeTMC185μm4.6x100mm
注射体积10μL
溶剂A：水0.1%甲酸
溶剂B：乙腈0.1%甲酸
梯度：10-100%B，经过10分钟
流率：1.5mL/分钟
检测：100-600nm
MS条件：
离子源：单四极杆
离子模式：ES正
源温度：150℃
去溶剂化温度：350℃
检测：离子计数
毛细管(KV)-3.00
锥体(V)：30
提取器(V)：3
RF透镜(V)：0.1
扫描范围：100-1000Amu
扫描时间：0.5秒
采集时间：10分钟
气流
去溶剂化L/小时-650
LCMS方法C(LCMS-C)
仪器：Agilent6100SeriesSingleQuadLC/MS
Agilent1200SeriesHPLC
泵：1200SeriesG1311AQuaternary泵
自动取样器：1200SeriesG1329A恒温自动取样器
检测器：1200SeriesG1314B可变波长检测器
LC条件：
反相HPLC分析
柱：LunaC8(2)5μ50X4.6mm100A
柱温度：30℃
注射体积：5μL
溶剂A：水0.1%甲酸
溶剂B：乙腈0.1%甲酸
梯度：5-100%B，经过10分钟
检测：254nm或214nm
MS条件：
离子源：四极杆
离子模式：多模式-ES
干燥气体温度：300℃
蒸发器温度：200℃
毛细管电压(V)：2000(正)
毛细管电压(V)：4000(负)
扫描范围：100-1000
步长：0.1秒
采集时间：10分钟
在Merck硅胶60F254铝支撑孔板上进行分析型薄层层析，在紫外光 或酸性茴香醛或碱性高锰酸钾浸渍下利用荧光淬灭来使其可视化。使用 TeledyneIscoCombiFlashRf纯化系统使用标准RediSep卡套柱或Biotage Isolera纯化系统使用Grace或Biotage二氧化硅卡套柱，来进行快速层析。
在必要的情况下，无水溶剂是利用Braun纯化系统制备的或购自 Sigma-Aldrich。
实施例1：2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)苯基)乙酰胺(1)
(a)4-(4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I1)
将4-(4′-硝基苯基)哌嗪盐酸盐(5.00g,20.5mmol)溶解于DCM(100mL) 并用三乙胺(7.15mL,51.3mmol)接着用Boc酸酐(4.93g,22.6mmol)处理， 然后在室温下搅拌反应20小时。向混合物添加水(100mL)和DCM(70mL) 并对层加以分离。用DCM(100mL)提取水层，合并有机物，并用盐水(100 mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤和真空浓缩，以产生黄橙色固体。通过硅 胶层析法(BiotageIsolera，120gSi卡套柱，处于石油醚中的0-100%EtOAc， 40-60℃)来纯化产物，以产生标题化合物(I1)(4.895g，78%产率)，作为黄 色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ8.10–8.04(m,2H),7.04–6.97(m, 2H),3.48(m,8H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt6.13min；m/z208.2 [M-Boc+2H]+。
(b)4-(4-氨基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I2)
在氮气氛下将4-(4-硝基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I1)(3.24g,10.5 mmol)溶解于EtOAc(90mL)并添加处于EtOAc(10mL)中的10% Pd/C(0.500g)的淤浆。然后在氢气氛下在室温下剧烈搅拌产生的悬浮液42 小时。通过经由Celite（硅藻土）过滤除去催化剂，用EtOAc(7x10mL) 对其加以洗涤并真空除去溶剂，以产生标题化合物(I2)(2.92g，99%产率)， 为浅粉色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ6.72–6.66(m,2H),6.52– 6.45(m,2H),4.60(s,2H),3.44–3.39(m,4H),2.87–2.79(m,4H),1.41(s, 9H)。LCMS方法C：rt4.40min；m/z278.2[M+H]+。
(c)4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯 (I3)
在0℃下，在1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷混合物(80mL)中搅拌2,4-二 氯-5-(三氟甲基)嘧啶(2.39g,11.0mmol)并经20分钟小心添加处于乙醚 (12.6mL,12.6mmol)中的1.0MZnCl2溶液，然后在0℃下继续搅拌反应 30分钟。在0℃下，经15分钟，滴加处于1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷(40mL) 中的4-(4-氨基苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I2)(2.92g,10.5mmol)的溶液，接着 加入处于1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷(40mL)中的三乙胺(1.76mL,12.6mmol) 溶液，然后允许反应加温至室温并搅拌18小时。真空蒸发有机溶剂并将 粗制黄色油状固体悬浮在水(400mL)中，超声处理悬浮液30分钟并通过 过滤来收集产物，用水(10×20mL)洗涤固体并在高真空下干燥，以产生 标题化合物(I3)(4.75g，98%产率)，为米黄色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ10.45(s,1H),8.72(s,1H),7.50(d,J=8.5Hz,2H),6.96(d,J= 9.0Hz,2H),3.50–3.42(m,4H),3.09–3.02(m,4H),1.42(s,9H)。LCMS方 法C：rt6.56min；m/z456.2,458.1[M-H]-。
(d)4-(4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧 啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I5)
向处于干燥DMF(6mL)中的2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4：按照Peng, C.etal;Adv.Synth.Catal.2008,350,2359–2364或如下文详述的程序制 备)(0.114g,0.653mmol)的氮气脱气溶液中添加三乙胺(0.280mL,2.01 mmol)，接着添加4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧 酸叔丁酯(I3)(0.230g,0.502mmol)、三苯基膦(0.020g,0.075mmol)、反式- 二氯双(三苯基膦)钯(II)(0.035g,0.050mmol)和CuI(0.014g,0.075mmol)。 在微波照射下120℃下加热反应混合物20分钟，然后真空浓缩至干燥并 通过硅胶层析法(BiotageIsolera，40gSi卡套柱，处于环己烷中的0-80% EtOAc)加以纯化，以产生标题化合物(I5)(0.267g，89%产率)，为橙色玻璃 状固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.27(brs,1H),8.76(s,1H),7.65 –7.49(m,4H),7.49–7.38(m,2H),6.95(d,J=9.1Hz,2H),3.94(s,2H), 3.61(s,3H),3.51–3.42(m,4H),3.09–3.00(m,4H),1.42(s,9H)。LCMS方 法C：rt6.67min；m/z596.3[M+H]+。
(e)4-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I6)
在氮气氛下，将4-(4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三 氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I5)(0.250g,0.420mmol) 溶解于EtOAc(8mL)和无水乙醇(10mL)。将处于EtOAc(4mL)中的10% Pd/C(0.200g)加入溶液并将气氛改变为氢气(气球)。用气球密封反应并在 室温下搅拌18小时。通过经由Celite（硅藻土）过滤除去催化剂，并用 EtOAc(7x10mL)对其加以洗涤。真空除去溶剂以产生标题化合物 (I6)(0.211g，84%产率)，为黄色固体。LCMS方法C：rt6.78min；m/z600.3 [M+H]+。
(f)2-(2-(2-(2-((4-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I7)
将LiOH.H2O(0.044g,1.06mmol)加入处于THF(10mL)、水(2.5mL) 和甲醇(1mL)中的4-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I6)(0.211g,0.352mmol)。在40℃ 下，允许搅拌产生的混合物3小时。真空除去挥发物并用EtOAc(100mL) 和2M水NaOH水溶液(100mL)稀释残余物。对层加以分离并用EtOAc(70 mL)提取水层，合并有机层，用盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并 减压浓缩，以产生标题化合物(I7)(0.195g，96%产率)，为黄色固体；1HNMR (400MHz,d6-DMSO)δ10.02(s,1H),8.61(s,1H),7.64–7.55(m,2H),7.26 –7.14(m,4H),6.97–6.91(m,2H),3.65(s,2H),3.50–3.41(m,4H),3.10– 2.93(m,8H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt6.32min；m/z586.3[M+H]+。
(g)4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I8)
在氮气氛下，将2-(2-(2-(2-((4-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)苯基)氨 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I7)(0.195g,0.333mmol)溶 解于干燥THF(10mL)和干燥DMF(2mL)。向溶液添加1-羟基苯并三唑 (0.049g,0.37mmol)和EDCI(0.070g,0.37mmol)以及N,N-二异丙基乙胺 (0.232mL,1.33mmol)，并在室温下搅拌反应混合物10分钟。一次性添加 碳酸铵(0.128g,1.332mmol)，并在室温下搅拌反应20小时。真空除去挥 发物，并用EtOAc(70mL)和饱和NaHCO3水溶液(70mL)稀释残余溶液。 对层加以分离，并用水(70mL)、盐水(70mL)洗涤有机层，干燥(MgSO4)， 过滤并真空浓缩，以产生粗产物，通过硅胶层析法(BiotageIsolera，12gSi 卡套柱，处于石油醚中的0-100%EtOAc，40-60℃，然后处于EtOAc中的 0-10%甲醇)对其加以纯化，以产生标题化合物(I8)(0.133g，68%产率)，为 浅黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.01(s,1H),8.61(s,1H), 7.65–7.56(m,2H),7.44(s,1H),7.26–7.13(m,4H),6.98–6.89(m,3H), 3.52–3.41(m,6H),3.13–2.95(m,8H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt6.18 min；m/z585.3[M+H]+。
(h)2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 苯基)乙酰胺(1)
在氮气氛下，将4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I8)(0.131g,0.224mmol)溶解于 DCM(7mL)。将三氟乙酸(0.857mL,11.2mmol)加入溶液并在室温下搅拌 反应24小时。真空除去挥发物，将EtOAc(70mL)和2MNaOH水溶液(70 mL)加入油并对层加以分离。用EtOAc(50mL)提取水层，用盐水(50mL) 洗涤合并的有机物，干燥(Na2SO4)，过滤并真空浓缩。将产生的固体吸收 在DCM(～5mL)和甲醇(～1mL)中并真空浓缩。仅用DCM重复上述过程两 次，以产生标题化合物(1)(0.104g，96%产率)，为浅黄色固体；1HNMR(400 MHz,d6-DMSO)δ9.96(s,1H),8.60(s,1H),7.61–7.53(m,2H),7.43(brs, 1H),7.25–7.13(m,4H),6.98–6.86(m,3H),3.50(s,2H),3.12–3.05(m, 2H),3.04–2.94(m,6H),2.86–2.78(m,4H)。LCMS方法C：rt4.774min； m/z485.2[M+H]+。
中间体I4：2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)的合成
(a)2-(2-碘苯基)乙酸甲酯(I9)
将2-(2-碘苯基)乙酸(5.00g,19.1mmol)放入反应烧瓶并溶解于 MeOH(150mL)。添加硫酸(250μL)并搅拌反应混合物，然后在80℃下在 氮气下加热16小时。将产生的混合物冷却至室温并通过减压蒸发来除去 挥发物。将残余物吸收在乙酸乙酯(100mL)中，用10%NaHCO3(100mL) 洗涤，干燥(MgSO4)并在减压下蒸发，以产生标题化合物(I9)(5.20g，99%)， 为透明液体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.85(dd,J=7.9,1.0Hz,1H), 7.35–7.27(m,2H),6.97(ddd,J=7.9,7.0,2.1Hz,1H),3.81(s,2H),3.72(s, 3H)。
(b)2-(2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯(I10)
在氮气下，将2-(2-碘苯基)乙酸甲酯(I9)(4.65g,16.8mmol)、 PdCl2(PPh3)2(295mg,421μmol)和Cu(I)I(80.0mg,421μmol)放入烘箱干燥 的反应烧瓶中。添加(三甲基甲硅烷基)乙炔(2.80mL,20.2mmol)、干燥脱 气的THF(20mL)和三乙胺(20mL)，并在室温下搅拌反应混合物16小时。 在减压下除去挥发物以产生黑色残余物，将其吸附到二氧化硅上，然后在 硅胶(0-5%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)上进行层析，以产生标题化合物 (I10)(4.63g，99%)，为浅棕色液体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.48(dd, J=7.5,0.8Hz,1H),7.32–7.14(m,3H),3.84(s,2H),3.71(s,3H),0.26(s, 9H)。LCMS方法C：rt6.64min。
(c)2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)
将2-(2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯(I10)(4.63g,19.0 mmol)溶解于DCM(200mL)并在0℃下添加TBAF(1.0M，在THF中)(28.5 mL,28.5mmol,1.5eq)。在用10%NaHCO3(100mL)洗涤以前，在室温下搅 拌产生的溶液1小时。干燥(MgSO4)有机层，然后在减压下蒸发，以产生 暗棕色/黑色残余物。将残余物吸附到二氧化硅上，然后在硅胶(0-10%乙酸 乙酯/石油醚，40-60℃)上进行层析，以产生标题化合物(I4)(2.76g，83%)， 为红色液体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.52(dd,J=7.6,1.1Hz,1H), 7.43–7.16(m,3H),3.88(d,J=9.6Hz,2H),3.77–3.52(m,3H),3.28(s, 1H)。
实施例2：3-(2-(2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶 -4-基)乙基)苯甲酰胺(2)
(a)1-甲基-4-(4-硝基苯基)哌嗪(I11)
在微波容器中，向4-(4′-硝基苯基)哌嗪盐酸盐(1.00g,4.10mmol)添加 甲酸(1.55mL,41.0mmol)和37%甲醛水溶液(3.06mL,41.0mmol)，并在 120℃下加热反应3分钟。向冷却的反应混合物添加EtOAc(100mL)和2M NaOH水溶液(70mL)。对层加以分离并用盐水(50mL)洗涤有机层。对层 加以分离并用EtOAc(50mL)提取盐水水层，合并有机层并干燥(Na2SO4)， 过滤和真空浓缩，以产生粗产物，通过硅胶层析法(BiotageIsolera，40gSi 卡套柱，处于EtOAc中的0-60%甲醇(包含1%氨溶液))对其加以纯化，以 产生标题化合物(I11)(0.636g，70%产率)，为黄色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ8.07–8.01(m,2H),7.05–6.99(m,2H),3.48–3.40(m,4H), 2.46–2.39(m,4H),2.21(s,3H)。LCMS方法C：rt1.45min；m/z222.2 [M+H]+。
(b)1-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺(I12)
在氮气氛下将1-甲基-4-(4-硝基苯基)哌嗪(I11)(0.632g,2.86mmol)溶 解于EtOAc(45mL)，并添加处于EtOAc(5mL)中的10%Pd/C(0.200g)的淤 浆。然后在氢气氛下在室温下剧烈搅拌产生的悬浮液18小时。通过经由 Celite（硅藻土）过滤除去催化剂，用EtOAc(7x10mL)对其加以洗涤并真 空除去溶剂，以产生标题化合物(I12)(0.537g，98%产率)，为粉色固体； 1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ6.70–6.64(m,2H),6.51–6.45(m,2H), 4.54(s,2H),2.94–2.84(m,4H),2.46–2.36(m,4H),2.19(s,3H)。LCMS方 法C：rt0.98min；m/z192.3[M+H]+。
(c)4-氯-2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶(I13)
在冰浴中在氮气下，向处于THF(50mL)中的2,4-二氯-5-(三氟甲基) 嘧啶(2.50g,11.5mmol)溶液滴加氯化锌(II)(1.0M，在醚中，13.8mL，13.8 mmol)。在冰浴中搅拌混合物两小时，然后添加甲硫醇钠(0.888g,12.7 mmol)。搅拌混合物过夜，从而允许反应缓慢达到室温。在18小时以后， 用2MHCl(15mL)淬灭反应，并通过减压蒸发来除去有机物。用盐水(15 mL)稀释残余物水溶液，并用DCM(3x30mL)萃取。干燥(相分离器)合并的 有机相并小心蒸发以产生浅黄色油。层析分离(BiotageIsolera，2x40g二氧 化硅卡套柱，0-20%DCM/正己烷)，接着小心蒸发溶剂(40℃400mmHg， 然后室温200mmHg)，产生标题化合物(I13)(2.149g，82%产率)，为无色 油；1HNMR(600MHz,CDCl3)δ8.66(s,1H),2.61(s,3H)。LCMS方法C： rt:7.95min;m/z229.1[M+H]+。注意：I13是挥发性的。
(d)4-碘-2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶(I14)
将4-氯-2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶(I13)(5.00g,21.9mmol)放入反 应烧瓶中，然后添加碘化钠(9.80g,65.6mmol)和氢碘酸(58%;70mL)。在 黑暗中，搅拌反应混合物48小时，然后用水(200mL)稀释，从而沉淀出 无色固体。通过过滤来收集沉淀物并用10%NaHCO3溶液洗涤直到中性。 用水(100mL)洗涤产生的固体，然后抽吸干燥2小时，以产生标题化合物 (I14)(3.956g，57%)，为浅黄色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.42(s, 1H),2.58(s,3H)。LCMS方法C：rt6.30min,m/z321.0[M+H]+。
(e)3-碘苯甲酸叔丁酯(I15)
向处于DCM(25mL)中的3-碘苯甲酸(5.06g,20.4mmol)的溶液添加 处于二氯甲烷(10mL)中的Boc2O(4.90g,22.5mmol)溶液和处于二氯甲烷 (5mL)中的4-DMAP(0.624g,5.11mmol)。在室温下在氮气氛下，搅拌产生 的溶液64小时。在水(100mL)和二氯甲烷(50mL)之间分配产生的混合物 并分离多个层。在减压浓缩以前，用水(2x100mL)洗涤有机层。利用硅胶 柱层析法(0-50%二氯甲烷/石油醚，40-60℃)来纯化产生的残余物，以产生 标题化合物(I15)(65%，4.02g)，为无色油；1HNMR(400MHz,CDCl3) 8.30(dd,J=1.6,1.6Hz,1H),7.95(ddd,J=7.8,1.5,1.1Hz,1H),7.85(ddd,J =7.9,1.8,1.1Hz,1H),7.16(ddd,J=7.8,7.8,0.2Hz,1H),1.59(s,9H)。 LCMS方法C：rt6.88min。
(f)3-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯甲酸叔丁酯(I16)
在氮气氛下，将3-碘苯甲酸叔丁酯(I15)(4.02g,13.2mmol)、 Pd(PPh3)4(0.38g,0.33mmol)和碘化铜(I)(0.13g,0.68mmol)的混合物溶解 于无水THF(50mL)，并通过使氮气鼓泡通过它来将产生的溶液脱气。添 加三乙胺(9.2mL,66mmol)，然后，在添加TMS-乙炔(3.8mL,27mmol)以 前，搅拌混合物10分钟。然后搅拌产生的混合物18小时。在减压下浓缩 混合物并利用硅胶柱层析法(0-10%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)加以纯化， 以产生标题化合物(I16)(3.57g，99%)，为乳膏结晶固体；1HNMR(400MHz, CDCl3) 8.06(ddd,J=1.7,1.7,0.5Hz,1H),7.92(ddd,J=7.9,1.3,1.3Hz, 1H),7.60(ddd,J=7.7,1.4,1.4Hz,1H),7.35(ddd,J=7.8,7.8,0.5Hz,1H), 1.59(s,9H),0.26(s,9H)。LCMS方法C：rt7.46min。
(g)3-乙炔基苯甲酸叔丁酯(I17)
在0℃下在氮气下，向处于THF(100mL)中的3-((三甲基甲硅烷基) 乙炔基)苯甲酸叔丁酯(I16)(4.40g,16.0mmol)溶液添加处于THF(20.0mL, 20.0mmol)中的1.0MTBAF。然后在0℃下搅拌混合物1小时，接着在室 温下搅拌混合物16小时。然后在减压下浓缩混合物，用乙酸乙酯(100mL) 稀释并用水(3x100mL)洗涤。然后利用硅胶柱层析法(0-5%EtOAc/石油醚， 40-60℃)来纯化有机提取物，以产生标题化合物(I17)(2.72g，84%)，为浅 黄色油；1HNMR(400MHz,CDCl3) 8.09(dd,J=1.5,1.5Hz,1H),7.97 (ddd,J=7.9,1.5,1.5Hz,1H),7.63(ddd,J=7.7,1.4,1.4Hz,1H),7.38(ddd,J =7.8,7.8,0.5Hz,1H),3.11(s,1H),1.59(s,9H)。
(h)3-((2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯甲酸叔丁酯(I18)
在DMF(20mL)中合并3-乙炔基苯甲酸叔丁酯(I17)(1.603g,7.93 mmol)、4-碘-2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶(I14)(1.647g,5.15mmol)、 PdCl2(PPh3)2(0.316g,0.45mmol)、PPh3(0.355g,1.35mmol)、Cu(I)I(0.232g, 1.22mmol)和三乙胺(4.00mL,28.7mmol)，并在120℃下在微波照射下加 热产生的混合物25分钟。然后在减压下浓缩混合物并利用硅胶柱层析法 (10-20%EtOAc/石油醚，40-60℃，然后50-100%DCM/石油醚，40-60℃) 来纯化两次，以产生标题化合物(I18)(0.624g，31%)，为黄色固体；1HNMR (400MHz,CDCl3)δ8.73(d,J=0.8Hz,1H),8.25(m,1H),8.08(m,1H),7.78 (m,1H),7.48(m,1H),2.63(s,3H),1.61(s,9H)。
(i)3-(2-(2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酸叔丁酯(I19)
将3-((2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯甲酸叔丁酯 (I18)(0.624g,1.58mmol)和10%Pd/C(0.206g)吸收在THF(20mL)中并在室 温下在氢气氛下搅拌20小时以前，使H2鼓泡通过混合物5分钟。通过 Celite（硅藻土）来过滤混合物并在减压下浓缩。分别用10%Pd/C(0.212g) 和20%Pearlman的催化剂(0.316g)重复此程序两次，以产生标题化合物 (I19)，为黄色油，其用于反应而没有进一步纯化。LCMS方法C：rt7.14min。
(j)3-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酸叔丁酯 (I20)
在0℃下，将3-(2-(2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酸叔 丁酯(I19)(0.630g,1.58mmol)和MCPBA(0.975g,3.96mmol)的混合物溶解 于DCM(20mL)。允许产生的溶液加温至室温，在该温度下继续搅拌16 小时。在减压下蒸发挥发物并用DCM来研磨残余物。过滤产生的悬浮液 并蒸发滤液至干燥。用DCM来第二次研磨残余物并经由过滤除去沉淀物。 蒸发滤液至干燥并利用硅胶柱层析法(20-100%DCM/石油醚，40-60℃， 0-50%EtOAc/石油醚，40-60℃)来纯化残余物，以产生标题化合物 (I20)(0.360g，53%)，为黄色半固体，纯度为70%（通过NMR）；1HNMR (400MHz,CDCl3)δ9.06(s,1H),7.85(m,2H),7.38(m,2H),3.42(m,2H), 3.36(s,3H),3.24(m,2H),1.60(s,10H)。LCMS方法C：rt6.40min；m/z357.1 [M-t-BuO]+,453.1[M+Na]+。
(k)3-(2-(2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯甲酸叔丁酯(I21)
在微波容器中合并1-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺(I12)(0.071g,0.372 mmol)、3-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酸叔丁酯 (I20)(0.100g,0.232mmol)和对甲苯磺酸一水合物(0.088g,0.465mmol)并 添加干燥的二氧杂环己烷(3mL)。在微波照射下在150℃下加热反应30 分钟，然后真空浓缩并通过硅胶层析法(BiotageIsolera，12gSi卡套柱， 处于石油醚中0-100%EtOAc，40-60℃，然后为处于EtOAc中的0-100% MeOH)来纯化，以产生浅黄色固体。将该固体溶解于EtOAc(20mL)和饱 和NaHCO3水溶液(10mL)并对层加以分离。用EtOAc(20mL)提取水层， 合并有机物并用水(20mL)、盐水(20mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空 浓缩，以产生标题化合物(I21)(0.025g，20%产率)，为浅黄色固体；1HNMR (400MHz,d6-DMSO)δ9.98(s,1H),8.59(s,1H),7.76–7.69(m,2H),7.57– 7.37(m,4H),6.90(d,J=9.1Hz,2H),3.19–3.00(m,8H),2.48–2.40(m, 4H),2.21(s,3H),1.52(s,9H)。LCMS方法C：rt5.41min；m/z542.3[M+H]+。
(l)3-(2-(2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙 基)苯甲酰胺(2)
在氮气氛下，将3-(2-(2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯甲酸叔丁酯(I21)(0.025g,0.046mmol)溶解于干燥 DCM(3mL)。将三氟乙酸(0.177mL,2.31mmol)加入溶液并在35℃下搅拌 反应2小时。浓缩混合物至干燥，将甲苯(～2mL)加入残余物并真空除去 溶剂，以产生黄色固体。在氮气氛下，将此材料溶解于干燥THF(3mL)和 干燥DMF(0.2mL)中。向该溶液添加1-羟基苯并三唑(0.009g,0.064mmol) 和EDCl(0.012g,0.064mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.048mL,0.276mmol) 并在室温下搅拌反应混合物10分钟。一次性添加碳酸铵(0.018g,0.18 mmol)，并在室温下搅拌反应20小时。在真空下除去挥发物并用EtOAc(20 mL)和饱和NaHCO3水溶液(10mL)稀释残余溶液。对层加以分离并用水(10 mL)、盐水(10mL)洗涤有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生 浅黄色固体。将该产物溶解于DCM(～4mL)和MeOH(～1mL)并在真空下除 去溶剂。仅用DCM重复上述过程3次，以产生标题化合物(2)(0.017g，76% 产率，经过2个步骤)，为浅黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.97 (s,1H),8.60(s,1H),7.95(brs,1H),7.79(s,1H),7.75–7.66(m,1H),7.57– 7.47(m,2H),7.40–7.30(m,3H),6.94–6.86(m,2H),3.14–3.01(m,8H), 2.47–2.42(m,4H),2.21(s,3H)。LCMS方法C：rt4.75min；m/z485.3 [M+H]+。
实施例3：2-(2-(2-(2-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(3)
在氮气氛下，向处于无水甲醇(1.5mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基) 苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(1)(0.015g,0.031 mmol)的悬浮液添加37%的甲醛水溶液(0.005mL,0.062mmol)，接着加入 三乙酰氧基硼氢化钠(0.033g,0.155mmol)。在室温下搅拌反应1.5小时， 在真空下除去挥发物并用EtOAc(15mL)和饱和NaHCO3水溶液(10mL)稀 释残余物。对层加以分离并用EtOAc(2x10mL)提取水层，用水(10mL)、 盐水(10mL)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生 标题化合物(3)(14.5mg，97%产率)，为浅黄色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ9.97(s,1H),8.60(s,1H),7.57(d,J=9.0Hz,2H),7.43(s,1H), 7.26–7.13(m,4H),6.96–6.87(m,3H),3.50(s,2H),3.12–3.03(m,6H), 3.03–2.94(m,2H),2.47–2.42(m,4H),2.22(s,3H)。LCMS方法C：rt4.74 min；m/z499.3[M+H]+。
实施例4：2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)苯基)乙酰胺(4)
(a)3-(4-硝基苯基)吡啶(I22)
向处于氮气脱气的干燥DMF(20mL)中的1-碘-4-硝基苯(1.00g,4.02 mmol)的溶液添加3-吡啶硼酸(0.592g,4.82mmol)、Cs2CO3(5.23g,16.1 mmol)、三苯基膦(0.158g,0.602mmol)和Pd(OAc)2(0.090g,0.40mmol)。 在80℃下加热反应混合物18小时，冷却至室温并真空浓缩至干燥。通过 硅胶层析法(BiotageIsolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中的20-100% EtOAc，40-60℃)来纯化粗材料，以产生标题化合物(I22)(0.590g，73%产 率)，为黄色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.90(d,J=1.8Hz,1H),8.70 (dd,J=4.8,1.5Hz,1H),8.39–8.32(m,2H),7.93(ddd,J=7.9,2.4,1.7Hz, 1H),7.78–7.72(m,2H),7.44(ddd,J=7.9,4.8,0.8Hz,1H)。LCMS方法C： rt4.62min；m/z201.1[M+H]+。
(b)3-(4-氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I23)
在氮气氛下，向处于1MHCl(3mL)和甲醇(30mL)中的3-(4-硝基苯 基)吡啶(I22)(0.590g,2.947mmol)的溶液添加PtO2(0.059g)。然后在Parr 氢化器中对反应施加40psi氢气氛持续24小时，通过过滤除去催化剂， 并真空除去溶剂。将产生的黄色固体再次溶解于1MHCl(3mL)和甲醇(30 mL)并在氮气氛下添加PtO2(0.059g)。在Parr氢化器中对反应施加40psi 氢气氛持续24小时，经由Celite（硅藻土）来过滤反应混合物，用EtOAc(3 x10mL)和水(3x10mL)对其加以洗涤并真空浓缩滤液，以产生粗材料 (0.720g)，为浅棕色玻璃状固体。将此材料溶解于DCM(25mL)、DMF(5mL) 和甲醇(20mL)中，并用三乙胺(1.438mL,10.315mmol)接着用Boc酸酐 (0.675g,3.094mmol)加以处理。在室温下搅拌反应20小时，然后真空浓 缩并添加EtOAc(100mL)和饱和NaHCO3水溶液(50mL)，接着对层加以分 离。用EtOAc(70mL)提取水层，合并有机物并用水(100mL)、盐水(100 mL)、水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥(Na2SO4)，过滤然后真空浓缩， 以产生粉色泡沫。通过硅胶层析法(BiotageIsolera，40gSi卡套柱，处于 石油醚中的0-55%EtOAc，40-60℃)来纯化上述粗产物，以产生标题化合 物(I23)(0.435g，53%产率，经过2个步骤)，为粉色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ6.91–6.86(m,2H),6.52–6.47(m,2H),4.88(s,2H),3.99– 3.80(m,2H),2.80–2.54(m,2H),2.37(tt,J=11.6,3.7Hz,1H),1.85–1.75 (m,1H),1.70–1.62(m,1H),1.53(ddd,J=24.4,12.4,3.3Hz,1H),1.46– 1.33(m,10H)。LCMS方法C：rt4.86min；m/z177.2[M-Boc+2H]+。
(c)3-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯 (I24)
在0℃下，在1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷混合物(30mL)中搅拌2,4-二 氯-5-(三氟甲基)嘧啶(0.355g,1.64mmol)并经20分钟小心添加处于乙醚 (1.87mL,1.87mmol)中的1.0MZnCl2溶液，接着在0℃下继续搅拌反应 30分钟。在0℃下经15分钟滴加处于1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷(10mL) 中的3-(4-氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I23)(0.431g,1.56mmol)的溶液，接 着加入处于1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷(10mL)中的三乙胺(0.261μL,1.871 mmol)溶液。允许反应加温至室温并搅拌60小时。真空蒸发挥发物并将产 生的油状残余物悬浮于水(200mL)，超声处理悬浮液30分钟并通过过滤 来收集产物，用水(5x10mL)洗涤固体并在高真空下干燥，以产生标题化 合物(I24)(0.638g，90%产率)，为浅粉色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO) δ10.62(s,1H),8.78(s,1H),7.61(d,J=8.5Hz,2H),7.26(d,J=8.6Hz,2H), 4.05–3.87(m,2H),2.94–2.63(m,2H),2.57(ddd,J=11.2,7.7,3.7Hz,1H), 1.87(d,J=12.8Hz,1H),1.75–1.54(m,2H),1.51–1.35(m,10H)。LCMS 方法C：rt6.89min；m/z455.3M-H]-。
(d)3-(4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧 啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I25)
向处于干燥DMF(7mL)中的2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)(0.137g, 0.788mmol)的氮气脱气的溶液添加三乙胺(0.366mL,2.63mmol)，接着加 入3-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯 (I24)(0.300g,0.657mmol)、三苯基膦(0.026g,0.098mmol)、反式-二氯二(三 苯基膦)钯(II)(0.046g,0.066mmol)和CuI(0.019g,0.098mmol)。在微波照 射下在120℃下加热反应混合物20分钟，然后真空浓缩至干燥并通过硅 胶层析法(BiotageIsolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中的0-70%EtOAc， 40-60℃)加以纯化，以产生标题化合物(I25)(0.310g，79%产率)，为黄色 粘性油；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.44(s,1H),8.81(s,1H),7.73– 7.60(m,3H),7.54(td,J=7.6,1.3Hz,1H),7.50–7.34(m,2H),7.24(d,J= 8.6Hz,2H),4.02–3.87(m,4H),3.61(s,3H),2.90–2.51(m,4H),1.88(d,J =12.0Hz,1H),1.76–1.55(m,2H),1.51–1.34(m,10H)。LCMS方法C：rt 6.98min；m/z539.2[M-C4H9(t-Bu)+H]+。
(e)3-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I26)
在氮气氛下，将3-(4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三 氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I25)(0.302g,0.508mmol) 溶解于EtOAc(12mL)和无水乙醇(8mL)。将处于EtOAc(4mL)中的10% Pd/C(0.250g)加入溶液并将气氛改变成氢气(气球)。用气球密封反应并在 室温下搅拌18小时，其后通过经由Celite（硅藻土）过滤除去催化剂并真 空除去溶剂。在氮气氛下，将产生的固体再次溶解于EtOAc(12mL)和无 水乙醇(8mL)，将处于EtOAc(4mL)中的10%Pd/C(0.250g)加入溶液，并 将气氛改变成氢气(气球)。用气球密封反应并在室温下搅拌24小时。通过 经由Celite（硅藻土）过滤来除去催化剂，用EtOAc(7x10mL)对其加以 洗涤，并真空除去溶剂，以产生浅黄色粘性油。通过硅胶层析法(Biotage Isolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中0-50%EtOAc，40-60℃)来纯化粗 产物，以产生标题化合物(I26)(0.249g，82%产率)，为浅黄色粘性油；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.18(s,1H),8.67(s,1H),7.72–7.64(m,2H), 7.26–7.16(m,6H),4.02–3.89(m,2H),3.76(s,2H),3.57(s,3H),3.10– 2.95(m,4H),2.91–2.66(m,2H),2.61–2.51(m,1H),1.88(d,J=11.8Hz, 1H),1.75–1.54(m,2H),1.43(m,10H)。LCMS方法C：rt7.11min；m/z599.3 [M+H]+。
(f)2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I27)
将LiOH.H2O(0.052g,1.25mmol)加入处于THF(10mL)、水(2.5mL) 和甲醇(1mL)中的3-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I26)(0.249g,0.416mmol)。在 40℃下允许搅拌产生的混合物2小时，然后在室温下搅拌20小时。真空 除去挥发物并用EtOAc(70mL)和2MNaOH水溶液(50mL)稀释残余物。 对层加以分离并用EtOAc(70mL)提取水层，合并有机层，用盐水(70mL) 洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并在减压下浓缩，以产生标题化合物(I27)(0.250 g，100%产率)，为灰白色油状固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.23 (s,1H),8.64(s,1H),7.72–7.60(m,2H),7.25–7.00(m,6H),4.01–3.88(m, 2H),3.48(s,2H),3.13–2.92(m,4H),2.86–2.63(m,2H),1.91–1.81(m, 1H),1.72–1.54(m,2H),1.48–1.34(m,10H)。LCMS方法C：rt6.71min； m/z585.3[M+H]+。
(g)3-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I28)
在氮气氛下，将2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-3-基)苯基)氨 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I27)(0.246g,0.416mmol)溶 解于干燥THF(10mL)和干燥DMF(2mL)。向此溶液添加1-羟基苯并三唑 (0.067g,0.50mmol)、EDCl(0.096g,0.50mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.290 mL,1.66mmol)，并在室温下搅拌反应混合物10分钟。一次性添加碳酸铵 (0.160g,1.66mmol)，并在室温下搅拌反应45小时。真空除去挥发物并用 EtOAc(70mL)和饱和NaHCO3水溶液(70mL)稀释残余溶液。对层加以分 离并用EtOAc(70mL)提取水层，用水(70mL)、盐水(70mL)洗涤合并的有 机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生灰白色固体。通过硅胶层 析法(BiotageIsolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中0-100%EtOAc， 40-60℃，然后处于EtOAc中0-10%甲醇)来纯化粗产物，以产生标题化合 物(I28)(0.186g，77%产率)，为白色固体：1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ 10.17(s,1H),8.67(s,1H),7.69(d,J=8.6Hz,2H),7.44(brs,1H),7.28– 7.11(m,6H),6.93(brs,1H),4.02–3.89(m,2H),3.50(s,2H),3.15–3.07(m, 2H),3.06–2.98(m,2H),2.89–2.67(m,2H),2.61–2.51(m,1H),1.88(d,J =11.1Hz,1H),1.74–1.55(m,2H),1.50–1.35(m,10H)。LCMS方法C：rt 6.57min；m/z584.3[M+H]+。
(h)2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 苯基)乙酰胺(4)
在氮气氛下，将3-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I28)(0.184g,0.315mmol)溶解于 DCM(10mL)。将三氟乙酸(1.21mL,15.8mmol)加入溶液并在室温下搅拌 反应1小时。真空除去挥发物，将EtOAc(100mL)和2MNaOH水溶液(70 mL)加入残余物并对层加以分离。用EtOAc(70mL)提取水层，用水(50mL)、 盐水(50mL)洗涤合并的有机物，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生 白色固体。将固体吸收在DCM(～7mL)和甲醇(～1mL)中并真空浓缩。仅用 DCM重复上述过程两次，以产生标题化合物(4)(0.110g，72%产率)，为白 色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.13(s,1H),8.65(s,1H),7.69– 7.62(m,2H),7.44(s,1H),7.26–7.12(m,6H),6.93(s,1H),3.50(s,2H),3.15 –3.06(m,2H),3.06–2.90(m,4H),2.60–2.43(m,3H),1.85(d,J=11.1Hz, 1H),1.69–1.61(m,1H),1.61–1.41(m,2H)。残余DMSO遮掩了3个脂族 质子。LCMS方法C：rt4.81min；m/z484.3[M+H]+。
实施例5：2-(2-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(5)
在氮气氛下，向处于无水甲醇(2mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-3-基) 苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(4)(0.021g,0.043 mmol)的悬浮液添加37%的甲醛水溶液(0.006g,0.195mmol)，接着加入三 乙酰氧基硼氢化钠(0.046g,0.217mmol)。在室温下搅拌反应1小时，真空 除去挥发物并用EtOAc(15mL)和饱和NaHCO3水溶液(10mL)稀释残余 物。对层加以分离并用EtOAc(15mL)提取水层，用水(10mL)、盐水(10mL) 洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生标题化合物 (5)(20mg，93%产率)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz,d4-MeOD)δ8.54 (s,1H),7.62(d,J=8.5Hz,2H),7.30–7.15(m,6H),3.67(s,2H),3.19–3.12 (m,2H),3.12–3.02(m,2H),2.96(d,J=11.1Hz,2H),2.85–2.74(m,1H), 2.34(s,3H),2.13–2.03(m,2H),1.96–1.67(m,3H),1.49(ddd,J=24.8, 12.5,3.9Hz,1H)。LCMS方法C：rt4.86min；m/z498.3[M+H]+。
实施例6：3-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶 -4-基)乙基)苯甲酰胺(6)
(a)3-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯甲酸叔丁酯(I29)
在微波照射下，加热处于二氧杂环己烷(3.0mL)中的3-(2-(2-(甲基磺 酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酸叔丁酯(I20)(0.072g,0.17 mmol)、对甲苯磺酸一水合物(0.044g,0.231mmol)、和3-(4-甲基哌嗪基-1- 基)苯胺(0.055g,0.29mmol)的混合物至140-150℃，持续30分钟。然后在 减压下浓缩混合物并利用硅胶柱层析法(0-10%MeOH/EtOAc，具有1% NH3水溶液)加以纯化，以产生标题化合物(I29)(0.048g，52%)；1HNMR (400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.88(s,1H),7.84(ddd,J=7.4,1.6,1.6Hz, 1H),7.37(m,4H),7.23(m,1H),7.04(dd,J=7.9,1.4Hz,1H),6.69(dd,J= 8.2,1.8Hz,1H),3.27(m,4H),3.14(m,4H),2.58(m,4H),2.35(s,3H),1.59 (s,9H)。LCMS方法C：rt5.45min；m/z542.3[M+H]+。
(b)3-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯甲酸(I30)
向处于DCM(3mL)中的3-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酸叔丁酯(I29)(0.048g,0.088mmol) 的溶液添加TFA(0.5mL)；然后在减压浓缩以前在室温下搅拌反应35分钟。 将残余物吸收在甲苯(2x10mL)中并在减压下浓缩。将产生的残余物吸收 在DCM(3mL)中并添加TFA(0.5mL)。在室温下搅拌产生的溶液1小时， 然后通过减压蒸发除去挥发物。将残余物吸收在甲苯(2x20mL)中并在减 压下浓缩，以产生定量产率的标题化合物(I30)；1HNMR(400MHz,d6-丙 酮)δ9.14(s,1H),8.62(s,1H),7.96(s,1H),7.89(d,J=7.7Hz,1H),7.74(bs, 1H),7.54(d,J=7.7Hz,1H),7.44(dd,J=7.6,7.6Hz,1H),7.34(bd,J=8.0 Hz,1H),7.25(dd,J=8.1,8.1Hz,1H),6.77(dd,J=8.1,1.8Hz,1H),3.60(m, 4H),3.47(m,4H),3.20(m,4H),2.94(s,3H)。LCMS方法C：rt4.93min； m/z486.2[M+H]+。
(c)3-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯甲酰胺(6)
向处于DMF(2mL)中的3-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酸(I30)(0.048g,0.10mmol)和 HATU(0.051g,0.13mmol)的溶液添加DIPEA(0.068mL,0.39mmol)，然后 在添加NH4OH(0.2mL)以前搅拌产生的溶液10分钟。然后在室温下搅拌 产生的混合物过夜(16小时)。用水稀释混合物并用EtOAc(2x20mL)萃取。 在减压浓缩以前，利用相分离卡套柱来干燥合并的有机提取物。然后利用 硅胶柱层析法(0-30%MeOH/EtOAc，具有处于MeOH中的1%NH4OH)来 纯化有机残余物，以产生标题化合物(6)(0.028mg，58%)，为白色固体；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.07(s,1H),8.67(s,1H),7.95(s,1H),7.78(s, 1H),7.72(m,1H),7.54(s,1H),7.38(m,2H),7.34(m,1H),7.14(d,J=5.2 Hz,2H),6.64(m,1H),3.10(m,8H),2.42(m,4H),2.19(s,3H)。LCMS方法 C：rt4.80min；m/z485.3[M+H]+。
实施例7：2-(2-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(7)
(a)3-乙炔基苯甲酸甲酯(I31)
将3-乙炔基苯甲酸叔丁酯(I17)(1.50g,9.37mmol)溶解于干燥 DCM(70mL)并小心添加TFA(35.9mL,468mmol)。在室温下搅拌反应3 小时，真空浓缩并添加甲苯，然后在真空下除去，以产生浅黄色固体。将 此材料溶解于甲醇(50mL)，添加浓H2SO4(～1mL)并在65℃下搅拌产生的 溶液20小时。在冷却至室温以后，真空除去挥发物并用EtOAc(200mL) 稀释残余物，然后缓慢添加饱和NaHCO3水溶液(100mL)。对层加以分离 并用EtOAc(200mL)提取水层，合并有机层并用水(100mL)、盐水(100mL) 洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生标题化合物(I31)(1.136g， 96%产率，经过2个步骤)，为浅黄色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.17 (t,J=1.5Hz,1H),8.03–8.00(m,1H),7.66(dt,J=7.7,1.4Hz,1H),7.41(td, J=7.8,0.4Hz,1H),3.93(s,3H),3.12(s,1H)。LCMS方法C：rt5.84min。
(b)4-(4-((4-((3-(甲氧基羰基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I32)
向处于干燥DMF(6mL)中的3-乙炔基苯甲酸甲酯(I31)(0.105g,0.655 mmol)的氮气脱气的溶液添加三乙胺(0.308mL,2.18mmol)，接着加入 4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I3)(0.250 g,0.546mmol)、三苯基膦(0.021g,0.082mmol)、反式-二氯二(三苯基膦) 钯(II)(0.038g,0.055mmol)和Cu(I)I(0.016g,0.082mmol)。在微波照射下在 120℃下加热反应混合物20分钟，真空浓缩至干燥并通过硅胶层析法 (BiotageIsolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中0-50%EtOAc，40-60℃) 加以纯化，以产生标题化合物(I32)(0.182g，57%产率)，为橙色固体；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.28(brs,1H),8.78(s,1H),8.16–8.03(m, 2H),7.90(d,J=7.8Hz,1H),7.69(t,J=7.9Hz,1H),7.55(d,J=9.0Hz,2H), 6.96(d,J=9.0Hz,2H),3.90(s,3H),3.50–3.41(m,4H),3.11–2.99(m,4H), 1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt6.82min；m/z582.2[M+H]+。
(c)4-(4-((4-(3-(甲氧基羰基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯 基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I33)
在氮气氛下，将4-(4-((4-((3-(甲氧基羰基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I32)(0.180g,0.309mmol)溶解于 干燥DMF(10mL)。将处于EtOAc(10mL)中的10%Pd/C(0.100g)加入溶液 并将气氛改变成氢气(气球)。用气球密封反应并在室温下搅拌18小时，其 后，用氮气冲洗反应并添加处于EtOAc(5mL)中的Pearlman催化剂(0.150 g)。将气氛再次改变成氢气(气球)并用气球密封反应，接着在室温下搅拌 20小时。通过经由Celite（硅藻土）过滤除去催化剂，用EtOAc(5x10mL) 对其加以洗涤。真空除去溶剂以产生黄色油，通过硅胶层析法(Biotage Isolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中0-40%EtOAc，40-60℃)对其加以 纯化，以产生标题化合物(I33)(0.120g，66%产率)，为黄色泡沫；1HNMR (400MHz,d6-DMSO)δ10.01(s,1H),8.60(s,1H),7.88–7.77(m,2H),7.61 –7.39(m,4H),6.93(d,J=9.1Hz,2H),3.85(s,3H),3.52–3.42(m,4H), 3.21–2.99(m,8H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt6.86min；m/z586.3 [M+H]+。
(d)3-(2-(2-((4-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯甲酸锂(I34)
将LiOH.H2O(0.025g,0.60mmol)加入处于THF(7mL)、水(1.5mL)和 甲醇(1mL)中的4-(4-((4-(3-(甲氧基羰基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I33)(0.117g,0.200mmol)。在室温下允许搅 拌产生的混合物17小时，真空除去挥发物，并用EtOAc(100mL)和饱和 NaHCO3水溶液(80mL)稀释残余物。对层加以分离并用EtOAc(2x80mL) 提取水层，合并有机层，用盐水(70mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并在减 压下浓缩，以产生标题化合物(I34)(0.105g，91%产率)，为浅黄色固体； 1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.00(s,1H),8.60(s,1H),7.85–7.74(m, 2H),7.56–7.48(m,2H),7.47–7.35(m,2H),6.93(d,J=9.1Hz,2H),3.50– 3.41(m,4H),3.17–2.98(m,8H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt6.30min； m/z572.3[M+H]+。
(e)4-(4-((4-(3-氨甲酰基苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌 嗪-1-羧酸叔丁酯(I35)
在氮气氛下，将3-(2-(2-((4-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)苯基)氨 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯甲酸锂(I34)(0.100g,0.173mmol)溶解 于干燥THF(7mL)和干燥DMF(1mL)。向该溶液添加1-羟基苯并三唑 (0.028g,0.21mmol)、EDCl(0.040g,0.21mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.121 mL,0.693mmol)，并在室温下搅拌反应混合物10分钟。一次性添加碳酸 铵(0.067g,0.69mmol)，并在室温下搅拌反应60小时。在真空下除去挥发 物并用EtOAc(70mL)和饱和NaHCO3水溶液(70mL)稀释残余溶液。对层 加以分离并用EtOAc(70mL)提取水层，用水(70mL)、盐水(70mL)洗涤合 并的有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生灰白色固体。通过 硅胶层析法(BiotageIsolera，12gSi卡套柱，处于石油醚中0-100%EtOAc， 40-60℃)来纯化粗产物，以产生标题化合物(I35)(0.073g，74%产率)，为灰 白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.00(s,1H),8.61(s,1H),7.95 (s,1H),7.79(s,1H),7.75–7.68(m,1H),7.54(d,J=8.6Hz,2H),7.40–7.29 (m,3H),6.93(d,J=9.1Hz,2H),3.50–3.41(m,4H),3.14–3.00(m,8H), 1.42(s,9H)。
(f)2-(2-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯基)乙酰胺(7)
在氮气氛下，将4-(4-((4-(3-氨基甲酰基苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2- 基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I35)(0.070g,0.12mmol)溶解于DCM(5 mL)。将三氟乙酸(0.282mL,3.68mmol)加入溶液并在室温下搅拌反应18 小时。在真空下除去挥发物，将EtOAc(50mL)和2MNaOH水溶液(50mL) 加入残余物并对层加以分离。用EtOAc(50mL)提取水层，用水(50mL)、 盐水(50mL)洗涤合并的有机物，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生 浅黄色固体。将固体吸收在DCM(～10mL)和甲醇(～1mL)中并真空浓缩。 仅用DCM重复上述过程两次，以产生标题化合物(7)(0.043g，75%产率)， 为浅黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.96(s,1H),8.60(s,1H), 7.95(s,1H),7.79(s,1H),7.74–7.66(m,1H),7.56–7.47(m,2H),7.40– 7.29(m,3H),6.94–6.82(m,2H),3.15–2.96(m,8H),2.86–2.79(m,4H)。 LCMS方法C：rt4.71min；m/z471.2[M+H]+。
实施例8：2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-2-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)苯基)乙酰胺(8)
(a)2-(4-氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I36)
向处于氮气脱气干燥的DMF(20mL)中的2-氯吡啶(0.816g,7.19 mmol)溶液添加4-硝基苯基硼酸(1.00g,5.99mmol)、Cs2CO3(7.19g,24.0 mmol)、三苯基膦(0.236g,0.899mmol)和Pd(OAc)2(0.134g,0.599mmol)。 在80℃下加热反应混合物24小时。将反应冷却至室温并真空浓缩至干燥。 将粗材料吸附到硅胶上并通过硅胶层析法(BiotageIsolera，40gSi卡套柱， 处于石油醚中0-100%EtOAc，40-60℃)加以纯化，以产生浅黄色固体。将 此材料(0.365g)溶解于1MHCl(1.5mL)和甲醇(15mL)中并在氮气氛下添 加PtO2(0.036g)。然后在Parr氢化器中对反应施加40psi氢气氛持续24 小时，然后通过Celite（硅藻土）加以过滤，用EtOAc(3x10mL)和(3x10 mL)对其加以洗涤。真空浓缩合并的滤液以产生粗材料(0.460g)，为浅棕 色粉色油状固体。将此材料溶解于无水甲醇(20mL)并用三乙胺(0.889mL, 6.38mmol)，接着用Boc酸酐(0.418g,1.91mmol)加以处理。在室温下搅拌 反应20小时，真空浓缩并添加EtOAc(100mL)和饱和NaHCO3水溶液(50 mL)，然后对层加以分离。用EtOAc(70mL)提取水层，合并有机物，并用 水(50mL)、盐水(50mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生黄 色固体。通过硅胶层析法(BiotageIsolera，12gSi卡套柱，处于石油醚中 0-100%EtOAc，40-60℃)来纯化粗产物，以产生标题化合物(I36)(0.122g， 8%产率，经过3个步骤)，为白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ6.85 –6.78(m,2H),6.57–6.51(m,2H),5.14(d,J=3.7Hz,1H),4.98–4.89(m, 2H),3.85(d,J=13.0Hz,1H),2.70–2.57(m,1H),2.19(d,J=13.9Hz,1H), 1.73–1.61(m,1H),1.57–1.44(m,2H),1.44–1.27(m,11H)。LCMS方法 C：rt4.94min；m/z177.3[M-Boc+2H]+。
(b)2-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯 (I37)
在0℃下，在1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷混合物(10mL)中搅拌2,4-二 氯-5-(三氟甲基)嘧啶(0.101g,0.464mmol)并经20分钟小心添加处于乙醚 (0.530mL,0.530mmol)中的1.0MZnCl2溶液。在添加以后，在0℃下继 续搅拌反应30分钟并在0℃下经15分钟滴加处于1:1t-BuOH:1,2-二氯乙 烷(4mL)中的2-(4-氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I36)(0.122g,0.441mmol) 的溶液，接着加入处于1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷(4mL)中的三乙胺(0.074 μL,0.530mmol)溶液，然后允许反应加温至室温并搅拌60小时。在真空 下蒸发挥发物并将产生的残余物悬浮在水(40mL)中，超声处理悬浮液40 分钟并通过过滤来收集产物，用水(5×10mL)洗涤固体并在高真空下干 燥，以产生标题化合物(I37)(0.135g，67%产率)，为浅粉色固体。LCMS 方法C：rt6.96min；m/z455.2,457.2M-H]-。
(c)2-(2-碘苯基)乙酰胺(I38)
在氮气氛下，将2-碘苯乙酸(2.00g,7.63mmol)溶解于干燥THF(70mL) 和干燥DMF(10mL)中。向溶液添加1-羟基苯并三唑(1.134g,8.396mmol)、 EDCl(1.609g,8.396mmol)和N,N-二异丙基乙胺(5.318mL,30.53mmol)， 并在室温下搅拌反应混合物10分钟。一次性添加碳酸铵(2.933g,30.53 mmol)，并在室温下搅拌反应17小时。在真空下除去挥发物并用EtOAc(150 mL)和饱和NaHCO3水溶液(100mL)稀释残余溶液。对层加以分离并用水 (100mL)、盐水(100mL)洗涤有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以 产生标题化合物(I38)(1.755g，88%产率)，为米黄色固体；1HNMR(400 MHz,d6-DMSO)δ7.82(dd,J=7.9,0.9Hz,1H),7.42(s,1H),7.36–7.28(m, 2H),7.02–6.94(m,2H),3.55(s,2H)。LCMS方法C：rt4.77min；m/z262.0 [M+H]+。
(d)2-(2-乙炔基苯基)乙酰胺(I39)
向处于干燥THF(50mL)和干燥DMF(10mL)中的2-(2-碘苯基)乙酰胺 (I38)(1.75g,6.70mmol)的氮气脱气溶液添加Pd(PPh3)4(0.194g,0.168 mmol)、Cu(I)I(0.064g,0.34mmol)、和三乙胺(3.27mL,23.5mmol)。搅拌 混合物10分钟并添加TMS-乙炔(1.52mL,10.7mmol)。然后在室温下搅拌 反应混合物18小时，真空浓缩并通过硅胶层析法(BiotageIsolera，40gSi 卡套柱，处于石油醚中0-100%EtOAc，40-60℃)加以纯化，以产生米黄色 固体。在氮气氛下将此材料溶解于干燥THF(25mL)，并在0℃下滴加 TBAF(1.0M，在THF中，2.805mL，2.805mmol)。在此温度下搅拌溶液 1小时15分钟，其后，添加水(5mL)。真空浓缩反应混合物并用EtOAc(100 mL)和饱和NaHCO3水溶液(100mL)稀释。对层加以分离并用EtOAc(100 mL)提取水层，合并有机层并用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥 (MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生粗产物。通过硅胶层析法(Biotage Isolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中0-100%EtOAc，40-60℃，然后为 处于EtOAc中0-20%甲醇)来纯化上述材料，以产生标题化合物(I39)(0.239 g，22%产率，经过2个步骤)，为米黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO) δ7.21(dd,J=7.6,1.1Hz,1H),7.18–7.05(m,3H),7.04–6.98(m,1H),6.70 (s,1H),4.08(s,1H),3.36(s,2H)。LCMS方法C：rt4.71min；m/z160.2 [M+H]+。
(e)2-(4-((4-((2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶 -2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I40)
向处于干燥DMF(4mL)中的2-(2-乙炔基苯基)乙酰胺(I39)(0.054g, 0.788mmol)和2-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸 叔丁酯(I37)的氮气脱气溶液添加三乙胺(0.159mL,1.138mmol)、三苯基膦 (0.011g,0.043mmol)、反式-二氯二(三苯基膦)钯(II)(0.020g,0.028mmol) 和CuI(0.008g,0.04mmol)。在微波照射下在120℃下加热反应混合物20 分钟。将反应真空浓缩至干燥并通过硅胶层析法(BiotageIsolera，40gSi 卡套柱，处于石油醚中0-100%EtOAc，40-60℃，然后为处于EtOAc中 0-5%甲醇)加以纯化，以产生标题化合物(I40)(0.122g，74%产率)，为黄色 玻璃状固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.48(s,1H),8.82(s,1H), 7.73(d,J=8.7Hz,2H),7.65–7.55(m,1H),7.55–7.47(m,1H),7.47–7.33 (m,3H),7.16(d,J=8.5Hz,2H),7.01(s,1H),5.29–5.22(m,1H),3.92(d,J =13.1Hz,1H),3.70(s,2H),2.71(t,J=13.3Hz,1H),2.34–2.24(m,1H), 1.82–1.68(m,1H),1.54(d,J=11.3Hz,2H),1.45–1.22(m,11H)。LCMS 方法C：rt6.52min；m/z578.3[M-H]-。
(f)2-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I41)
在氮气氛下，将2-(4-((4-((2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三 氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I40)(0.120g,0.207mmol) 溶解于干燥DMF(5mL)。将处于EtOAc(5mL)中的20%Pearlman催化剂 (0.060g)加入溶液并将气氛改变成氢气(气球)。用气球密封反应并在室温 下搅拌20小时。通过经由Celite（硅藻土）过滤除去催化剂，用EtOAc(5 x10mL)对其加以洗涤。真空除去溶剂以产生浅黄色胶，通过硅胶层析法 (BiotageIsolera，12gSi卡套柱，处于石油醚中0-100%EtOAc，40-60℃) 对其加以纯化，以产生标题化合物(I41)(0.090g，74%产率)，为浅黄色固 体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.20(s,1H),8.67(s,1H),7.73(d,J= 8.7Hz,2H),7.43(s,1H),7.26–7.21(m,1H),7.20–7.09(m,5H),6.89(s, 1H),5.31–5.19(m,1H),3.92(d,J=13.2Hz,1H),3.49(s,2H),3.16–2.98 (m,4H),2.71(t,J=11.8Hz,1H),2.29(d,J=13.2Hz,1H),1.75(t,J=11.0 Hz,1H),1.58–1.50(m,2H),1.46–1.23(m,11H)。LCMS方法C：rt6.59 min；m/z584.3[M+H]+。
(g)2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-2-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 苯基)乙酰胺(8)
在氮气氛下，将2-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I41)(0.087g,0.15mmol)溶解于 干燥DCM(5mL)。将三氟乙酸(0.351mL,4.58mmol)加入溶液并在室温下 搅拌反应22小时。真空除去挥发物，将EtOAc(20mL)和饱和NaHCO3水 溶液(15mL)加入残余物并对层加以分离。用EtOAc(15mL)提取水层，用 水(50mL)、盐水(50mL)洗涤合并的有机物，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓 缩，以产生浅黄色固体，将其吸收于DCM(～10mL)和甲醇(～1mL)中并真 空浓缩。仅用DCM重复上述过程两次以产生标题化合物(8)(0.064g，89% 产率)，为浅黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.15(s,1H),8.66(s, 1H),7.70–7.62(m,2H),7.44(s,1H),7.30(d,J=8.6Hz,2H),7.26–7.12(m, 4H),6.92(s,1H),3.54–3.47(m,3H),3.15–2.97(m,5H),2.71–2.59(m, 1H),1.84–1.76(m,1H),1.67(d,J=12.4Hz,1H),1.61–1.50(m,1H),1.46 –1.27(m,3H)。LCMS方法C：rt4.84min；m/z484.3[M+H]+。
实施例9：2-(2-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-2-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(9)
在氮气氛下，向处于无水甲醇(1.5mL)中的2-(2-(2-(2-((4-哌啶-2-基) 苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(8)(0.023g,0.048 mmol)的悬浮液添加37%的甲醛水溶液(0.014mL,0.19mmol)和三乙酰氧 基硼氢化钠(0.050g,0.24mmol)。在室温下搅拌反应2.5小时，真空除去挥 发物并用EtOAc(15mL)和饱和NaHCO3(10mL)水溶液稀释残余物。对层 加以分离并用EtOAc(10mL)提取水层，用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合 并的有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生固体，将其吸收在 DCM(～10mL)和甲醇(～1mL)中并真空浓缩。仅用DCM重复上述过程两 次，其后，在高真空下进一步干燥样品，以产生标题化合物(9)(0.022g， 91%产率)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.17(s,1H), 8.66(s,1H),7.68(d,J=8.6Hz,2H),7.43(s,1H),7.27–7.13(m,6H),6.92(s, 1H),3.49(s,2H),3.15–2.98(m,4H),2.97–2.90(m,1H),2.75–2.69(m, 1H),2.07–1.97(m,1H),1.90(s,3H),1.73(d,J=12.8Hz,1H),1.66–1.54 (m,3H),1.50–1.38(m,1H),1.36–1.27(m,1H)。LCMS方法C：rt4.88min； m/z498.3[M+H]+。
实施例10：2-(2-(2-(2-((4-(4-乙基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(10)
在氮气氛下，向处于无水甲醇(1.5mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基) 苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(1)(0.020g, 0.041mmol)的悬浮液添加乙醛(0.0090mL,0.17mmol)和三乙酰氧基硼氢 化钠(0.044g,0.21mmol)。在室温下搅拌反应18小时，真空除去挥发物并 用EtOAc(15mL)和饱和NaHCO3水溶液(10mL)稀释残余物。对层加以分 离并用EtOAc(10mL)提取水层，用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的有 机层，干燥(MgSO4)，过滤和真空浓缩，以产生固体，将其吸收在DCM(～10 mL)和甲醇(～1mL)中并真空浓缩。仅用DCM重复上述过程两次，其后， 在高真空下进一步干燥样品，以产生标题化合物(10)(0.016g，76%产率)， 为灰白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.97(s,1H),8.60(s,1H), 7.57(d,J=8.9Hz,2H),7.43(s,1H),7.26–7.13(m,4H),6.97–6.87(m,3H), 3.50(s,2H),3.13–2.94(m,8H),2.36(q,J=7.2Hz,2H),1.03(t,J=7.2Hz, 3H)。残余DMSO遮掩了4个脂族质子。LCMS方法C：rt4.82min；m/z 513.3[M+H]+。
实施例11：2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)苯基)乙酰胺(11)
(a)4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I42)
在-78℃下将二异丙基酰胺锂(2M，在庚烷/THF/乙基苯中；15.1mL， 30.1mmol)滴加入处于THF(50mL)中的4-氧哌啶-1-羧酸叔丁酯(3.00g, 15.1mmol)溶液并继续搅拌混合物30分钟。然后，经30分钟，将处于 THF(60mL)中的N-苯基-二(三氟甲磺酰亚胺)(6.46g,18.1mmol)的溶液滴 加入反应，并在-78℃下搅拌混合物30分钟。然后允许产生的混合物加温 至室温并搅拌24小时。部分地除去溶剂(约80mL)并用饱和NaHCO3溶液 (50mL)淬灭反应混合物。将DCM(50mL)加入溶液并将层分离。然后用 DCM(2x50mL)提取水层。合并有机层并用0.2M柠檬酸溶液(50mL)、1M NaOH(50mL)、盐水(50mL)洗涤，然后在Na2SO4上干燥。在减压下除去 溶剂以产生棕色油，在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-10%乙醚， 40-60℃)对其加以纯化，以产生标题化合物(I42)(2.48g，50%)，为橙色油， 在冷却至-18℃以后其发生结晶；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.76(s,1H), 4.05-4.04(m,2H),3.63(t,J=5.6Hz,2H),2.46–2.43(m,2H),1.47(s,9H)。
(b)4-(4-硝基苯基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I43)
将2MNa2CO3(5.66mL,11.3mmol)的溶液加入处于1,4-二氧杂环己 烷(20mL)中的4-硝基苯基硼酸(0.831g,4.98mmol)、4-(((三氟甲基)磺酰基) 氧基)-5,6-二氢吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(I42)(1.50g,4.53mmol)、LiCl(0.384 g,9.06mmol)和Pd(PPh3)4(1.308g,1.132mmol)的混合物。在85-90℃下搅 拌反应混合物4小时。将产生的混合物溶解于EtOAc(100mL)，用H2O(50 mL)、盐水(50mL)洗涤有机层，并在Na2SO4上干燥，以产生暗红色油。 在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-20%EtOAc，40-60℃)来纯化上述 油，以产生标题化合物(I43)(0.683g，50%)，为浅棕色固体；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ8.24–8.16(m,2H),7.55–7.47(m,2H),6.23(s,1H),4.14- 4.12(m,2H),3.66(t,J=5.7Hz,2H),2.55(bs,2H),1.50(s,9H)。LCMS方法 C：rt6.39min；m/z249[M-Boc+2H]+,205[M-叔丁基+2H]+。
(c)4-(4-氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I44)
将处于EtOH(5mL)和DMF(5mL)中的4-(4-硝基苯基)-5,6-二氢吡啶 -1(2H)-羧酸叔丁酯(I43)(0.570g,1.87mmol)溶液加入处于DMF(10mL)中 的10%Pd/C(200mg)溶液。在室温下在氢气氛下搅拌反应24小时。通过 Celite（硅藻土）垫来过滤反应并用EtOAc(130mL)洗涤。真空除去溶剂以 产生棕色油，在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-50%EtOAc，40-60℃) 对其加以纯化，以产生标题化合物(I44)(0.46g，89%)，为结晶固体；1HNMR (400MHz,CDCl3)δ7.02–6.96(m,2H),6.67–6.61(m,2H),4.21(bs,2H), 3.57(s,2H),2.77(t,J=12.2Hz,2H),2.53(tt,J=12.1,3.5Hz,1H),1.77(d,J =13.3Hz,2H),1.64–1.50(m，溶剂遮掩了峰),1.48(s,9H)。LCMS方法C： rt4.77min；m/z221[M-叔丁基+2H]+,177[M-Boc+2H]+。
(d)4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯 (I45)
在0℃下在氮气流下，将氯化锌(1.0M，在Et2O中)(1.97mL,1.97 mmol)加入处于1:1DCE/t-BuOH(10mL)中的2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶 (0.384g,1.77mmol)的溶液。在0℃下搅拌混合物1小时，然后添加处于 1:1DCE/tBuOH(7mL)中的4-(4-氨基苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I44)(0.453g, 1.64mmol)。接着在0℃下滴加处于1:1DCE/t-BuOH(8mL)中的NEt3(0.251 mL,1.80mmol)溶液。在最终添加以后，在0℃下，剧烈搅拌反应混合物 另外30分钟，然后在室温下24小时。真空除去溶剂以产生棕色油状残余 物，在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-20%EtOAc，40-60℃)对其加 以纯化，以产生浅黄色固体。将固体悬浮在MeOH(10mL)和水(10mL)中。 过滤产生的沉淀物以产生标题化合物(I45)(0.658g，88%)，为白色固体； 1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.60(s,1H),8.77(d,J=0.5Hz,1H),7.59 (d,J=8.5Hz,2H),7.23(d,J=8.6Hz,2H),4.13–3.98(m,2H),2.80(bs, 2H),2.69–2.61(m,1H),1.74(d,J=12.4Hz,2H),1.53–1.39(m,11H)。 LCMS方法C：rt6.81min；m/z401[M-叔丁基+2H]+,357[M-Boc+2H]+。
(e)4-(4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶 -2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I46)
将处于二甲基甲酰胺(2mL)和三乙胺(0.183mL,1.31mmol)中的2-(2- 乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)(0.069g,0.394mmol)的溶液加入处于二甲基甲 酰胺(2mL)中的4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸 叔丁酯(I45)(0.150g,0.328mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(0.023g,0.033mmol)、 Cu(I)I(0.0090g,0.049mmol)和三苯基膦(0.013g,0.049mmol)的混合物。在 微波照射下在120℃下加热反应混合物15分钟。冷却反应，用EtOAc稀 释混合物并通过Celite（硅藻土）塞，然后用乙酸乙酯(50mL)洗涤。添加 水(50mL)并对层进行分离。用EtOAc(2x50mL)提取水层。用水(50mL) 和盐水(50mL)洗涤合并的有机提取物并在Na2SO4上干燥。在过滤以后， 在减压下除去溶剂，以产生暗棕色残余物。在硅胶上通过柱层析法(处于 环己烷中0-20%EtOAc，)来纯化残余物以产生标题化合物(I46)(0.157g， 80%)，为棕色粘性油。
(f)4-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I47)
将处于DMF(15mL)中的4-(4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙 炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I46)(0.157g, 0.264mmol)的溶液加入处于DMF(5mL)中的10%Pd/C(95mg)的溶液。在 室温下在氢气氛下搅拌反应24小时。通过Celite（硅藻土）垫来过滤反应 并用EtOAc(100mL)洗涤。真空除去溶剂以产生浅黄色油，在硅胶上通过 柱层析法(处于石油醚中0-20%EtOAc，40-60℃)对其进行纯化，以产生标 题化合物(I47)(0.128g，81%)，为浅黄色粘性油；1HNMR(400MHz,CDCl3) δ8.53(d,J=0.4Hz,1H),7.59–7.54(m,2H),7.39(s,1H),7.28–7.17(m， CDCl3遮掩了峰),4.25(bs,2H),3.75(s,2H),3.68(s,3H),3.17–3.04(m, 4H),2.81(t,J=12.1Hz,2H),2.64(tt,J=11.8,3.4Hz,1H),1.83(d,J=13.0 Hz,2H),1.67-1.59(m,2H),1.49(s,9H)。LCMS方法C：rt7.02min；m/z621 [M+Na]+,599[M+H]+,543[M-叔丁基+2H]+,499[M-Boc+2H]+。
(g)2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲 基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I48)
将LiOH.H2O(0.027g,0.647mmol)加入处于THF(7mL)、水(1.5mL) 和甲醇(1mL)中的4-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I47)(0.128g,0.214mmol)的溶 液。在室温下允许搅拌产生的混合物20小时。真空除去挥发物，用 EtOAc(50mL)和饱和NaHCO3水溶液(50mL)稀释残余物。对层加以分离， 用EtOAc(2x50mL)提取水层，合并有机层，用盐水(50mL)洗涤，在Na2SO4上干燥，过滤并减压浓缩，以产生标题化合物(I48)(0.130g)，为浅黄色粘 性油。
(h)4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I49)
在氮气氛下，将1-羟基苯并三唑(32.8mg,0.243mmol)、EDCl(46.6mg, 0.243mmol)和N,N-二异丙基乙胺(84.6μL,0.486mmol)加入处于干燥 THF(6mL)和干燥DMF(1mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4- 基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I48)(0.130g, 0.221mmol)的溶液。在10分钟以后，一次性将碳酸铵(84.8mg,0.883mmol) 加入搅拌的反应混合物。在室温下搅拌反应18小时。真空除去挥发物， 用EtOAc(50mL)稀释残余溶液，转移到分液漏斗，并用饱和NaHCO3(50 mL)洗涤。用EtOAc(2x50mL)提取水层。用水(50mL)和盐水(2x50mL)洗 涤合并的有机层并在Na2SO4上干燥。在过滤以后，真空除去溶剂以产生 浅黄色固体。在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-80%EtOAc，40-60℃) 来纯化粗材料，以产生标题化合物(I49)(90.8mg，70%)，为白色泡沫固体； 1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,1H),7.53(m,3H),7.31–7.23(m， CDCl3遮掩了峰),7.20(d,J=8.5Hz,2H),5.37(s,1H),5.29(s,1H),4.25(bs, 2H),3.72(s,2H),3.15–3.03(m,4H),2.80(t,J=12.4Hz,2H),2.69–2.59 (m,1H),1.83(d,J=12.6Hz,2H),1.68–1.55(m，水峰遮掩了峰),1.49(s, 9H)。LCMS方法C：rt6.48min；m/z606[M+Na]+,584[M+H]+,528[M- 叔丁基+2H]+,484[M-Boc+2H]+。
(i)2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 苯基)乙酰胺(11)
在氮气氛下，将三氟乙酸(0.595mL,7.78mmol)加入处于干燥DCM(5 mL)中的4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I49)(90.8mg,0.156mmol)的溶液。在室温下 搅拌反应23小时。真空除去挥发物并在EtOAc(30mL)和2MNaOH(30mL) 之间分配残余物。分离上述两层并用EtOAc(2x30mL)提取水层。用水(30 mL)、盐水(30mL)洗涤合并的有机层，并在Na2SO4上干燥。在过滤以后， 在减压下除去溶剂以产生白色固体，将其悬浮在DCM(2mL)和环己烷(10 mL)中。过滤产生的沉淀物以产生标题化合物(11)(63mg，84%)，为灰白 色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.13(s,1H),8.65(s,1H), 7.67-7.64(m,2H),7.44(s,1H),7.27–7.12(m,6H),6.93(s,1H),3.50(s,2H), 3.14–3.06(m,2H),3.02-2.99(m,4H),2.62–2.46(m，DMSO遮掩了峰), 1.67(d,J=11.4Hz,2H),1.49(qd,J=12.5,3.9Hz,2H)。LCMS方法C：rt 4.84min；m/z484[M+H]+。
实施例12：2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)苯基)丙酰胺(12)
(a)2-(2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)丙酸甲酯(I50)
在-78℃下，将2MLDA溶液(1.24mL,2.48mmol)加入处于THF(10 mL)中的2-(2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯(I10)(0.306g,1.24 mmol)的溶液并搅拌混合物30分钟。然后添加甲基碘(0.155mL,2.48mmol) 并经1.5小时缓慢加温反应混合物至室温。然后在用NH4Cl的饱和溶液(20 mL)淬灭以前，在室温下搅拌反应混合物18小时。然后添加EtOAc(20mL) 并对层进行分离。用EtOAc(2x20mL)进一步提取水层。真空除去溶剂以 产生棕色油，在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-5%EtOAc，40-60℃) 对其进行纯化，以产生标题化合物(I50)(0.297g，92%)，为黄色油；1HNMR (400MHz,CDCl3)δ7.49–7.44(m,1H),7.33–7.24(m，CDCl3遮掩了峰), 7.21-7.17(m,1H),4.25(q,J=7.2Hz,1H),3.67(s,3H),1.51(d,J=7.2Hz, 3H),0.26(s,9H)。
(b)2-(2-乙炔基苯基)丙酸甲酯(I51)
在0℃下，将TBAF溶液(处于THF中的1M溶液；2.28mL，2.28mmol) 加入处于THF(10mL)中的2-(2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯基)丙酸甲酯 (I50)(0.297g,1.14mmol)的溶液。在0℃下搅拌反应50分钟，然后在减压 下浓缩并将残余物吸收在EtOAc(20mL)中。用饱和NaHCO3(20mL)、水 (20mL)洗涤有机溶液并在Na2SO4上干燥。真空除去溶剂以产生棕色油状 残余物。在硅胶上利用柱层析法(处于环己烷中0-5%EtOAc)来纯化上述油 以产生标题化合物(I51)(0.192g，89%)，为浅黄色油；1HNMR(400MHz, CDCl3)δ7.53–7.48(m,1H),7.36–7.28(m,2H),7.24-7.20(m,1H),4.31(q, J=7.2Hz,1H),3.67(s,3H),3.28(s,1H),1.50(d,J=7.2Hz,3H)。LCMS方 法C：rt5.92min；m/z189[M+H]+。
(c)4-(4-((4-((2-(1-甲氧基-1-氧基丙烷-2-基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I52)
将处于二甲基甲酰胺(2mL)和三乙胺(0.183mL,1.31mmol)中的2-(2- 乙炔基苯基)丙酸甲酯(I51)(0.074g,0.39mmol)的溶液加入处于二甲基甲 酰胺(2mL)中的4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸 叔丁酯(I45)(0.150g,0.328mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(0.023g,0.033mmol)、CuI (0.0090g,0.049mmol)和三苯基膦(0.013g,0.049mmol)的混合物。在微波 照射下在120℃下加热反应混合物15分钟。冷却反应并用EtOAc稀释混 合物，然后通过Celite（硅藻土）塞，用乙酸乙酯(50mL)洗涤。添加水(50 mL)并对层进行分离。用EtOAc(2x50mL)提取水层。用水(50mL)和盐水(50 mL)洗涤合并的有机提取物并在Na2SO4上干燥。在过滤以后，在减压下除 去溶剂以产生暗棕色残余物。在硅胶上通过柱层析法(处于环己烷中0-20% EtOAc)来纯化残余物以产生标题化合物(I52)(0.108g，54%)，为棕色粘性 油。
(d)4-(4-((4-(2-(1-甲氧基-1-氧基丙烷-2-基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶 -2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I53)
将处于EtOAc(5mL)和DMF(10mL)中的4-(4-((4-((2-(1-甲氧基-1-氧 基丙烷-2-基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸 叔丁酯(I52)(0.108g,0.177mmol)的溶液加入处于EtOAc(5mL)中的10% Pd/C(80mg)的悬浮液。在室温下在氢气氛下搅拌反应24小时。过滤反应 并真空除去溶剂以产生棕色残余物。将残余物再溶解于DMF(15mL)并加 入处于DMF(5mL)中的10%Pd/C(55mg)的悬浮液。在室温下在氢气氛下 搅拌反应24小时。通过Celite（硅藻土）垫来过滤反应，用EtOAc(100mL) 洗涤。在减压下除去溶剂以产生棕色粘性油，在硅胶上通过柱层析法(处 于石油醚中0-15%EtOAc，40-60℃)对其加以纯化，以产生标题化合物 (I53)(84.3mg，77%)，为浅黄色粘性油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.54 (s,1H),7.59–7.54(m,2H),7.38(s,1H),7.33–7.30(m,1H),7.25–7.17(m, 5H),4.25(s,2H),4.11(q,J=7.1Hz,1H),3.64(s,3H),3.23–3.02(m,4H), 2.81(t,J=12.0Hz,2H),2.64(tt,J=12.0,3.4Hz,1H),1.83(d,J=12.9Hz, 2H),1.67–1.59(m,2H),1.50–1.48(d,J=7.0Hz,3H;s,9H)。LCMS方法 C：rt7.15min；m/z635[M+Na]+,613[M+H]+,557[M-叔丁基+2H]+。
(e)2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲 基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)丙酸锂(I54)
将LiOH.H2O(17.3mg,0.413mmol)加入处于THF(7mL)、水(1.5mL) 和甲醇(1mL)中的4-(4-((4-(2-(1-甲氧基-1-氧基丙烷-2-基)苯乙基)-5-(三氟 甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I53)(0.084g,0.137mmol)的 溶液。在室温下允许搅拌产生的混合物20小时。真空除去挥发物并用 EtOAc(50mL)和饱和NaHCO3水溶液(50mL)稀释残余物。对层加以分离 并用EtOAc(1x50mL)提取水层。合并有机层，用盐水(50mL)洗涤，用 Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩，以产生标题化合物(I54)(86mg)，为 浅黄色粘性油。
(f)4-(4-((4-(2-(1-氨基-1-氧基丙烷-2-基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2- 基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I55)
在氮气氛下，将1-羟基苯并三唑(21.1mg,0.156mmol)、EDCl(30.0mg, 0.156mmol)和N,N-二异丙基乙胺(54.5μL,0.313mmol)加入处于干燥 THF(6mL)和干燥DMF(1mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4- 基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)丙酸锂(I54)(0.086g, 0.142mmol)的溶液。在10分钟以后，一次性将碳酸铵(54.6mg,0.569mmol) 加入搅拌的反应混合物。在室温下搅拌反应18小时。真空除去挥发物并 用EtOAc(50mL)稀释残余溶液，然后用饱和NaHCO3(50mL)洗涤。用 EtOAc(2x50mL)提取水层。用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并的有机层 并在Na2SO4上干燥。在过滤以后，真空除去溶剂以产生浅黄色固体。在 硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-85%EtOAc，40-60℃)来纯化粗材料 以产生标题化合物(I55)(65.2mg，77%)，为白色泡沫固体；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.51(d,J=8.5Hz,2H),7.47(s,1H),7.40–7.36 (m,1H),7.30–7.17(m，CDCl3遮掩了峰),5.37(s,1H),5.20(s,1H),4.25(bs, 2H),4.01(q,J=7.1Hz,1H),3.17–3.02(m,4H),2.80(t,J=12.3Hz,2H), 2.64(tt,J=12.3,3.6Hz,1H),1.83(d,J=12.7Hz,2H),1.67–1.59(m，水峰 遮掩了峰),1.56(d,J=7.2Hz,3H),1.49(s,9H)。LCMS方法C：rt6.60min； m/z620[M+Na]+,598[M+H]+,542[M-叔丁基+2H]+,498[M-Boc+2H]+。
(g)2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 苯基)丙酰胺(12)
在氮气氛下，将三氟乙酸(0.417mL,5.46mmol)加入处于干燥DCM(8 mL)中的4-(4-((4-(2-(1-氨基-1-氧基丙烷-2-基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2- 基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的溶液(I55)(65.2mg,0.109mmol)。在室 温下搅拌反应23小时。真空除去挥发物并在EtOAc(20mL)和2M NaOH(20mL)之间分配残余物。对层加以分离并用EtOAc(2x20mL)提取水 层。用水(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的有机层，并在Na2SO4上干燥。 在过滤以后，在减压下除去溶剂以产生浅黄色固体，将其溶解于EtOAc(2 mL)，向其添加环己烷(10mL)。通过过滤来收集产生的沉淀物以得到标题 化合物(12)(25mg，47%)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ 10.14(s,1H),8.67(s,1H),7.68–7.65(m,2H),7.42–7.34(m,1H),7.26– 7.12(m,6H),6.87(s,1H),3.86(q,J=7.0Hz,1H),3.44–3.18(m，水峰遮掩 了峰),3.14–2.95(m,5H),2.64–2.46(m，DMSO遮掩了峰),1.68(d,J= 13.0Hz,2H),1.49(qd,J=12.1,2.4Hz,2H),1.31(d,J=7.0Hz,3H)。LCMS 方法C：rt4.91min；m/z498[M+H]+。
实施例13：2-(2-(2-(2-((4-(4-乙酰基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(13)
将2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 苯基)乙酰胺(1)(0.020g,0.041mmol)溶解于干燥DCM(2mL)、干燥THF(1 mL)和干燥DMF(1mL)，然后添加三乙胺(0.012mL,0.083mmol)，接着添 加乙酸酐(0.008mL,0.083mmol)。然后在室温下搅拌反应5小时，真空 除去挥发物并用EtOAc(15mL)和饱和NaHCO3水溶液(10mL)稀释残余 物。对层加以分离并用EtOAc(10mL)提取水层，用水(10mL)、盐水(10 mL)、水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)，过滤并 真空浓缩，以产生固体，将其吸收在DCM(～10mL)和甲醇(～1mL)中并真 空浓缩。仅用DCM重复上述过程两次，其后，在高真空下进一步干燥样 品，以产生标题化合物(13)(0.019g，87%产率)，为灰白色固体；1HNMR (400MHz,d6-DMSO)δ10.01(s,1H),8.61(s,1H),7.63–7.56(m,2H),7.44 (s,1H),7.26–7.13(m,4H),6.98–6.90(m,3H),3.61–3.54(m,4H),3.50(s, 2H),3.13–2.95(m,8H),2.04(s,3H)。LCMS方法C：rt5.62min；m/z527.2 [M+H]+。
实施例14：N-甲基-2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(14)
(a)4-(4-((4-(2-(2-甲基氨基)-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2- 基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I56)
在氮气氛下，将2-(2-(2-(2-((4-(4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)苯基)氨 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I7)(0.130g,0.220mmol)溶 解于干燥THF(7mL)和干燥DMF(1mL)。向溶液添加1-羟基苯并三唑 (0.036g,0.26mmol)、EDCl(0.051g,0.26mmol)和N,N-二异丙基乙胺 (0.153mL,0.879mmol)，并在室温下搅拌反应混合物10分钟。一次性添 加盐酸甲胺(0.059g,0.88mmol)，并在室温下搅拌反应60小时。真空除去 挥发物并用EtOAc(100mL)和饱和NaHCO3水溶液(80mL)稀释残余溶液。 对层加以分离并用EtOAc(70mL)提取水层，合并有机层并用水(100mL)、 盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生浅黄色固体。 通过硅胶层析法(BiotageIsolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中0-100% EtOAc，40-60℃，然后为处于EtOAc中0-60%甲醇)来纯化粗产物，以产 生标题化合物(I56)(0.091g，69%产率)，为浅黄色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ10.00(s,1H),8.61(s,1H),7.93–7.86(m,1H),7.63–7.56(m, 2H),7.24–7.12(m,4H),6.96–6.89(m,2H),3.54–3.42(m,6H),3.14– 2.93(m,8H),2.56(d,J=4.6Hz,3H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt6.27 min；m/z599.3[M+H]+。
(b)N-甲基-2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)苯基)乙酰胺(14)
在氮气氛下，将4-(4-((4-(2-(2-甲基氨基)-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟 甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I56)(0.087g,0.15mmol)溶 解于DCM(5mL)。将三氟乙酸(0.222mL,2.906mmol)加入溶液并在室温下 搅拌反应6小时。真空除去挥发物，将EtOAc(70mL)和2MNaOH水溶 液(70mL)加入残余物并对层加以分离。用EtOAc(2x70mL)提取水层，用 水(50mL)、盐水(50mL)洗涤合并的有机物，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓 缩，以产生固体，将其吸收在DCM(～10mL)和甲醇(～1mL)中并真空浓缩。 仅用DCM重复上述过程两次，其后，在高真空下进一步干燥样品，以产 生标题化合物(14)(0.068g，94%产率)，为浅黄色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ9.97(s,1H),8.60(s,1H),7.93–7.85(m,1H),7.60–7.53(m, 2H),7.23–7.12(m,4H),6.91–6.86(m,2H),3.50(s,2H),3.14–3.06(m, 2H),3.02–2.93(m,6H),2.87–2.80(m,4H),2.56(d,J=4.6Hz,3H)。LCMS 方法A：rt4.37min；m/z499.6[M+H]+。
实施例15：N-甲基-2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(15)
(a)2-碘-6-甲基苯甲酸(I57)
在氮气氛下，向处于干燥DMF(60mL)中的邻甲基苯甲酸(2.00g,14.7 mmol)的溶液添加N-碘琥珀酰亚胺(3.64g,16.2mmol)，接着加入 Pd(OAc)2(0.330g,1.47mmol)。将产生的反应混合物加热至100℃并搅拌 17小时。在冷却至室温以后，用水(100mL)和EtOAc(150mL)稀释反应， 对层加以分离并用EtOAc(2x100mL)提取水层，用水(100mL)、盐水(100 mL)、水(100mL)、盐水(100mL)洗涤合并的有机物，干燥(MgSO4)，过滤 并真空浓缩，以产生标题化合物(I57)(3.56g，92%产率)，为棕色油状固体； 1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(d,J=7.9Hz,1H),7.21(d,J=7.6Hz, 1H),7.02(t,J=7.8Hz,1H),2.44(s,3H)。LCMS方法C：rt5.36min。
(b)2-碘-6-甲基苯甲酸甲酯(I58)
在氮气氛下，将处于DCM(30mL)和甲醇(8mL)中的2-碘-6-甲基苯甲 酸(I57)(2.50g,9.54mmol)的溶液冷却至0℃并滴加三甲基甲硅烷基重氮甲 烷(2.0M，在乙醚中，9.54mL，19.1mmol)。在0℃下搅拌反应45分钟， 然后用2MHCl水溶液(50mL)淬灭。将DCM(150mL)加入淬灭的反应中 并对层加以分离。用DCM(100mL)提取水层，合并有机物并用饱和 NaHCO3水溶液(100mL)、水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)， 过滤并真空浓缩，以产生黄色油。通过硅胶层析法(BiotageIsolera，40gSi 卡套柱，处于石油醚中0-20%EtOAc，40-60℃)来纯化粗产物，以产生标 题化合物(I58)(2.00g，76%产率)，为无色油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ 7.65(ddd,J=7.9,1.0,0.5Hz,1H),7.19–7.15(m,1H),6.99(t,J=7.8Hz, 1H),3.95(s,3H),2.33(s,3H)。LCMS方法C：rt6.08min；m/z277.0[M+H]+。
(c)7-碘异吲哚啉-1-酮(I59)
在氯苯(50mL)中搅拌2-碘-6-甲基苯甲酸甲酯(I58)(2.00g,7.245 mmol)和NBS(1.418g,7.969mmol)，并添加苯甲酰基过氧化物(75%w/w, 0.234g,0.724mmol)。在90℃下搅拌反应18小时，冷却至室温，过滤并 用环己烷(4x10mL)洗涤沉淀物。蒸发合并的滤液，并用THF(50mL)稀释 产生的棕色油。添加氨水溶液(20mL)，并剧烈搅拌混合物17小时。用水 (20mL)稀释混合物并真空除去THF。添加DCM(150mL)，对层加以分离 并用DCM(2x100mL)提取水层，用盐水(100mL)洗涤合并的有机物，干燥 (MgSO4)并过滤。添加硅胶并真空除去挥发物以产生吸附在硅胶上的粗材 料。通过硅胶层析法(BiotageIsolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中0-100% EtOAc，40-60℃，然后为处于EtOAc中0-20%甲醇)来纯化上述材料，以 产生标题化合物(I59)(0.757g，40%产率)，为米黄色固体；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ7.93(dd,J=7.8,0.7Hz,1H),7.46(dd,J=7.5,0.8Hz,1H), 7.26–7.21(m,1H),7.10(brs,1H),4.37(d,J=0.6Hz,2H)。LCMS方法C： rt5.06min；m/z260.0[M+H]+。
(d)7-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)异吲哚啉-1-酮(I60)
向处于干燥DMF(6mL)中的7-碘异吲哚啉-1-酮(I59)(0.233g,0.899 mmol)的氮气脱气溶液添加三乙胺(0.501mL,3.598mmol)，接着加入三苯 基膦(0.035g,0.14mmol)、反式-二氯二(三苯基膦)钯(II)(0.063g,0.090 mmol)、CuI(0.026g,0.14mmol)以及最后加入(三甲基甲硅烷基)乙炔(0.292 mL,1.63mmol)。然后在微波照射下在100℃下加热反应混合物30分钟然 后10分钟。真空浓缩反应混合物，然后吸附到硅胶上并通过硅胶层析法 (BiotageIsolera，40gSi卡套柱，处于二氯甲烷中0-46%EtOAc)加以纯化， 以产生标题化合物(I60)(0.120g，49%产率)，为灰白色固体；1HNMR(400 MHz,d6-DMSO)δ8.47(s,1H),7.60–7.51(m,2H),7.49(dd,J=6.7,2.0Hz, 1H),4.32(s,2H),1.03(t,J=7.9Hz,9H),0.66(q,J=7.9Hz,6H)。LCMS方 法C：rt6.44min；m/z272.2[M+H]+。
(e)7-乙炔基异吲哚啉-1-酮(I61)
在氮气氛下在0℃下，向处于干燥THF(8mL)中的7-((三甲基甲硅烷 基)乙炔基)异吲哚啉-1-酮(I60)(0.172g,0.634mmol)的溶液滴加TBAF(1.0 M，在THF中，0.697mL，0.697mmol)。在此温度下搅拌溶液1.5小时， 然后通过添加水(2mL)加以淬灭。真空浓缩反应混合物并用DCM(100mL) 和饱和NaHCO3水溶液(70mL)稀释。对层加以分离并用DCM(70mL)提取 水层，用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)，过 滤并真空浓缩，以产生米黄色固体。通过硅胶层析法(BiotageIsolera，12g Si卡套柱，处于DCM中0-80%EtOAc)来纯化粗产物，以产生标题化合物 (I61)(0.076g，76%产率)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ 8.59(s,1H),7.61–7.50(m,3H),4.39(s,1H),4.33(s,2H)。LCMS方法C： rt4.56min,m/z158.1[M+H]+。
(f)4-(4-((4-((3-氧异吲哚啉-4-基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基) 苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I62)
向处于干燥DMF(7mL)中的7-乙炔基异吲哚啉-1-酮(I61)(0.074g, 0.47mmol)和4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔 丁酯(I3)(0.180g,0.393mmol)的氮气脱气溶液添加三乙胺(0.219mL,1.57 mmol)，接着加入三苯基膦(0.015g,0.059mmol)、反式-二氯二(三苯基膦) 钯(II)(0.028g,0.039mmol)和CuI(0.011g,0.059mmol)。在微波照射下在 120℃下加热反应混合物20分钟，然后真空浓缩至干燥，并通过硅胶层 析法(BiotageIsolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中0-100%EtOAc， 40-60℃，然后为处于EtOAc中0-5%甲醇)加以纯化，以产生标题化合物 (I62)(0.151g，66%产率)，为橙色胶；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.32 (s,1H),8.77(s,1H),8.72(s,1H),7.75–7.67(m,2H),7.67–7.64(m,1H), 7.60–7.56(m,2H).),6.95(d,J=9.1Hz,2H),4.40(s,2H),3.51–3.42(m, 4H),3.11–3.00(m,4H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt6.23min,m/z579.2 [M+H]+。
(g)4-(4-((4-(2-(3-氧异吲哚啉-4-基)乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基) 苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I63)
在氮气氛下，将4-(4-((4-((3-氧异吲哚啉-4-基)乙炔基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I62)(0.149g,0.258mmol)溶解 于干燥DMF(6mL)。将处于EtOAc(6mL)中的20%Pearlman催化剂(0.090 g)加入溶液并将气氛改变成氢气(气球)。用气球密封反应并在室温下搅拌 18小时。通过经由Celite（硅藻土）过滤除去催化剂，用EtOAc(5x10mL) 对其加以洗涤。真空除去溶剂以产生黄色固体，通过硅胶层析法(Biotage Isolera，40gSi卡套柱，处于石油醚中0-100%EtOAc，40-60℃，然后为 处于EtOAc中0-5%甲醇)对其进行纯化，以产生标题化合物(I63)(0.084g， 56%产率)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.98(s,1H), 8.57(s,1H),8.48(s,1H),7.62–7.55(m,2H),7.44(t,J=7.4Hz,1H),7.38(d, J=7.3Hz,1H),7.17(brd,J=6.0Hz,1H),6.92(d,J=9.0Hz,2H),4.31(s, 2H),3.56(t,J=7.6Hz,2H),3.51–3.41(m,4H),3.12(t,J=7.5Hz,2H), 3.08–2.98(m,4H),1.42(s,9H)。LCMS方法A：rt5.86min；m/z583.5 [M+H]+。
(h)7-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)异 吲哚啉-1-酮(15)
在氮气氛下，将4-(4-((4-(2-(3-氧异吲哚啉-4-基)乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I63)(0.080g,0.137mmol)溶解 于DCM(5mL)。将三氟乙酸(0.210mL,2.75mmol)加入溶液并在室温下搅 拌反应1小时，然后在35℃下搅拌另外30分钟。添加更多三氟乙酸(0.100 mL)并在35℃下进一步搅拌反应另外30分钟。真空除去挥发物，然后将 EtOAc(70mL)和2MNaOH水溶液(70mL)加入残余物并对层加以分离。 用EtOAc(2x70mL)提取水层，用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤合并的有机 物，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生油状固体，将其吸收在 DCM(～10mL)中并真空浓缩。重复上述过程两次，其后，在高真空下进一 步干燥样品，以产生标题化合物(15)(0.050g，75%产率)，为灰白色固体； 1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.94(s,1H),8.56(s,1H),8.48(s,1H),7.59 –7.52(m,2H),7.47–7.36(m,2H),7.23–7.11(m,1H),6.87(d,J=9.0Hz, 2H),4.31(s,2H),3.56(t,J=7.6Hz,2H),3.11(t,J=7.4Hz,2H),3.01–2.95 (m,4H),2.86–2.79(m,4H)。LCMS方法A：rt4.40min；m/z483.8[M+H]+。
实施例16：2-(2-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(16)
在氮气氛下，将甲醛(37%，在H2O中；15.6μL，0.210mmol)加入处 于无水甲醇(5mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(11)(25mg,0.053mmol)的悬浮液。然后一次性 将三乙酰氧基硼氢化钠(0.111g,0.525mmol)加入反应混合物。在室温下搅 拌反应1.5小时。真空除去挥发物并用EtOAc(25mL)和饱和NaHCO3水溶 液(25mL)稀释残余物。对层加以分离并用EtOAc(2x25mL)提取水层，用 水(25mL)、盐水(25mL)洗涤合并的有机层，并在Na2SO4上干燥。在减压 下除去溶剂以产生白色固体。将固体悬浮在DCM(2mL)和环己烷(10mL) 中，然后过滤，以产生标题化合物(16)(19mg，73%)，为白色固体；1HNMR (400MHz,d6-DMSO)δ10.14(s,1H),8.65(s,1H),7.70–7.61(m,2H),7.44 (s,1H),7.27–7.12(m,6H),6.93(s,1H),3.50(s,2H),3.14–2.97(m,4H), 2.88(d,J=10.6Hz,2H),2.46–2.36(m,1H),2.22(s,3H),2.07–1.93(m, 2H),1.78–1.58(m,4H)。LCMS方法C：rt4.86min；m/z498[M+H]+。
实施例17：2-(2-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(17)
(a)2-(2-((2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯 (I64)
在氮气下，将4-碘-2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶(I14)(2.00g,6.24 mmol)、PdCl2(PPh3)2(438mg,625μmol)、CuI(119mg,625μmol)和三苯基 膦(164mg,625μmol)放入烘箱干燥的微波反应小瓶中。添加2-(2-乙炔基苯 基)乙酸甲酯(I4)(1.31g,7.49mmol)、THF(20mL)和TEA(10mL)并在100℃ 下在微波照射下搅拌产生的混合物10分钟。在减压下蒸发挥发物，然后 将残余物吸附到二氧化硅上（来自DCM）。在硅胶(0-25%乙酸乙酯/石油 醚，40-60℃)上对预吸附材料进行层析，以产生标题化合物(I64)(1.571g， 69%)，为橙色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.71(d,J=0.8Hz,1H), 7.68(dd,J=7.7,1.1Hz,1H),7.50–7.29(m,3H),3.93(s,2H),3.71(d,J= 3.4Hz,3H),2.62(d,J=3.4Hz,3H)。
(b)2-(2-((2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯基)乙酸 甲酯(I65)
将2-(2-((2-(甲硫基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯 (I64)(3.14g,8.57mmol)溶解于DCM(150mL)并将产生的溶液冷却至0℃。 添加mCPBA(70%;4.65g,18.9mmol)，然后允许反应混合物加温至室温， 在此温度下，继续搅拌过夜。用10%NaHCO3(200mL)洗涤粗制混合物并 对层加以分离。干燥(MgSO4)有机物，然后在减压下蒸发，以产生浅黄色 固体。将固体吸附到二氧化硅上，然后在硅胶(0-50%乙酸乙酯/石油醚， 40-60℃)上进行层析，以产生标题化合物(I65)(2.876g，84%)，为黄色固体； 1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.13(d,J=0.7Hz,1H),7.73(dd,J=7.6,0.9 Hz,1H),7.54–7.46(m,1H),7.44–7.32(m,2H),3.94(s,2H),3.77–3.67(m, 3H),3.43(s,3H)。LCMS方法C：rt5.90min；m/z421.0(M+Na),399.1(M+1), 367.0(M-OMe),339.1(M-COOMe)。
(c)2-(2-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸 甲酯(I66)
将2-(2-((2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯基)乙酸甲 酯(I65)(1.50g,3.76mmol)吸收在DMF(30mL)中，然后添加10%Pd/C(750 mg)。在室温下在H2(1个大气压)下搅拌产生的悬浮液16小时。通过Celite （硅藻土）来过滤粗制反应混合物，并用MeOH洗涤。在减压下蒸发滤液 以产生黄色液体，其吸附到二氧化硅上。在硅胶(0-100%乙酸乙酯/石油醚， 40-60℃)上层析二氧化硅吸附的材料，以产生标题化合物(I66)(1.38g， 91%)，为黄色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.07(d,J=0.7Hz,1H), 7.30–7.12(m,4H),3.72(s,2H),3.68(s,3H),3.41–3.35(m,2H),3.35(s, 3H),3.20(dd,J=9.6,6.3Hz,2H)。LCMS方法C：rt5.92min；m/z425.1 (M+Na),403.1(M+1),401.1(M-1),371.1(M-OMe),343.1(M-COOMe)。
(d)2-(2-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I67)
将3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺(36.0mg,186μmol)溶解于三氟乙醇(1 mL)，然后添加2-(2-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基) 乙酸甲酯(I66)(50mg,124μmol)，接着加入三氟乙酸(48μL)。在100℃下 在微波照射下搅拌产生的混合物10分钟。将产生的混合物吸附到二氧化 硅上，然后在硅胶(0-10%MeOH/DCM)上进行层析，以产生标题化合物 (I67)，为黄色液体(69mg)。LCMS方法C：rt5.10min；m/z514.3(M+1)。 重复此操作并合并反应产物，用于以下合成步骤。
(e)2-(2-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯基)乙酸(I68)
将2-(2-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯基)乙酸甲酯(I67)(150mg,292μmol)溶解于THF(10mL)，然后添加 LiOH.H2O(36.7mg,876μmol)。添加水(2mL)，然后添加MeOH(1mL)。在 室温下搅拌产生的混合物16小时，然后通过在减压下蒸发来除去挥发物。 将残余物溶解于MeOH(3mL)，然后用浓HCl酸化至pH2-3。在减压下蒸 发挥发物以产生橙色残余物。在硅胶(0-20%MeOH/DCM)上层析残余物， 以产生标题化合物(I68)(120mg，82%)，为黄色结晶固体；1HNMR(400 MHz,d6-DMSO)δ11.04(bs,1H),10.12(s,1H),8.68(s,1H),7.44(m,1H), 7.35(m,1H),7.24-7.18(m,5H),6.72(m,1H),3.77-3.74(m，被残余水信号部 分地遮掩),3.44(m,3H),3.17-3.03(m,8H),2.78(s,3H)。LCMS方法C：rt 4.92min；m/z500.3(M+1),498.2(M-1),454.3(M-COOH)。
(f)2-(2-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯基)乙酰胺(17)
将2-(2-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯基)乙酸(I68)(75.0mg,169μmol)溶解于DMF(1mL)，然后添加 HATU(129mg,339μmol)、DIPEA(57uL,339μmol)和氯化铵(181mg,3.39 mmol)。在室温下搅拌产生的混合物过夜，然后在减压下蒸发挥发物。用 乙酸乙酯稀释残余物并用10%NaHCO3洗涤，对层加以分离并干燥(MgSO4) 有机层，然后在减压下蒸发，以产生乳膏固体。将乳膏固体吸附到二氧化 硅上并在硅胶(0-10%MeOH/DCM)上进行层析，以产生标题化合物 (17)(23.3mg，28%)，为乳膏固体；1HNMR(400MHz,CD3CN)δ8.57(s,1H), 8.34(s,1H),7.58(s,1H),7.30–7.16(m,5H),7.09(d,J=8.0Hz,1H),6.71 (dd,J=8.2,1.9Hz,1H),3.61(s,2H),3.27(t,J=4.9Hz,4H),3.19–3.03(m, 4H),2.92(bs,4H),2.91(s,3H)。LCMS方法C：rt4.43min；m/z499.7。
实施例18：N-甲基-2-(2-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三 氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(18)
将2-(2-(2-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯基)乙酸(I68)(75.0mg,169μmol)溶解于DMF(1mL)，然后添加 HATU(129mg,339μmol)、DIPEA(57μL,339μmol)和甲胺(8.0M，在乙醇 中；200μL)。在室温下搅拌产生的混合物过夜，然后在减压下蒸发挥发物。 用乙酸乙酯稀释残余物并用10%NaHCO3洗涤，对层加以分离并干燥 (MgSO4)有机层，然后在减压下蒸发，以产生乳膏固体。将乳膏固体吸附 在二氧化硅上并在硅胶(0-10%MeOH/DCM)上进行层析，以产生标题化合 物(18)(9.0mg，10%)，为固体；1HNMR(400MHz,CD3CN)δ8.56(d,J=0.6 Hz,1H),8.36–8.28(m,1H),7.39(s,1H),7.20(ddd,J=5.6,4.4,1.9Hz,6H), 6.71–6.65(m,1H),6.33–6.23(m,1H),3.56(s,2H),3.22–3.15(m,4H), 3.10(s,2H),3.07(s,2H),2.60(d,J=4.7Hz,3H),2.49–2.43(m,4H)。LCMS 方法C：rt4.86min；m/z513.3。
实施例19：2-甲基-5-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧 啶-4-基)乙基)苯甲酰胺(19)
(a)5-溴-2-甲基苯甲酰胺(I69)
向处于DMF(8mL)中的5-溴-2-甲基苯甲酸(0.538g,2.50mmol)和 HATU(1.289g,3.390mmol)的混合物添加DIPEA(0.800mL,4.59mmol)。在 添加NH4OH(0.50mL)以前，搅拌混合物10分钟，然后在室温下搅拌16 小时。将混合物倒入水中并在经由真空过滤来收集产生的沉淀物以前在 0℃下冷却20分钟，以产生标题化合物(I69)(0.292g，55%)；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ7.58(d,J=2.1Hz,1H),7.45(dd,J=8.2,2.1Hz,1H),7.12(d, J=8.2Hz,1H),5.68(bs,2H),2.44(s,3H)。LCMS方法C：rt4.89min；m/z 214,216[M+H]+。
(b)2-甲基-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯甲酰胺(I70)
向处于DMF(3mL)中的5-溴-2-甲基苯甲酰胺(I69)(0.292g,1.36 mmol)、PdCl2(PPh3)2(0.049g,0.070mmol)、三苯基膦(0.054g,0.21mmol) 和碘化铜(0.036g,0.19mmol)的混合物添加三乙胺(0.570mL,4.09mmol)和 三甲基甲硅烷基乙炔(0.210mL,1.49mmol)，并在微波照射下在120℃下 加热产生的混合物25分钟。在减压下浓缩产生的混合物并利用硅胶柱层 析法(0-20%EtOAc/石油醚，40-60℃)加以纯化，以产生标题化合物 (I70)(0.190g，60%)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.80(s,1H),7.40(m, 3H),7.24(d,J=7.9Hz,1H),2.36(s,3H),0.22(s,9H)。
(c)5-乙炔基-2-甲基苯甲酰胺(I71)
在0℃下，向处于THF(4mL)中的2-甲基-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔 基)苯甲酰胺(I70)(0.190g,0.819mmol)的溶液添加处于THF(0.5mL)中的 TBAF的1.0M溶液。然后在N2下在0℃下搅拌混合物10分钟，然后在 室温下搅拌3小时。在减压下浓缩产生的混合物，然后用水稀释。通过真 空过滤来收集产生的沉淀物，以产生标题化合物(I71)(0.087g，67%)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ7.80(s,1H),7.41(m,3H),7.25(d,J=7.7Hz, 1H),4.17(s,1H),2.36(s,3H)。
(d)4-(4-((4-((3-氨基甲酰基-4-甲基苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2- 基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I72)
向处于DMF(2mL)中的5-乙炔基-2-甲基苯甲酰胺(I71)(0.041g,0.25 mmol)、4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯 (I3)(0.105g,0.230mmol)、PdCl2(PPh3)2(0.011g,0.016mmol)、三苯基膦 (0.010g,0.038mmol)和碘化铜(I)(0.010g,0.53mmol)的混合物添加三乙胺 (0.091mL,0.65mmol)。然后在微波照射下在120℃下加热混合物30分钟。 在减压下浓缩产生的混合物，然后利用硅胶柱层析法(0-100%EtOAc/石油 醚，40-60℃)加以纯化，以产生标题化合物(I72)(0.092g，69%)；1HNMR (400MHz,d6-DMSO)δ10.24(s,1H),8.75(s,1H),8.31(s,1H),7.90(s,1H), 7.58(m,4H),7.39(m,1H),6.96(d,J=9.0Hz,2H),3.46(dd,J=6.3,3.3Hz, 4H),3.06(m,4H),2.42(s,3H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt6.22min； m/z581.2[M+H]+。
(e)4-(4-((4-(3-氨基甲酰基-4-甲基苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I73)
在H2气氛下，搅拌处于DMF(5mL)中的4-(4-((4-((3-氨基甲酰基-4- 甲基苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯 (I72)(0.092g,0.16mmol)和10%Pd/C(0.116g)的混合物过夜。通过Celite （硅藻土）来过滤混合物，然后在减压下浓缩。然后利用硅胶柱层析法 (0-100%EtOAc/石油醚，40-60℃)来纯化残余物并用甲醇研磨产物。通过 真空过滤来收集产生的沉淀物以产生标题化合物(I73)(29.5mg，32%)；1H NMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.00(s,1H),8.61(s,1H),7.66(s,1H),7.55(d, J=9.0Hz,2H),7.33(s,1H),7.25(s,1H),7.16(m,2H),6.94(d,J=9.1Hz, 2H),3.46(m,4H),3.04(m,8H),2.32(s,3H),1.42(s,9H)。LCMS方法C：rt 6.18min；m/z585.3[M+H]+。
(f)2-甲基-5-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯甲酰胺(19)
向处于DCM(2mL)中的4-(4-((4-(3-氨基甲酰基-4-甲基苯乙基)-5-(三 氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I73)(0.029g,0.054mmol) 添加TFA(0.100mL,1.36mmol)并在室温下搅拌混合物过夜(16小时)。然 后在减压下浓缩产生的混合物并将残余物吸收在EtOAc(10mL)中。用 10%NaOH水溶液(10mL)洗涤产生的有机悬浮液并用EtOAc(2x10mL)提 取水层。用水(15mL)洗涤合并的有机物，然后在减压下浓缩。将残余物 吸收在DCM(4mL)和TFA(0.200mL)中并搅拌过夜(16小时)。在减压下浓 缩产生的混合物，然后用EtOAc(15mL)稀释。用10%NaOH水溶液(15mL) 洗涤产生的溶液，然后用EtOAc(15mL)提取水层。用水(20mL)洗涤合并 的有机提取物，然后在减压下浓缩以前利用相分离卡套柱进行干燥，以产 生标题化合物(19)(5.1mg，21%)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ9.96(s, 1H),8.60(s,1H),7.67(s,1H),7.53(d,J=9.0Hz,2H),7.33(s,1H),7.25(s, 1H),7.16(m,2H),6.90(d,J=9.1Hz,2H),3.01(m,8H),2.83(m,4H),2.32 (s,3H)。LCMS方法C：rt4.76min；m/z485.1[M+H]+。
实施例20：2-(2-(2-(2-((4-(4-氨基哌啶-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(20)
(a)(1-(4-硝基苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(I74)
将哌啶-4-基氨基甲酸叔丁酯(1.200g,5.992mmol)和4-氟硝基苯 (0.705g,4.99mmol)放入30mL微波小瓶，然后添加乙腈(20mL)，接着添 加二异丙基乙胺(1.778mL,9.986mmol)。在微波照射下在150℃下加热反 应15分钟。用EtOAc(200mL)和2MHCl水溶液(150mL)稀释反应混合物， 对层加以分离并用EtOAc(2×100mL)提取水层，合并有机物并用盐水(150 mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生标题化合物(I74)(1.040 g，65%)，为黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ8.06–7.99(m,2H), 7.03–6.97(m,2H),6.88(d,J=7.5Hz,1H),4.01–3.93(m,2H),3.62–3.47 (m,1H),3.13–3.02(m,2H),1.85–1.74(m,2H),1.44–1.30(m,11H)。
(b)(1-(4-氨基苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(I75)
在氮气氛下，将(1-(4-硝基苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(I74)(1.038 g,3.230mmol)溶解于干燥DMF(15mL)、EtOAc(15mL)和无水EtOH(15 mL)。将处于EtOAc(5mL)中的10%Pd/C(0.200g)加入溶液并将气氛改变 成氢气(气球)。用气球密封反应并在室温下搅拌18小时。通过经由Celite （硅藻土）过滤除去催化剂，用EtOAc(5x10mL)对其加以洗涤。真空除 去溶剂以产生粉色固体，通过硅胶层析法（使用处于石油醚中0-80%乙酸 乙酯的梯度，40-60℃）对其加以纯化，以产生标题化合物(I75)(0.730g， 78%)，为紫棕色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.81(d,J=8.6Hz,2H), 6.64(d,J=8.7Hz,2H),4.55–4.41(m,1H),3.64–3.32(m,5H),2.72(t,J= 11.0Hz,2H),2.08–1.98(m,2H),1.56(ddd,J=23.7,11.3,3.9Hz,2H),1.45 (s,9H)。).LCMS方法C：rt0.38min；m/z292.0[M+H]+。
(c)(1-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-4-基)氨基甲 酸叔丁酯(I76)
在0℃下，在1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷混合物(30mL)中搅拌2,4-二 氯-5-(三氟甲基)嘧啶(0.551g,2.54mmol)。经10分钟，小心添加处于乙醚 (2.903mL,2.903mmol)中的1.0MZnCl2溶液，在添加以后，在0℃下搅 拌反应30分钟。在0℃下，经15分钟，滴加处于1:1t-BuOH:1,2-二氯乙 烷(15mL)中的(1-(4-氨基苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(I75)(0.705g, 2.42mmol)的溶液，经15分钟滴加处于1:1t-BuOH:1,2-二氯乙烷(15mL) 中的NEt3(0.405mL,2.903mmol)的溶液，并允许反应加温至室温，然后搅 拌18小时。真空蒸发有机溶剂并将粗制油状固体悬浮于水(200mL)，超 声处理悬浮液30分钟并通过过滤来分离产物，用水(10×20mL)洗涤固体 并在高真空下干燥。通过硅胶层析法（使用处于石油醚中0-50%乙酸乙酯 的梯度，40-60℃）来进一步纯化上述材料，以产生标题化合物(I76)(0.730 g，64%)，为黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.41(s,1H),8.71 (s,1H),7.46(d,J=7.7Hz,2H),6.92(d,J=8.9Hz,2H),6.84(d,J=7.1Hz, 1H),3.60(d,J=12.4Hz,2H),2.69(t,J=10.9Hz,2H),1.78(d,J=10.9Hz, 2H),1.54–1.34(m,11H)。LCMS方法C：rt6.36min；m/z474.1[M+H]+。
(d)2-(2-((2-((4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-5-(三 氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯基)乙酸甲酯(I77)
在10mL微波小瓶中，超声处理处于DMF(6mL)中的(1-(4-((4-氯 -5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(I76)(550 mg,1.17mmol)、CuI(15mg,0.12mmol)、三苯基膦(31mg,0.117mmol)和 三乙胺(487μL,3.50mmol)的悬浮液5分钟，对其添加PdCl2(PPh3)2(54.0mg, 0.077mmol)和2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)(305mg,1.75mmol)，并在微 波照射下加热反应至120℃持续20分钟。在冷却以后，在硅胶上利用梯 度洗脱(处于石油醚中0-100%乙酸乙酯，40-60℃)来层析反应混合物，以 产生标题化合物(I77)和均偶合的乙炔的混合物，其可以直接使用而无需进 一步纯化。
(e)2-(2-(2-(2-((4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-5-(三 氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I78)
向处于DMF(10mL)和三乙胺(1mL)中的粗制2-(2-((2-((4-(4-((叔丁氧 基羰基)氨基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙炔基)苯基) 乙酸甲酯(I77)的溶液添加20%Pd(OH)2(0.92g)，并在室温下在氢气氛下搅 拌产生的悬浮液过夜。通过Celite（硅藻土）来过滤反应混合物并用 EtOAc(3×75mL)洗涤滤饼。将合并的滤液蒸发至干燥以产生棕色固体，将 其悬浮在MeOH(25mL)中，然后超声处理。将产生的悬浮液过滤以产生 标题化合物(I78)(211mg,29%)，为褐色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO) δ9.97(s,1H),8.60(s,1H),7.55(d,J=9.0Hz,2H),7.29–7.15(m,4H),6.96 –6.78(m,3H),3.76(s,2H),3.64–3.49(m,5H),3.38(s,2H),3.11–3.00(m, 2H),3.00–2.91(m,2H),2.68(t,J=12.0Hz,2H),1.80(d,J=10.7Hz,2H), 1.48(ddd,J=15.0,12.2,3.5Hz,2H),1.39(s,9H)。LCMS方法C：rt5.87 min；m/z614[M+H]+。
(f)(1-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(I79)
将氢氧化锂一水合物(43.0mg,1.03mmol)加入处于THF(10mL)、 MeOH(1.0mL)和水(1.5mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(4-((叔丁氧基羰基)氨基)哌 啶-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯(I78)(211 mg,0.344mmol)的悬浮液，并在室温下搅拌产生的混合物16小时。真空 除去有机物，然后添加2MNaOH水溶液(100mL)。用EtOAc(2×100mL) 提取产生的溶液，然后干燥(MgSO4)合并的有机提取物，并真空除去溶液， 以产生白色固体。在氮气氛下，将固体溶解于干燥THF(10mL)和干燥 DMF(2mL)。向此溶液添加1-羟基苯并三唑(72mg,0.53mmol)、EDCl(101 g,0.529mmol)和N,N-二异丙基乙胺(246μL,1.41mmol)，并在室温下搅拌 产生的混合物10分钟。一次性添加碳酸铵(203mg,2.12mmol)并在室温下 搅拌反应3天。真空除去挥发物并将残余物吸收在EtOAc(100mL)和饱和 NaHCO3水溶液(100mL)中。对层加以分离并用EtOAc(70mL)提取水层。 用水(2×100mL)、盐水(50mL)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)并真空浓 缩，以产生黄色固体，将其溶解于少量丙酮并用40-60℃的石油醚沉淀， 以产生标题化合物(I79)(138mg，65%)，为黄色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ9.97(s,1H),8.60(s,1H),7.56(d,J=8.9Hz,2H),7.44(s,1H), 7.27–7.12(m,4H),6.96–6.81(m,4H),3.58(d,J=12.7Hz,2H),3.50(s, 2H),3.15–2.93(m,J=15.2,6.3Hz,4H),2.67(t,J=12.0Hz,2H),1.79(d,J =11.4Hz,2H),1.55–1.42(m,2H),1.39(s,9H)。LCMS方法C：rt5.30min； m/z599[M+H]+。
(g)2-(2-(2-(2-((4-(4-氨基哌啶-1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)苯基)乙酰胺(20)
在氮气氛下，将(1-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-4-基)氨基甲酸叔丁酯(I79)(138mg,0.231mmol) 溶解于干燥二氯甲烷(10mL)。将三氟乙酸(1.0mL,13mmol)加入溶液并在 室温下搅拌反应过夜。真空除去挥发物，将EtOAc(50mL)和饱和NaHCO3水溶液(50mL)加入残余物并对层加以分离。用EtOAc(50mL)提取水层， 用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤合并的有机物，干燥(MgSO4)并真空浓缩， 以产生黄色固体，将其吸收在丙酮(～2mL)中并用40-60℃的石油醚沉淀， 以产生标题化合物(20)(47mg，41%)，为白色固体；1HNMR(400 MHz,d6-DMSO)δ9.96(d,J=6.3Hz,1H),8.60(d,J=1.4Hz,1H),7.56(t,J =7.8Hz,2H),7.44(s,1H)7.32–7.10(m,4H),7.03–6.84(m,3H),3.70– 3.53(m,2H),3.50(s,2H),3.18–2.91(m,4H),2.85–2.60(m,J=34.4,8.4 Hz,3H),1.84–1.70(m,2H),1.69–1.54(m,J=15.3,6.6Hz,2H)。LCMS方 法C：rt4.64min；m/z499[M+H]+。
实施例21：2-(2-(2-(2-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(21)
(a)6-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸叔丁酯(I80)
将6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸叔丁酯(0.500g,2.01mmol)、 2-(2-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯 (I66)(0.675g,1.68mmol)、三氟乙醇(3mL)、和TFA(0.3mL)装入微波管， 超声处理两分钟，然后在微波照射下在100℃下加热20分钟。将冷却的 混合物浓缩，与甲苯(3x20mL)共蒸发并加载到处于甲醇中的10gSCX卡 套柱上。用甲醇(200mL)，然后用1%甲醇甲胺(200mL)洗脱卡套柱。浓缩 甲醇甲胺洗脱液以产生棕色油(0.850g)。将油溶解于DCM(5mL)中，并添 加Boc酸酐(549mg,2.52mmol)。在油起泡器下搅拌产生的混合物18小时， 然后用DCM(50mL)稀释并用水(50mL)洗涤。用DCM(2x50mL)提取水 层，并干燥(相分离过滤器)和蒸发合并的DCM相。层析法(Isolera，40g 二氧化硅卡套柱，0-50%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)产生标题化合物 (I80)(520mg，54%)，为黄色浆料；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H), 7.45(s,2H),7.38(s,1H),7.28–7.18(m，重叠与CDCl3),7.10(d,J=8.5Hz, 1H),4.56(s,2H),3.75(s,2H),3.70–3.62(m,5H),3.17–3.03(m,4H),2.85 (t,J=5.6Hz,2H),1.50(s,9H)。LCMS方法C：rt6.93min；m/z571.1[M+H] +,m/z515.0[M+tBu+2H]+。
(b)2-(2-(2-(2-((2-(叔丁氧基羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I81)
将6-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸叔丁酯(I80)(520mg,0.91mmol)溶解于 THF(20mL)，并添加处于水(5mL)中的氢氧化锂水合物(76mg.1.8mmol) 的溶液。在18小时以后，在减压下除去THF，用水(10mL)稀释混合物并 用乙酸乙酯(3x50mL)提取。用盐水洗涤合并的乙酸乙酯相，干燥(硫酸钠) 并蒸发，以产生标题化合物(I81)(414mg,81%产率)，为黄色固体；1HNMR (400MHz,d6-DMSO)δ10.36(s,1H),8.65(s,1H),7.64(s,1H),7.59(d,J= 8.4Hz,1H),7.20–7.02(m,5H),4.45(s,2H),3.54(t,J=5.8Hz,2H),3.17(s, 2H),3.14–2.98(m,4H),2.76(t,J=5.7Hz,2H),1.43(s,9H)。LCMS方法C： rt6.51min；m/z557.1[M-Li+2H]+,501.1[M-tBu-Li+3H]+,457.1 [M-Li-Boc+3H]+;m/z555.1[M-Li]-。
(c)6-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸叔丁酯(I82)
将2-(2-(2-(2-((2-(叔丁氧基羰基)-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-5-(三 氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I81)(205mg,0.37mmol)溶解于 DMF(3mL)，并添加HATU(154mg,0.41mmol)。在搅拌3分钟以后，添 加碳酸铵(212mg,2.20mmol)和DIPEA(0.26mL,1.5mmol)，并在室温下搅 拌混合物18小时。将产生的混合物加入水(50mL)和饱和碳酸氢钠(10 mL)，然后用乙酸乙酯(3x50mL)提取。用盐水(2x50mL)洗涤有机提取物， 干燥(硫酸钠)并蒸发至干燥。层析(12g二氧化硅卡套柱，0-100%乙酸乙酯 /石油醚，40-60℃)残余物并用乙醚研磨产物，以产生标题化合物(I82)(138 mg，67%)，为灰白色泡沫；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(s,1H),7.57 (s,1H),7.43(d,J=8.9Hz,2H),7.29–7.26(m，重叠与CHCl3),7.10(d,J= 8.4Hz,1H),5.36(d,J=14.4Hz,2H),4.55(s,2H),3.73(s,2H),3.65(s,2H), 3.15–3.04(m,4H),2.85(t,J=5.8Hz,2H),1.50(s,9H)。LCMS方法C：rt 6.36min；m/z556.1[M+H]+,500.0[M-tBu+2H]+,456.1[M-Boc+2H]+;m/z 554.2[M-H]-。
(d)2-(2-(2-(2-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯基)乙酰胺(21)
在室温下一起搅拌6-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-羧酸叔丁酯(I82)(136mg,0.245 mmol)、DCM(10mL)和TFA(1mL)。在三小时以后，浓缩溶液并用1M氢 氧化钠(25mL)处理残余物。用乙酸乙酯(3x50mL)提取产生的悬浮液并用 盐水(100mL)洗涤合并的有机提取物，干燥并蒸发，以产生标题化合物 (21)(81.6mg，74%产率)，为白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ 10.06(s,1H),8.65(s,1H),7.51(s,1H),7.48(dd,J=8.3,2.1Hz,1H),7.42(s, 1H),7.26–7.21(m,1H),7.19–7.13(m,3H),6.96(d,J=8.3Hz,1H),6.90(s, 1H),3.81(s,2H),3.49(s,2H),3.17(d,J=3.1Hz,1H),3.14–3.06(m,2H), 3.05–2.97(m,2H),2.94(t,J=5.9Hz,2H),2.67(t,J=5.6Hz,2H)。LCMS 方法C：rt:4.76min；m/z456.1[M+H]+;m/z454.1[M-H]-。
实施例22：2-(2-(2-(2-((4-(吗啉-2-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)苯基)乙酰胺(22)
(a)2-(4-硝基苯基)环氧乙烷(I83)
在甲醇(30mL)中搅拌2-溴-1-(4-硝基苯基)乙酮(1.9g,7.9mmol)并在 冰浴中冷却悬浮液。一次性添加硼氢化钠(0.33g,8.7mmol)并在五分钟以 后移开冰浴并在室温下搅拌混合物。在三小时以后，添加碳酸钾(1.1g,7.9 mmol)，并在室温下搅拌混合物另外16小时。蒸发甲醇，添加水(50mL)， 并用DCM(3x100mL)提取混合物。用盐水洗涤合并的DCM相，干燥(硫 酸钠)并蒸发，以产生标题化合物(I83)(1.296g，99%产率)，为黄色固体； 1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.25–8.18(m,2H),7.50–7.41(m,2H),3.96 (dd,J=4.1,2.5Hz,1H),3.23(dd,J=5.5,4.1Hz,1H),2.78(dd,J=5.5,2.5 Hz,1H)。LCMS方法C：rt5.42min。
(b)N-(2-羟基-2-(4-硝基苯基)乙基)-4-甲基苯磺酰胺(I84)
将甲苯磺酰基酰胺(0.69g,4.0mmol)、2-(4-硝基苯基)环氧乙烷 (I83)(0.33g,2.0mmol)、苄基三乙基铵氯化物(46mg,0.20mmol)和碳酸钾 (28mg,0.20mmol)悬浮在二氧杂环己烷(1.0mL)中，并在90℃下搅拌产生 的混合物。在四小时以后，将混合物冷却至室温并倒入DCM(15mL)。过 滤和蒸发产生的混合物。层析(Isolera，40g二氧化硅卡套柱，0-100%乙酸 乙酯/石油醚，40-60℃)残余物以产生标题化合物(I84)，为橙色固体(363 mg，38%产率)；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ8.19–8.13(m,2H),7.64– 7.59(m,2H),7.57–7.52(m,2H),7.34(d,J=7.9Hz,2H),7.27(s,1H),5.82 (d,J=4.5Hz,1H),4.71(dd,J=10.7,6.0Hz,1H),2.92(td,J=6.2,1.7Hz, 2H),2.36(s,3H)。LCMS方法C：rt5.55min,m/z335.0[M-H]-。
(c)2-(4-硝基苯基)-4-甲苯磺酰基吗啉(I85)
在DCM(20mL)中超声处理N-(2-羟基-2-(4-硝基苯基)乙基)-4-甲基苯 磺酰胺(I84)(0.610g,1.34mmol)五分钟并在氮气下冷却至0℃。添加 NaH(0.220g,5.44mmol)的60%分散体并在添加(2-溴乙基)二苯基锍三氟 甲磺酸盐(1.21g,2.72mmol)以前搅拌混合物五分钟。搅拌混合物17小时， 从而允许经过这段时间将水浴冷却至室温。添加乙酸乙酯(200mL)、饱和 氯化铵(80mL)和水(20mL)并对层进行分离。用乙酸乙酯(2x100mL)提取 水相并用盐水洗涤合并的乙酸乙酯相，干燥(硫酸钠)并蒸发。层析(Isolera， 40g二氧化硅卡套柱，0-40%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)残余物以产生标 题化合物(I85)(433mg，88%)，为白色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ 8.22–8.18(m,2H),7.63–7.59(m,2H),7.52–7.48(m,2H),7.33(dd,J=8.5, 0.6Hz,2H),4.71(dd,J=10.2,2.6Hz,1H),4.10(ddd,J=11.6,3.4,1.4Hz, 1H),3.87(td,J=11.6,2.7Hz,1H),3.82–3.77(m,1H),3.65(ddt,J=11.6, 2.8,1.6Hz,1H),2.51(td,J=11.6,3.4Hz,1H),2.43(s,3H),2.18(dd,J=11.5, 10.3Hz,1H)。LCMS方法C：rt6.20min；m/z363.0[M+H]+。
(d)2-(4-硝基苯基)吗啉(I86)
在75℃下，在密封管(微波管，常规加热)中，加热2-(4-硝基苯基)-4- 甲苯磺酰基吗啉(I85)(430mg,1.19mmol)、苯酚(670mg,7.12mmol)和33% HBr/AcOH(2.2mL)的混合物20小时。浓缩冷却的混合物并将残余物加载 到处于甲醇中的10gSCX卡套柱上。用甲醇(200mL)洗涤卡套柱，然后用 1%甲醇甲胺(100mL)洗脱。蒸发甲胺洗脱液以产生标题化合物(I86)(204 mg，83%)，为黄色油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.27–8.18(m,2H),7.57 –7.51(m,2H),4.63(dd,J=10.3,2.5Hz,1H),4.13–4.04(m,1H),3.82(td,J =11.3,3.1Hz,1H),3.13(dd,J=12.3,2.5Hz,1H),3.06–2.92(m,2H),2.74 (dd,J=12.3,10.3Hz,1H)。LCMS方法C：rt1.49,1.58min；m/z209.1 [M+H]+。
(e)2-(4-硝基苯基)吗啉-4-羧酸叔丁基酯(I87)
将2-(4-硝基苯基)吗啉(I86)(200mg,0.961mmol)溶解于DCM(5mL)， 然后添加DMAP(12mg,10mol%)和Boc酸酐(0.265mL,1.15mmol)。在1 小时以后，用DCM(20mL)稀释混合物，并用水(20mL)洗涤。用DCM(2x20 mL)提取水相，并干燥(疏水性玻璃料)和蒸发合并的DCM提取物。层析(12g 二氧化硅卡套柱，0-40%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)残余物以产生标题化 合物(I87)(0.230g，78%)，为白色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.26– 8.19(m,2H),7.60–7.53(m,2H),4.53(dd,J=10.5,2.6Hz,1H),4.17(brs, 1H),4.05(dd,J=11.5,2.4Hz,1H),3.97(brs,1H),3.70(td,J=11.7,2.8Hz, 1H),3.06(t,J=11.2Hz,1H),2.84–2.67(m,1H),1.49(s,9H)。LCMS方法 C：rt6.23min；m/z209.1[M-Boc+2H]+。
(f)2-(4-氨基苯基)吗啉-4-羧酸叔丁酯(I88)
一起回流2-(4-硝基苯基)吗啉-4-羧酸叔丁酯(I87)(100mg,0.324 mmol)、活性炭(20mg)、氯化铁(III)六水合物(9mg,10mol%)、甲醇(1mL) 和肼水合物(162mg,1.62mmol50%)五小时。通过棉花来过滤混合物， 并用DCM(5mL)洗涤棉花。蒸发滤液，并再溶解于95%乙醇(3mL)和乙酸 乙酯(2mL)。添加处于水(1mL)中的氯化铵(173mg.3.24mmol)的溶液，接 着添加铟粉末(153mg,1.30mmol)。回流混合物四小时，然后过滤。用 DCM(20mL)洗涤收集的固体，然后用水(10mL)和饱和碳酸氢钠(10mL) 稀释合并的滤液。用DCM(2x25mL)洗涤水相，干燥(相分离过滤器)并蒸 发合并的DCM提取物。将残余物溶解于95%乙醇(3mL)，并在回流下用 处于水(1mL)中的另外的铟粉末(153mg,1.30mmol)和氯化铵(173mg. 3.24mmol)加以处理。在三小时以后，用水(10mL)稀释混合物并过滤。用 乙酸乙酯(25mL)和饱和碳酸氢钠(10mL)依次洗涤收集的固体。分离滤液 水相，并用乙酸乙酯(2x25mL)洗涤。用盐水(50mL)洗涤合并的有机提取 物，干燥并蒸发。层析(12g二氧化硅卡套柱，0-100%乙酸乙酯/石油醚， 40-60℃)残余物以产生标题化合物(I88)(51.4mg，57%产率)，为黄色油； 1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.19–7.12(m,2H),6.71–6.63(m,2H),4.33– 4.25(m,1H),4.03–3.85(m,3H),3.73–3.60(m,3H),3.02(s,1H),2.84(s, 1H)。LCMS方法C:rt：4.72min；m/z179.1[M-Boc+2H]+。
(g)2-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苯基)吗啉-4-羧酸叔丁酯(I89)
在三氟乙醇(1.2mL)和TFA(0.12mL)中，在微波照射(100℃/20分钟) 下，加热2-(4-氨基苯基)吗啉-4-羧酸叔丁酯(I88)(50mg,0.18mmol)和 2-(2-(2-(2-(甲基磺酰基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸甲酯 (I67)(72mg,0.18mmol)。浓缩混合物，由甲苯蒸发并加载到处于甲醇(1mL) 中的5gSCX卡套柱上。用甲醇(50mL)洗涤卡套柱，然后用1%甲胺/甲醇 (50mL)洗脱。浓缩碱性洗脱液，并吸收在二氯甲烷(5mL)中。添加Boc 酸酐(0.062mL,0.27mmol)，并在室温下搅拌混合物18小时。在硅胶上蒸 发混合物，并层析(12g二氧化硅卡套柱，0-60%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃) 以产生标题化合物(I89)(46mg，42%产率)，为浅黄色油；1HNMR(400MHz, CDCl3)δ8.55(s,1H),7.64(d,J=8.6Hz,2H),7.47(s,1H),7.37(d,J=8.5 Hz,2H),7.29–7.18(m,重叠与CHCl3),4.41(d,J=8.4Hz,1H),4.08(m, 3H),3.76(s,2H),3.73–3.64(m,4H),3.16–2.98(m,5H),2.85(s,1H),1.51 –1.47(m,9H)。LCMS方法C：rt6.88min；m/z601.1[M+H]+,545.1 [M-tBu+2H]+。
(h)2-(2-(2-(2-((4-(4-(叔丁氧基羰基)吗啉-2-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲 基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸(I90)
将2-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苯基)吗啉-4-羧酸叔丁酯(I89)(46mg,0.077mmol)溶解于THF(2mL)， 并添加处于水(0.5mL)中的氢氧化锂水合物(6.0mg,0.15mmol)。在18小 时以后，浓缩混合物，用水(5mL)稀释并用6MHCl将pH调节至3。用 乙酸乙酯(3x10mL)提取混合物，并用盐水(20mL)洗涤合并的有机提取物， 在硫酸钠上干燥并蒸发，以产生标题化合物(I90)(39mg，85%产率)，为浅 黄色浆料；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.52(s,1H),7.54(d,J=8.4Hz,2H), 7.35–7.27(m,4H),4.38(d,J=10.1Hz,1H),4.07–3.80(m,5H),3.67(td,J =11.7,2.7Hz,1H),3.06(s,4H),2.84(s,2H),1.47(s,9H)。LCMS方法C： rt6.49min；m/z587.1[M+H]+,531.0[M-tBu+2H]+,487.1[M-Boc+2H]+;m/z 585.2[M-H]-。
(i)2-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苯基)吗啉-4-羧酸叔丁酯(I91)
将2-(2-(2-(2-((4-(4-(叔丁氧基羰基)吗啉-2-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸(I90)(39mg,0.066mmol)溶解于DMF(3mL)，并 添加碳酸铵(38mg,0.40mmol)，HATU(28mg,0.073mmol)和DIPEA(0.046 mL,0.27mmol)。在室温下搅拌黄色混合物18小时，然后加入水(30mL) 和盐水(10mL)。用乙酸乙酯(3x30mL)提取混合物，并用盐水(50mL)洗涤 合并的乙酸乙酯相，在硫酸钠上干燥并蒸发。层析(4g去活化的*二氧化 硅卡套柱，处于乙酸乙酯/石油醚中0-100%1%异丙胺，40-60℃)残余物以 产生标题化合物(I91)(23.3mg，60%产率)，为无色玻璃；1HNMR(400MHz, CDCl3)δ8.53(s,1H),7.78(s,1H),7.61(d,J=8.4Hz,2H),7.37(d,J=8.5 Hz,2H),7.31–7.19(m,5H，重叠与CHCl3),5.58(s,1H),5.42(s,1H),4.40 (d,J=8.5Hz,1H),4.08–3.84(m,3H),3.74–3.63(m,3H),3.16–3.00(m, 5H),2.85(s,1H),1.48(s,9H)。LCMS方法C：rt6.29min；m/z586.1[M+H]+, 530.1[M-tBu+2H]+,608.1[M+Na]+;m/z584.1[M-H]-。
*卡套柱，通过用处于乙酸乙酯中的3体积的1%异丙胺加以处理， 接着用处于乙酸乙酯/石油醚（40-60℃）中的3体积的梯度为100-0%的 1%异丙胺加以冲洗来去活化。
(j)2-(2-(2-(2-((4-(吗啉-2-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 苯基)乙酰胺(22)
用DCM(3mL)和TFA(0.3mL)搅拌2-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯 乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)吗啉-4-羧酸叔丁酯(I91)(23mg, 0.039mmol)。在18小时以后，浓缩混合物并将残余物悬浮在10%NaOH 水溶液(1mL)和盐水(1mL)中。用乙酸乙酯(5x3mL)提取混合物，并用盐 水(20mL)洗涤合并的乙酸乙酯相，在硫酸钠上干燥并蒸发，以产生标题 化合物(22)(17mg，89%)，为白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ 10.19(s,1H),8.67(s,1H),7.74–7.67(m,2H),7.42(s,1H),7.27(d,J=8.6 Hz,2H),7.25–7.21(m,1H),7.19–7.14(m,3H),6.91(s,1H),4.32(dd,J= 10.1,2.1Hz,1H),3.86(d,J=10.9Hz,1H),3.58(dt,J=11.2,7.2Hz,1H), 3.50(s,2H),3.15–2.98(m,4H),2.89(dd,J=12.3,2.2Hz,1H),2.72(d,J= 5.2Hz,2H)。LCMS方法C：rt4.75min；m/z486.1[M+H]+,508.0[M+Na]+; m/z484.1[M-H]-。
实施例23：2-(2-(2-(2-((4-(1-乙酰基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺
将三乙胺(34.6μL,0.248mmol)和乙酸酐(23.4μL,0.248mmol)加入处 于DMF(10mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧 啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(11)(30mg,0.062mmol)的溶液。在室温下搅拌反 应混合物20小时。真空除去挥发物并用EtOAc(20mL)和饱和NaHCO3水 溶液(20mL)稀释残余物。对层加以分离并用EtOAc(2x20mL)提取水层。 用水(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的有机层并在Na2SO4上干燥。过滤溶 液并真空浓缩以产生白色固体，将其悬浮在DCM(约2mL)和环己烷(约10 mL)中。过滤悬浮液以产生标题化合物(23)(24mg，72%)，为灰白色固体； 1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.14(s,1H),8.66(s,1H),7.71–7.63(m, 2H),7.42(s,1H),7.27–7.12(m,6H),6.91(s,1H),4.57–4.48(m,1H),3.93 –3.90(m,1H),3.50(s,2H),3.16–3.06(m,3H),3.06–2.97(m,2H),2.77– 2.65(m,1H),2.62–2.51(m，溶剂遮掩了峰),2.03(s,3H),1.81–1.74(m, 2H),1.57(qd,J=12.6,4.2Hz,1H),1.49–1.35(m,1H)；LCMS方法C：rt 5.89min；m/z526[M+H]+。
实施例24：2-(2-(2-(2-((4-(4-(二甲基氨基)哌啶-1-基)苯基)氨基)-5-(三 氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(24)
在氮气氛下，向处于无水甲醇(2mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(4-氨基哌啶 -1-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(20)(30mg, 0.060mmol)的悬浮液添加37%的甲醛水溶液(7μL,0.06mmol)和三乙酰氧 基硼氢化钠(0.038g,0.18mmol)。在室温下搅拌产生的悬浮液2.5小时。真 空除去挥发物并在EtOAc(50mL)和水(50mL)之间分配残余物。分离有机 层，干燥(MgSO4)并真空除去溶剂，以产生粗制黄色油。在硅胶(Biotage Isolera：处于EtOAc中0-100%MeOH)上层析粗制油，以产生标题化合物 (24)(11mg，35%)，为黄色固体；1HNMR(400MHz,d4-MeOD)δ8.51(s,1H), 7.57–7.51(m,2H),7.31–7.18(m,4H),7.04–6.99(m,2H),3.76–3.67(m, 4H),3.20–3.13(m,2H),3.09–3.03(m,J=9.9,5.5Hz,2H),2.76–2.64(m, 2H),2.34(s,7H),2.01(d,J=12.7Hz,2H),1.66(qd,J=12.4,3.9Hz,2H)。 LCMS方法C：rt4.77min；m/z=527[M+1]+。
实施例25：2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧 啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(25)
(a)4-(4-硝基苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I92)
在室温下，将1-(溴甲基)-4-硝基苯(1.08g,5.00mmol)加入处于DMF(5 mL)中的哌嗪-1-羧酸叔丁酯(1.02g,5.50mmol)和碳酸钠(0.583g,5.50 mmol)的剧烈搅拌的混合物，并搅拌产生的混合物两小时。添加水(25mL)， 并允许产生的悬浮液静置五分钟，然后过滤。用水(25mL)洗涤收集的固 体，并空气干燥，以产生标题化合物(I92)(1.523g，95%产率)；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ8.32–8.10(m,2H),7.51(d,J=8.8Hz,2H),3.59(s,2H), 3.52–3.39(m,4H),2.43–2.34(m,4H),1.45(s,9H)。LCMS方法C：rt4.58 min,m/z266.1[M-tBu+2H]+,222.1[M-Boc+2H]+。
(b)4-(4-氨基苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I93)
在50psi下在氢气氛下，搅拌4-(4-硝基苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯 (I92)(0.500g,1.56mmol)、乙酸乙酯(100mL)和10%Pd/C(150mg)。在两 小时以后，通过Celite（硅藻土）来过滤混合物并浓缩。层析(12g二氧化 硅卡套柱，0-60%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)残余物以产生标题化合物 (I93)(327mg，72%产率)，为白色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.11– 7.05(m,2H),6.67–6.61(m,2H),3.62(s,2H),3.43–3.37(m,6H),2.40– 2.30(m,4H),1.45(s,9H)。LCMS方法C：rt1.80min；m/z292.1[M+H]+。
(c)4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯 (I94)
在氮气下，将处于1:1二氯乙烷:叔丁醇中的2,4-二氯-5-(三氟甲基) 嘧啶(0.546g,2.52mmol)冷却至0℃。添加处于乙醚(3.43mL,3.34mmol) 中的氯化锌(II)的1.0M溶液，并在0℃下搅拌混合物1小时。经30分钟， 滴加处于1:1二氯乙烷:叔丁醇(20mL)中的4-(4-氨基苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁 酯(I93)(0.667g,2.29mmol)，接着加入处于1:1二氯乙烷:叔丁醇(10mL)中 的三乙胺(0.351mL,2.52mmol)。搅拌混合物过夜，从而允许经过这段时 间冰浴达到室温。在硅胶上浓缩混合物并层析(40g二氧化硅卡套柱， 0-100%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)以产生残余物，用40-60℃的石油醚对 其加以研磨，以产生标题化合物(I94)(0.976g，90%)，为灰白色固体；1H NMR(400MHz,d4-MeOD)δ8.68(d,J=0.6Hz,1H),7.85(d,J=8.6Hz, 2H),7.51(d,J=8.6Hz,2H),4.30(s,2H),3.27–3.00(br，与溶剂重叠),1.47 (s,9H)。LCMS方法C：5.08min；m/z472.1[M+H]+;m/z470.1[M-H]-。
(d)4-(4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧 啶-2-基)氨基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I95)
将4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯 (I94)(0.500g,1.06mmol)和2-(2-乙炔基苯基)乙酸甲酯(I4)(0.203g,1.17 mmol)溶解于DMF(10mL)，并添加二(三苯基膦)氯化钯(II)(37mg,5 mol%)。用氮气脱气混合物10分钟，然后添加碘化铜(I)(10mg,5mol%) 和三乙胺(0.738mL,5.30mmol)。在微波照射(100℃/20分钟)下加热混合 物，然后浓缩。层析(12g二氧化硅卡套柱，0-100%乙酸乙酯/石油醚， 40-60℃)残余物以产生标题化合物(I95)(192mg，30%产率)，为棕色油；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),7.68(dd,J=7.6,1.0Hz,1H),7.59(d, J=8.4Hz,2H),7.50(s,1H),7.42(dd,J=7.5,1.4Hz,1H),7.38–7.29(m, 4H),3.95(s,2H),3.70(s,3H),3.50(s,2H),3.45–3.40(m,4H),2.43–2.35 (m,4H),1.45(s,9H)。LCMS方法C：rt5.30min；m/z610.1[M+H]+,m/z608.2 [M-H]-。
(e)4-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I96)
在氢气氛下，连同处于DMF(10mL)中的10%Pd/C(100mg)一起，剧 烈搅拌4-(4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶 -2-基)氨基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I95)(190mg,0.312mmol)。在两小时 以后，借助于乙酸乙酯(10mL)将反应转移到Parr管并在45psi下氢化混 合物。在18小时以后，添加Pearlman催化剂(100mg)和三乙胺(0.2mL)， 并在40psi的氢气下搅拌混合物。在三小时以后，用乙酸乙酯(50mL)稀释 混合物，并通过Celite（硅藻土）加以过滤，用乙酸乙酯(2x25mL)洗涤 Celite（硅藻土）。用乙酸乙酯(100mL)稀释滤液并用5%氯化锂溶液(3x100 mL)洗涤。在硫酸钠上干燥并蒸发有机相，以产生标题化合物(I96)(127mg， 66%产率)，为黄色浆料；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.63– 7.56(m,2H),7.46(s,1H),7.31(d,J=8.5Hz,2H),7.26–7.17(m,4H),3.75 (s,2H),3.68(s,3H),3.50(s,2H),3.46–3.40(m,4H),3.17–3.05(m,4H), 2.45–2.34(m,4H),1.45(s,9H)。LCMS方法C：rt5.63min；m/z614.2 [M+H]+;m/z612.1[M-H]-。
(f)2-(2-(2-(2-((4-((4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-(三 氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I97)
将4-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I96)(120mg,0.196mmol)溶解于THF(4 mL)，并添加处于水(1mL)中的氢氧化锂水合物(25mg,0.59mmol)的溶液。 在室温下搅拌混合物18小时，然后浓缩，并由甲苯蒸发残余物两次，以 产生标题化合物(I97)，为褐色固体，其直接使用而无需纯化。LCMS方法 C：rt5.17min；m/z600.2[M-Li+2H]+;544.1[M-tBu-Li+3H]+;m/z598.2 [M-Li]-。
(g)4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I98)
将粗制2-(2-(2-(2-((4-((4-(叔丁氧基羰基)哌嗪-1-基)甲基)苯基)氨 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I97)溶解于DMF(2mL)，并 添加氯化铵(210mg,3.92mmol)、HATU(149mg,0.392mmol)和 DIPEA(68.0μL,0.392mmol)。在室温下搅拌产生的混合物18小时，然后 浓缩。在饱和碳酸氢钠(50mL)和乙酸乙酯(50mL)之间分配残余物；用另 外的乙酸乙酯(2x50mL)提取水相并用盐水(3x50mL)洗涤合并的乙酸乙酯 相，在硫酸钠上干燥并蒸发。层析(4g二氧化硅卡套柱，20-100%梯度的 处于乙酸乙酯/石油醚中的1%异丙胺，40-60℃，然后是0-5%梯度的处于 乙酸乙酯中的甲醇/1%异丙胺)残余物以产生残余物，对其加以层析(12g 二氧化硅卡套柱，80-100%梯度的处于乙酸乙酯/石油醚中的1%异丙胺， 40-60℃)以产生标题化合物(I98)(34mg，29%产率，由酯经过两个步骤)， 为白色泡沫；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.62(s,1H),7.57(d, J=8.5Hz,2H),7.31(d,J=8.5Hz,2H),7.29–7.20(m,8H),5.38(s,2H), 3.73(s,2H),3.49(s,2H),3.46–3.39(m,4H),3.16–3.04(m,4H),2.44– 2.34(m,4H),1.45(s,9H)。LCMS方法C：rt5.08min；m/z599.1[M+H]+, 499.1[M-Boc+2H]+;m/z597.2[M-H]-。
(h)2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯基)乙酰胺(25)
将4-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I98)(34mg,0.057mmol)溶解于DCM(4mL)， 并添加TFA(0.4mL)。在室温下搅拌产生的混合物16小时，然后在减压下 浓缩。将残余物悬浮在10%NaOH水溶液(2mL)和盐水(3mL)中，然后用 乙酸乙酯(4x5mL)提取。用盐水洗涤合并的有机相，干燥(硫酸钠)并蒸发 至干燥。用乙醚研磨残余物以产生标题化合物(25)(27.5mg，98%)，为黄 色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.17(s,1H),8.66(s,1H),7.72– 7.66(m,2H),7.26–7.20(m,3H),7.20–7.13(m,3H),6.90(s,1H),3.49(s, 2H),3.37(s,2H),3.14–2.98(m,4H),2.67(t,J=4.7Hz,4H),2.26(s,4H)。 LCMS方法C：rt4.52min;m/z499.1[M+H]+;m/z497.1[M-H]-。
实施例26：2-(3-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)吡嗪-2-基)乙酰胺(26)
(a)2-(3-氯吡嗪-2-基)乙酸乙酯(I99)
在氮气下在0℃下，向处于甲苯(14.8mL,14.8mmol)中的LiHMDS 的1.0M溶液添加2,3-二氯吡嗪(0.699mL,6.71mmol)和乙酸乙酯(0.725 mL,7.38mmol)。搅拌混合物过夜持续18小时，从而允许冰浴加温至室温。 将混合物倒入饱和氯化铵(100mL)，用乙醚(3x100mL)提取。用盐水洗涤 合并的醚提取物，干燥(硫酸钠)并蒸发。层析(40g二氧化硅卡套柱，0-25% 乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)残余物以产生标题化合物(I99)(0.414g，31%产 率)，为浅黄色油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.46(d,J=2.5Hz,1H),8.31 (d,J=2.5Hz,1H),4.22(q,J=7.1Hz,2H),4.03(s,2H),1.27(t,J=7.1Hz, 3H)。LCMS方法C：rt5.16min。
(b)2-(3-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡嗪-2-基)乙酸乙酯(I100)
借助于三个真空/氮气循环，将Schlenk管中的2-(3-氯吡嗪-2-基)乙酸 乙酯(I99)(0.410g,2.04mmol)、DMF(6mL)、三乙胺(2mL)、二(三苯基膦) 氯化钯(II)(72mg,5mol%)和碘化铜(I)(19mg,5mol%)的混合物脱气，然后 在氮气下添加三甲基甲硅烷基乙炔(0.866mL,6.13mmol)。用氮气冲洗上 述管，密封且加热至90℃。在18小时以后，冷却混合物并倒入水(50mL) 中。添加饱和氯化铵(50mL)，并用乙醚(3x100mL)提取混合物。用盐水洗 涤合并的醚相，干燥(硫酸钠)并蒸发。层析(40g二氧化硅卡套柱，0-30% 乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)残余物以产生标题化合物(I100)(0.386g，72% 产率)，为黄色油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.47–8.41(m,2H),4.20(q, J=7.1Hz,2H),4.05(s,2H),1.26(t,J=7.1Hz),0.28(s,9H)。LCMS方法C： rt6.20min；m/z263.1[M+H]+。
(c)2-(3-乙炔基吡嗪-2-基)乙酸乙酯(I101)
将处于THF(15mL)中的2-(3-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡嗪-2-基)乙 酸乙酯(I100)(0.386g,1.47mmol)冷却至0℃并添加处于THF(1.84mL, 1.84mmol)中TBAF的1.0M溶液。搅拌混合物两分钟，然后倒入水(150mL) 中。用乙醚(2x150mL)提取产生的混合物，并用盐水洗涤合并的醚相，干 燥(硫酸钠)并蒸发，以产生标题化合物(I101)(0.209g，75%产率)，为黄棕 色油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.50–8.47(m,2H),4.21(q,J=7.1Hz, 2H),4.08(s,2H),3.49(s,1H),1.26(t,J=7.1Hz,3H)。LCMS方法C：rt4.88 min；m/z191.1[M+H]+。
(d)4-(4-((4-((3-(2-乙氧基-2-氧代乙基)吡嗪-2-基)乙炔基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I102)
将4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯 (I43)(140mg,0.306mmol)、2-(3-乙炔基吡嗪-2-基)乙酸乙酯(I101)(64mg, 0.34mmol)、二(三苯基膦)氯化钯(II)(11mg,5mol%)和DMF(2mL)装入微 波管，并用氮气脱气10分钟。在氮气下，添加碘化铜(I)(3mg,5mol%)和 三乙胺(0.192mL,1.38mmol)，并在微波照射(120℃/15分钟)下加热产生的 混合物。浓缩冷却的混合物，并在硅胶上蒸发残余物。层析分离(12g二 氧化硅卡套柱，0-100%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)产生标题化合物 (I102)(95.5mg，52%产率)，为黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ 10.47(s,1H),8.87(d,J=0.5Hz,1H),8.76–8.71(m,2H),7.63(d,J=8.6Hz, 2H),7.23(d,J=8.6Hz,2H),4.15–3.99(m,6H),2.80(s,2H),2.70–2.63(m, 1H),1.80–1.70(m,2H),1.55–1.44(m,2H),1.42(s,9H),1.14(t,J=7.1Hz, 3H)。LCMS方法C：rt6.73min；m/z633.1[M+Na]+,555.0[M-tBu+2H]+, 511.1[M-Boc+2H]+;m/z609.1[M-H]-。
(e)4-(4-((4-(2-(3-(2-乙氧基-2-氧代乙基)吡嗪-2-基)乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I103)
将4-(4-((4-((3-(2-乙氧基-2-氧代乙基)吡嗪-2-基)乙炔基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I102)(187mg,0.306mmol)溶解 于DMF(20mL)，并添加三乙胺(0.1mL)以及处于DMF(2mL)中的10% Pd/C(0.100g)的淤浆。用3个真空/氢气循环清洗混合物，然后在氢气氛下 剧烈搅拌。在17小时以后，通过Celite（硅藻土）来过滤混合物，并用乙 酸乙酯(200mL)洗涤Celite（硅藻土）。用1:1水:饱和盐水(4x100mL)洗涤 合并的滤液，干燥(硫酸钠)并蒸发，以产生标题化合物(I103)(142mg，76%)， 为黄色油；1HNMR(400MHz,d4-MeOD)δ8.51(d,J=0.6Hz,1H),8.42(d,J =2.6Hz,1H),8.34(d,J=2.6Hz,1H),7.48(d,J=8.3Hz,2H),7.20–7.13 (m,2H),4.21(dd,J=11.4,1.8Hz,2H),4.15(q,J=7.1Hz,2H),3.97(s,2H), 3.37(s,4H),2.87(brs),2.70(tt,J=11.9,3.3Hz,1H),1.83(d,J=12.4Hz, 2H),1.59(ddd,J=25.6,12.9,4.4Hz,2H),1.48(s,9H),1.21(t,J=7.1Hz, 3H)。LCMS方法C：rt6.76min；m/z615.1[M+H]+,559.1[M-tBu+2H]+,515.1 [M-Boc+2H]+。
(f)4-(4-((4-(2-(3-(2-氨基-2-氧代乙基)吡嗪-2-基)乙基)-5-(三氟甲基)嘧 啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I104)
将4-(4-((4-(2-(3-(2-乙氧基-2-氧代乙基)吡嗪-2-基)乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I103)(142mg,0.231mmol)溶解 于THF(10mL)和甲醇(5mL)，然后添加处于水(2.5mL)中的氢氧化锂一水 合物(48.0mg,1.16mmol)的溶液。在室温下搅拌混合物17小时，然后浓缩。 由甲苯蒸发残余物两次，然后溶解于DMF(20mL)，并添加氯化铵(62mg, 1.2mmol)、HOBt(47mg,0.35mmol)、PyBOP(181mg,0.347mmol)和 DIPEA(0.161mL,0.924mmol)。在两小时以后，用水(1mL)淬灭混合物， 浓缩，并在1:3饱和盐水:水(30mL)和乙酸乙酯(20mL)之间分配残余物。 用乙酸乙酯(3x20mL)洗涤水相，然后用盐水(50mL)洗涤合并的乙酸乙酯 相，干燥(硫酸钠)并蒸发。层析(12g二氧化硅卡套柱，20-100%乙酸乙酯/ 石油醚，40-60℃，然后为100%乙酸乙酯，10个柱体积)残余物以产生标 题化合物(I104)(66.2mg，49%产率)，为无色浆料；1HNMR(400MHz, d4-MeOD)δ8.40(d,J=0.6Hz,1H),8.29(d,J=2.6Hz,1H),8.24(d,J=2.5 Hz,1H),7.40(d,J=8.3Hz,2H),7.09–7.01(m,2H),4.10(d,J=13.3Hz, 2H),3.81–3.75(m,2H),3.34–3.23(m,4H),2.76(brs),2.58(tt,J=12.0, 3.4Hz,1H),1.71(d,J=12.2Hz,2H),1.47(ddd,J=25.5,12.8,4.3Hz,2H), 1.38(s,9H)。LCMS方法C：6.17min；m/z586.1[M+H]+,530.1[M-tBu+2H]+, 486.1[M-Boc+2H]+;m/z584.2[M-H]-。
(g)2-(3-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 吡嗪-2-基)乙酰胺(26)
在室温下搅拌4-(4-((4-(2-(3-(2-氨基-2-氧代乙基)吡嗪-2-基)乙 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I104)(66mg, 0.11mmol)、DCM(20mL)和TFA(2mL)17小时，然后浓缩。将残余物悬 浮于10%NaOH(10mL)和盐水(10mL)，并用乙酸乙酯(4x20mL)提取混合 物。用盐水洗涤合并的乙酸乙酯相，干燥(硫酸钠)并蒸发，以产生标题化 合物(26)(47mg，85%产率)，为黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ 10.05(s,1H),8.64(s,1H),8.42(d,J=2.5Hz,1H),8.39(d,J=2.5Hz,1H), 7.61(s,1H),7.54(d,J=6.7Hz,2H),7.14(d,J=8.4Hz,2H),7.08(s,1H), 3.78(s,2H),3.07–2.97(m,2H),2.63–2.53(m，与溶剂重叠),1.67(d,J= 12.1Hz,2H),1.55–1.43(m,2H),1.23(s,1H)。LCMS方法C：rt4.36min； m/z486.1[M+H]+;m/z484.1[M-H]-。
实施例27：2-(3-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)吡嗪-2-基)乙酰胺(27)
将2-(3-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 吡嗪-2-基)乙酰胺(26)(42mg,0.087mmol)溶解于甲醇(4mL)，并添加37% 甲醛(26μL,0.35mmol)。在5分钟以后，添加三(乙酰氧基)硼氢化钠(92mg, 0.44mmol)，并搅拌混合物3小时。浓缩溶液，并将残余物悬浮于10%氢 氧化钠(1mL)。在5分钟以后，添加盐水(2mL)，并用乙酸乙酯(5x3mL) 提取混合物。用盐水洗涤合并的乙酸乙酯相，干燥(硫酸钠)并蒸发，以产 生标题化合物(27)(34mg，77%产率)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ10.07(s,1H),8.64(s,1H),8.42(d,J=2.6Hz,1H),8.38(d,J= 2.6Hz,1H),7.61(s,1H),7.55(d,J=7.3Hz,2H),7.15(d,J=8.5Hz,2H), 7.08(s,1H),4.09(d,J=4.7Hz,1H),3.77(s,2H),3.17(d,J=4.3Hz,2H), 3.05–2.92(m,2H),2.33(s,3H),2.20(s,2H),1.82–1.61(m,4H)。LCMS方 法C：rt4.53min；m/z500.1[M+H]+;m/z498.2[M-H]-。
实施例28：2-(2-(2-(2-((2-甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-5-(三氟 甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(28)
将2-(2-(2-(2-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯基)乙酰胺(21)(25mg,0.055mmol)悬浮于甲醇(2mL)，并添加37% 甲醛水溶液(0.016mL,0.22mmol)。搅拌混合物5分钟，然后添加三(乙酰 氧基)硼氢化钠(58mg,0.27mmol)。在室温下在搅拌2小时以后，浓缩混 合物并用10%NaOH水溶液(1mL)处理残余物5分钟。添加盐水(2mL)， 并用乙酸乙酯(5x5mL)提取混合物。用盐水洗涤合并的乙酸乙酯提取物， 干燥(硫酸钠)并蒸发，以产生标题化合物(28)(22.8mg，88%产率)，为灰白 色固体；1HNMR(400MHz,d4-MeOD)δ8.54(d,J=0.5Hz,1H),7.52(d,J= 1.9Hz,1H),7.47(dd,J=8.3,2.2Hz,1H),7.28–7.16(m,4H),7.04(d,J= 8.3Hz,1H),3.66(s,2H),3.60(s,2H),3.21–3.11(m,2H),3.11–3.02(m, 2H),2.96(t,J=6.0Hz,2H),2.76(t,J=6.1Hz,2H),2.46(s,3H)。LCMS方 法C：rt4.78min；m/z470.1[M+H]+;m/z468.1[M-H]-。
实施例29：2-(4-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)嘧啶-5-基)乙酰胺(29)
(a)2-甲酰琥珀酸二乙酯(I105)
经1.5小时，在0℃下在氮气下，将琥珀酸二乙酯(26.1g,25.0mL, 0.150mol)和甲酸乙酯(11.1g,12.1mL,0.150mol)的混合物逐滴加入处于 乙醚(120mL)中的钠(3.40g,0.150mol)的搅拌悬浮液。在完成添加以后， 在室温下继续搅拌17小时。将水(120mL)小心加入产生的悬浮液，并继 续搅拌直到溶解所有固体。对层加以分离并用乙醚(100mL)洗涤水层。然 后利用11NHCl来酸化水层至pH5，并用乙醚(3x100mL)提取，合并酸 化层的醚提取物，干燥(Na2SO4)，然后在减压下蒸发至干燥，以产生标题 化合物(I105)(16.5g)，为黄色低粘度液体。粗产物无需进一步纯化而直接 用于后面步骤。
(b)2-(4-氧-2-硫代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)乙酸乙酯(I106)
在氮气氛下将乙醇钠(6.105g,89.71mmol)加入无水乙醇(150mL)，接 着加入处于无水乙醇(30mL)中的二乙基-2-甲酰琥珀酸酯(I105)(粗制物， 16.5g)以及硫脲(6.829g,89.71mmol)。在回流下加热反应混合物1小时， 然后冷却至室温，在此温度下继续搅拌16小时。在减压下蒸发挥发物以 产生棕色油状固体。添加冷乙酸水溶液(15%;120mL)并超声处理产生的混 合物，然后在0℃下搅拌直到所有残余物均在悬浮液中。通过过滤来收集 产生的沉淀物。用水(100mL)洗涤滤饼并干燥，以产生标题化合物 (I106)(6.31g，19%产率，经2个步骤)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ7.44(s,1H),4.05(q,J=7.1Hz,2H),3.28(s,2H),1.17(t,J=7.1 Hz,3H)。LCMS方法C：rt2.92min；m/z213.0[M-H]-。
(c)2-(6-氧-1,6-二氢嘧啶-5-基)乙酸乙酯(I107)
在室温下，将处于水中的兰尼镍悬浮液(Aldrich;25mL)加入处于水 (200mL)中的2-(4-氧-2-硫代-1,2,3,4-四氢嘧啶-5-基)乙酸乙酯(I106)(3.0g, 14mmol)的搅拌悬浮液。在回流下加热产生的悬浮液20小时并在室温下 搅拌另外70小时。通过Celite（硅藻土）薄垫来过滤混合物，用热水(200 mL)洗涤滤饼，并在减压下蒸发合并的滤液，以产生浅蓝色固体(～1.8g)。 添加二氯甲烷(250mL)并在超声浴中超声处理产生的悬浮液直到获得精 细悬浮固体。在回流下在剧烈搅拌下加热精细悬浮液1小时，然后通过 Celite（硅藻土）垫热过滤，用热二氯甲烷(200mL)洗涤滤饼。合并滤液并 在减压下蒸发至干燥，以产生标题化合物(I107)(1.01g，40%产率)，为白 色蓬松固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(s,1H),8.00–7.97(m,1H), 4.19(q,J=7.1Hz,2H),3.49(s,2H),1.28(t,J=7.1Hz,3H)。LCMS方法C： rt2.05min；m/z183.1[M+H]+。
(d)2-(4-氯嘧啶-5-基)乙酸乙酯(I108)
在氮气氛下向2-(6-氧-1,6-二氢嘧啶-5-基)乙酸乙酯(I107)(0.868g, 4.77mmol)添加POCl3(6mL)，并加热产生的混合物至回流持续5分钟，然 后冷却至室温。将反应缓慢加入水(300mL)，用DCM(3x100mL)提取水溶 液，用盐水(100mL)洗涤合并的有机物，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩， 以产生标题化合物(I108)(0.885g，93%产率)，为浅黄色油；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ8.93(s,1H),8.61(s,1H),4.21(q,J=7.1Hz,2H),3.76(s, 2H),1.28(t,J=7.1Hz,3H)。LCMS方法C：rt5.09min；m/z201.1,203.1 [M+H]+。
(e)2-(4-((三乙基甲硅烷基)乙炔基)嘧啶-5-基)乙酸乙酯(I109)
向处于干燥DMF(15mL)中的2-(4-氯嘧啶-5-基)乙酸乙酯(I108)(0.823 g,4.10mmol)的氮气脱气溶液添加三乙胺(1.715mL,12.31mmol)，接着加 入三苯基膦(0.124g,0.473mmol)、反式-二氯二(三苯基膦)钯(II)(0.144g, 0.205mmol)、Cu(I)I(0.078g,0.410mmol)以及最后加入(三乙基甲硅烷基) 乙炔(1.470mL,8.204mmol)。然后在微波照射下在120℃下加热反应混合 物25分钟，真空浓缩并通过硅胶层析法(IsoleraBiotage，40gSi卡套柱， 处于石油醚中0-30%EtOAc，40-60℃)加以纯化，以产生标题化合物 (I109)(1.176g，94%产率)，为黄橙色油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ9.08 (s,1H),8.68(s,1H),4.18(q,J=7.1Hz,2H),3.80(s,2H),1.26(t,J=7.1Hz, 3H),1.10–1.01(m,9H),0.77–0.67(m,6H)。LCMS方法C：rt6.64min；
m/z305.1[M+H]+。
(f)2-(4-乙炔基嘧啶-5-基)乙酸乙酯(I110)
在氮气氛下向处于干燥THF(40mL)中的2-(4-((三乙基甲硅烷基)乙炔 基)嘧啶-5-基)乙酸乙酯(I109)(1.174g,3.856mmol)的溶液添加乙酸(0.243 mL,4.24mmol)，接着在0℃下滴加TBAF(1.0M，在THF中，4.049mL， 4.049mmol)。在此温度下搅拌反应5分钟，然后倒入饱和NaHCO3水溶液 (100mL)和DCM(100mL)中。对层加以分离，并用DCM(2x100mL)提取 水层。用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤合并的有机物，干燥(MgSO4)，过 滤并真空浓缩，以产生棕色油。通过硅胶层析法(IsoleraBiotage，40gSi 卡套柱，处于石油醚中0-60%EtOAc，40-60℃)来纯化粗制材料以产生标 题化合物(I110)(0.397g，54%产率)，为棕色油；1HNMR(400MHz,CDCl3) δ9.11(s,1H),8.72(s,1H),4.20(q,J=7.1Hz,2H),3.81(s,2H),3.56(s,1H), 1.27(t,J=7.1Hz,3H)。LCMS方法C：rt4.78min；m/z191.1[M+H]+。
(g)4-(4-((4-((5-(2-乙氧基-2-氧代乙基)嘧啶-4-基)乙炔基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I111)
向处于干燥DMF(15mL)中的2-(4-乙炔基嘧啶-5-基)乙酸乙酯 (I110)(0.146g,0.766mmol)和4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基) 哌啶-1-羧酸叔丁酯(I45)(0.250g,0.547mmol)的氮气脱气溶液添加三乙胺 (0.305mL,2.19mmol)、三叔丁基鏻四氟硼酸盐(0.016g,0.055mmol)、反 式-二氯二(三苯基膦)钯(II)(0.019g,0.027mmol)和Cu(I)I(0.010g,0.055 mmol)。在微波照射下在120℃下加热反应混合物20分钟，然后真空浓缩， 以产生棕色胶。通过硅胶层析法(IsoleraBiotage，40gSi卡套柱，处于石 油醚中0-70%EtOAc，40-60℃)来纯化粗制材料以产生标题化合物 (I111)(0.093g，27%产率)，为黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ 10.50(s,1H),9.23(s,1H),8.97(s,1H),8.88(s,1H),7.63(d,J=8.6Hz,2H), 7.23(d,J=8.6Hz,2H),4.14–4.04(m,4H),3.96(s,2H),2.81(brs,2H), 2.70–2.61(m,1H),1.75(d,J=11.9Hz,2H),1.53–1.37(m,11H),1.14(t,J =7.1Hz,3H)。LCMS方法C：rt6.64min;m/z609.2[M-H]-。
(h)4-(4-((4-(2-(5-(2-乙氧基-2-氧代乙基)嘧啶-4-基)乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I112)
在氮气氛下将4-(4-((4-((5-(2-乙氧基-2-氧代乙基)嘧啶-4-基)乙炔 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I111)(0.108g, 0.177mmol)溶解于干燥DMF(10mL)。将处于EtOAc(2mL)中的Pd/C(10 wt.%;0.040g)加入溶液，并将气氛改变成氢气(气球)。用气球密封反应并 在室温下搅拌22小时。通过经由Celite（硅藻土）过滤除去催化剂，用 EtOAc(5x20mL)对其加以洗涤。真空除去溶剂以产生浅灰色半固体，通过 硅胶层析法(IsoleraBiotage，12gSi卡套柱，处于石油醚中0-70%EtOAc， 40-60℃)对其加以纯化，以产生标题化合物(I112)(0.096g，88%产率)，为 浅黄色泡沫；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.06(s,1H),9.00(s,1H), 8.64(s,1H),8.59(s,1H),7.56(d,J=8.4Hz,2H),7.16(d,J=8.6Hz,2H), 4.11–4.04(m,4H),3.83(s,2H),3.28–3.21(m,4H),2.79(brs,2H),2.68– 2.58(m,1H),1.74(d,J=13.1Hz,2H),1.52–1.38(m,11H),1.14(t,J=7.1 Hz,3H)。LCMS方法C：rt6.65min；m/z615.1[M+H]+。
(i)2-(4-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)嘧啶-5-基)乙酸锂(I113)
将LiOH.H2O(0.020g,0.468mmol)加入处于THF(7mL)、水(1.5mL) 和甲醇(1mL)中的4-(4-((4-(2-(5-(2-乙氧基-2-氧代乙基)嘧啶-4-基)乙 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I112)(0.096g, 0.156mmol)的溶液，并在室温下允许搅拌产生的混合物18小时。真空除 去挥发物并用EtOAc(70mL)和2MNaOH水溶液(80mL)稀释残余物。对 层加以分离并用EtOAc(2x70mL)提取水层，用盐水(70mL)洗涤合并的有 机物，干燥(MgSO4)，过滤并在减压下浓缩，以产生标题化合物(I113)(0.096 g，定量产率)，为浅黄色固体。LCMS方法C：rt6.19min；m/z587.1[M+H]+。
(j)4-(4-((4-(2-(5-(2-氨基-2-氧代乙基)嘧啶-4-基)乙基)-5-(三氟甲基)嘧 啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I114)
在氮气氛下将2-(4-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)氨 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)嘧啶-5-基)乙酸锂(I113)(0.092g,0.16 mmol)溶解于干燥THF(7mL)和干燥DMF(1mL)。向此溶液添加1-羟基苯 并三唑(0.023g,0.17mmol)、EDCl(0.033g,0.17mmol)和N,N-二异丙基乙 胺(0.109mL,0.624mmol)，并在室温下搅拌反应混合物10分钟。一次性 添加碳酸铵(0.075g,0.78mmol)，并在室温下搅拌反应24小时。添加更多 试剂，1-羟基苯并三唑(0.011g)、EDCl(0.016g)、N,N-二异丙基乙胺(0.055 mL)，和碳酸铵(0.035g)，并在35℃下搅拌反应另外20小时。真空除去 挥发物并用EtOAc(70mL)和饱和NaHCO3水溶液(70mL)稀释残余溶液。 对层加以分离并用EtOAc(2x70mL)提取水层，合并有机层并用水(100 mL)、盐水(100mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生油状固 体。通过硅胶层析法(IsoleraBiotage，12gSi卡套柱，处于石油醚中的 0-100%EtOAc，40-60℃，然后为处于EtOAc中0-10%甲醇)来纯化粗产物 以产生标题化合物(I114)(0.076g，83%产率)，为浅黄色泡沫；1HNMR(400 MHz,d6-DMSO)δ10.03(s,1H),8.94(s,1H),8.64(s,1H),8.53(s,1H),7.64 (brs,1H),7.55(d,J=7.6Hz,2H),7.16(d,J=8.6Hz,2H),7.11(brs,1H), 4.12–4.04(m,2H),3.57(s,2H),3.30–3.21(m,4H),2.77(brs,2H),2.68– 2.58(m,1H),1.74(d,J=12.7Hz,2H),1.53–1.37(m,11H)。LCMS方法C： rt6.12min；m/z586.1[M+H]+。
(k)2-(4-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 嘧啶-5-基)乙酰胺(29)
在氮气氛下将4-(4-((4-(2-(5-(2-氨基-2-氧代乙基)嘧啶-4-基)乙 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I114)(0.076g, 0.13mmol)溶解于DCM(5mL)。将三氟乙酸(0.298mL,3.89mmol)加入溶 液并在室温下搅拌反应23小时。真空除去挥发物，将EtOAc(70mL)和2M NaOH水溶液(70mL)加入残余物，并对层加以分离。用EtOAc(2x70mL) 提取水层，用盐水(2x50mL)洗涤合并的有机物，干燥(MgSO4)，过滤和 真空浓缩，以产生浅黄色胶。将甲醇(～5mL)和环己烷(～15mL)加入产物， 真空除去一些挥发物(～50%)，其产生黄色油，将其与溶剂溶液分离并借助 吸移管小心转移到新烧瓶。真空浓缩除去的溶液，然后在高真空下进一步 干燥以产生浅黄色胶。添加乙醚(5mL)和甲醇(1mL)，并真空浓缩溶液。 用乙醚重复上述过程两次以产生标题化合物(29)(35mg，56%产率)，为浅 黄色固体；1HNMR(400MHz,d4-MeOD)δ8.91(s,1H),8.53–8.50(m,2H), 7.52(d,J=8.2Hz,2H),7.21–7.16(m,2H),3.70(s,2H),3.42–3.34(m,4H), 3.27–3.20(m,2H),2.84(td,J=12.5,2.6Hz,2H),2.70(tt,J=12.2,3.9Hz, 1H),1.89(d,J=13.7Hz,2H),1.72(ddd,J=16.4,12.9,4.0Hz,2H)。LCMS 方法C：rt4.46min；m/z486.1[M+H]+。
实施例30：2-(4-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)嘧啶-5-基)乙酰胺(30)
在氮气氛下，向处于无水甲醇(2mL)中的2-(4-(2-(2-((4-(哌啶-4-基) 苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)嘧啶-5-基)乙酰胺(29)(0.029g, 0.060mmol)的悬浮液添加37%甲醛的水溶液(0.018mL,0.24mmol)，接着 加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.063g,0.30mmol)。在室温下搅拌反应2.5小 时。真空除去挥发物并用EtOAc(50mL)和饱和NaHCO3水溶液(30mL)稀 释残余物。对层加以分离并用EtOAc(2x30mL)提取水层，用水(40mL)、 盐水(40mL)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)，过滤并真空浓缩，以产生 固体，将其吸收在DCM(～10mL)和甲醇(～1mL)中并真空浓缩。仅用DCM 重复上述过程两次。将产生的灰白色固体悬浮于DCM(5mL)，并添加环 己烷(～10mL)。超声处理悬浮液并通过过滤来收集产物。用40-60℃的石 油醚(5x10mL)洗涤固体，空气干燥并随后在高真空下干燥，以产生标题 化合物(30)(0.017g，57%产率)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ10.01(s,1H),8.94(s,1H),8.63(s,1H),8.53(s,1H),7.64(s,1H), 7.54(d,J=8.0Hz,2H),7.15(d,J=8.5Hz,2H),7.11(s,1H),3.57(s,2H), 3.28–3.22(m,4H),2.87(d,J=11.2Hz,2H),2.46–2.36(m,1H),2.20(s, 3H),1.98(t,J=10.6Hz,2H),1.76–1.58(m,4H)。LCMS方法C：rt4.52 min；m/z500.1[M+H]+。
实施例31：2-(2-(2-(2-((4-(1-乙基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(31)
在氮气氛下将乙醛(84.5μL,1.51mmol)加入处于无水甲醇(10mL)中 的2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基) 乙酰胺(11)(91.0mg,0.188mmol)的悬浮液。然后一次性添加三乙酰氧基硼 氢化钠(0.638g,3.01mmol)，并在室温下搅拌反应24小时。真空除去挥发 物并用EtOAc(35mL)和饱和NaHCO3水溶液(40mL)稀释残余物。对层加 以分离并用EtOAc(2x35mL)提取水层，用水(30mL)、盐水(30mL)洗涤合 并的有机层并在Na2SO4上干燥。在减压下除去溶剂并将残余物溶解于 DCM(5mL)和MeOH(2mL)。添加环己烷(20mL)并真空除去溶剂，以产生 褐色固体，在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-100%EtOAc，40-60℃； 然后为处于EtOAc中0-75%MeOH)对其加以纯化，以产生白色固体。将 固体悬浮在DCM(5mL)和环己烷(20mL)中并过滤，以产生标题化合物 (31)(40.7mg，42%)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.13 (s,1H),8.65(s,1H),7.66(d,J=8.6Hz,2H),7.43(s,1H),7.26–7.12(m, 6H),6.92(s,1H),3.50(s,2H),3.14–3.06(m,2H),3.05–2.92(m,4H),2.43 (tt,J=11.7,3.7Hz,1H),2.33(q,J=7.2Hz,2H),1.93(td,J=11.5,2.1Hz, 2H),1.73(dd,J=11.8,2.0Hz,2H),1.62(ddd,J=24.8,12.4,3.6Hz,2H), 1.01(t,J=7.2Hz,3H)；LCMS方法C：rt4.90min；m/z512[M+H]+。
实施例32：2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)吡啶-3-基)乙酰胺(32)
(a)(1-氧吡啶-3-基)乙腈(I115)
将30%过氧化氢(12mL)加入处于乙酸(40mL)中的3-吡啶基乙腈 (7.50g,63.5mmol)的溶液并在95℃下加热混合物20小时。然后冷却反应 混合物并在室温下搅拌72小时。然后添加水(35mL)并在减压下浓缩溶液。 将水(2x100mL)加入残余物并在减压下浓缩溶液。利用甲苯(2x100mL)共 沸除去残余水分，以产生标题化合物(I115)(8.3g，97%)，为浅黄色固体， 其直接使用而无需进一步纯化。
(b)(2-氯吡啶-3-基)乙腈(116)
将(1-氧吡啶-3-基)乙腈(I115)(4.00g,29.8mmol)缓慢加入POCl3(50 mL)的搅拌溶液。以每10-15分钟增加5-7℃的速率加热混合物至80℃。 然后在回流下加热反应3小时。通过蒸馏来除去过量的POCl3并将棕色残 余物小心倒在冷水(200mL)上。然后小心添加饱和溶液NaHCO3(300mL)。 以多份将固体NaHCO3加入混合物水溶液，直到气体释放停止。将水层分 离成两部分(各自250mL)并用EtOAc(3x100mL)提取每个部分。用盐水 (200mL)洗涤合并的有机层并在Na2SO4上干燥。除去溶剂并在硅胶上通 过柱层析法(处于石油醚中0-100%EtOAc)来纯化残余物以产生两种异构 体化合物的混合物。在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-40%乙醚， 40-60℃)来再纯化混合物以产生标题化合物(I116)(0.932g，20%)，为白色 固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.41(dd,J=4.8,1.8Hz,1H),7.90(ddt,J =7.6,1.7,0.7Hz,1H),7.34(dd,J=7.6,4.8Hz,1H),3.87(s,2H)。LCMS方 法C：rt4.50min；m/z153[M+H]+。
(c)(2-氯吡啶-3-基)乙酸(I117)
将15%w/wNaOH的溶液(15mL)加入(2-氯吡啶-3-基)乙腈 (I116)(0.932g,6.11mmol)。在回流下加热混合物35分钟，然后冷却至室 温。进一步冷却混合物至0℃，然后用浓HCl(约5mL)酸化至pH1。在冰 浴中静置悬浮液1小时。过滤沉淀物并用冷丙-2-醇(3x15mL)洗涤以产生 标题化合物(I117)(1.05g，100%)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ12.63(s,1H),8.32(dd,J=4.8,1.9Hz,1H),7.86(dd,J=7.5,1.9 Hz,1H),7.41(dd,J=7.5,4.8Hz,1H),3.75(s,2H)。LCMS方法C：rt4.06 min；m/z172[M+H]+。
(d)2-(2-氯吡啶-3-基)乙酸甲酯(I118)
将乙酰氯(0.651mL,9.16mmol)加入处于MeOH(30mL)中的(2-氯吡 啶-3-基)乙酸(I117)(1.048g,6.108mmol)的悬浮液。在回流下加热混合物20 小时。真空除去挥发物并在DCM(100mL)和饱和NaHCO3(100mL)之间分 配残余物。对层加以分离并用DCM(2x100mL)提取水层。用盐水(100mL) 洗涤合并的有机层，干燥(Na2SO4)并在减压下除去溶剂，以产生油。在硅 胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-40%EtOAc，40-60℃)对其加以纯化以 产生标题化合物(I118)(0.863g，76%)，为浅黄色油；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ8.34(dd,J=4.8,1.9Hz,1H),7.88(dd,J=7.5,1.9Hz,1H),7.43 (dd,J=7.5,4.8Hz,1H),3.86(s,2H),3.65(s,3H)。LCMS方法C：rt5.04 min；m/z186[M+H]+。
(e)2-(2-((三乙基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-3-基)乙酸甲酯(I119)
将处于脱气DMF(3mL)和三乙胺(0.901mL,6.47mmol)中的三乙基甲 硅烷基乙炔(0.579mL,3.23mmol)溶液加入处于脱气DMF(4mL)中的2-(2- 氯吡啶-3-基)乙酸甲酯(I118)(0.200g,1.08mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(75.6mg, 0.108mmol)、Cu(I)I(30.8mg,0.162mmol)和三苯基膦(42.4mg,0.162mmol) 的混合物，并在90℃下加热产生的混合物20小时。用EtOAc稀释冷却 的混合物并通过Celite（硅藻土）塞，用乙酸乙酯(100mL)洗涤。将水(75mL) 加入滤液并分离层。用EtOAc(2x75mL)提取水层。用盐水(100mL)洗涤合 并的有机提取物并在Na2SO4上干燥。在过滤以后，在减压下除去溶剂， 以产生暗棕色残余物。在硅胶上通过柱层析法(处于环己烷中0-50%EtOAc) 来纯化残余物以产生标题化合物(I119)(0.353g)，为棕色油，其直接使用无 需进一步纯化；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.50(dd,J=4.8,1.6Hz,1H), 7.62(dd,J=7.8,1.6Hz,1H),7.22(dd,J=7.8,4.8Hz,1H),3.86(s,2H),3.70 (s,3H),1.05(t,J=7.9Hz,9H),0.75–0.67(m,6H)。LCMS方法C：rt6.55 min；m/z290[M+H]+。
(f)2-(2-乙炔基吡啶-3-基)乙酸甲酯(I120)
在0℃下将TBAF的溶液(1M溶液，在THF中；0.207mL，0.207mmol) 加入处于THF(2mL)中的2-(2-((三乙基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-3-基)乙酸甲 酯(I119)(50.0mg,0.173mmol)的溶液。在0℃下搅拌反应2分钟，然后用 饱和NaHCO3(20mL)稀释。然后添加EtOAc(20mL)并分离层。用 EtOAc(2x20mL)提取水层，然后用水(20mL)、盐水(20mL)洗涤合并的有 机层并在Na2SO4上干燥。真空除去溶剂以产生棕色油状残余物。在硅胶 上利用柱层析法(处于环己烷中0-55%EtOAc)来纯化上述油以产生标题化 合物(I120)(25.9mg，86%)，为橙色油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.52(dd, J=4.8,1.6Hz,1H),7.65(dd,J=7.9,1.6Hz,1H),7.29–7.24(m，溶剂遮掩 了峰),3.87(s,2H),3.72(s,3H),3.35(s,1H)。LCMS方法C：rt4.74min； m/z176[M+H]+。
(g)4-(4-((4-((3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)吡啶-2-基)乙炔基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I121)
将处于二甲基甲酰胺(2mL)和三乙胺(107μL,0.765mmol)中的2-(2- 乙炔基吡啶-3-基)乙酸甲酯(I120)(43.6mg,0.249mmol)的溶液加入处于二 甲基甲酰胺(2mL)中的4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶 -1-羧酸叔丁酯(I45)(87.4mg,0.191mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(13mg,0.019 mmol)、Cu(I)I(5.5mg,0.029mmol)和三苯基膦(7.5mg,0.017mmol)的混合 物。在微波照射下在120℃下加热反应混合物10分钟。用EtOAc稀释冷 却的混合物并通过Celite（硅藻土）塞，用乙酸乙酯(100mL)洗涤。在减 压下除去溶剂并在EtOAc(70mL)和水(50mL)之间分配残余物。分离层并 用EtOAc(2x50mL)提取水层。用盐水(70mL)洗涤合并的有机提取物并在 Na2SO4上干燥。在过滤以后，在减压下除去溶剂以产生暗棕色残余物。在 硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-40%EtOAc，40-60℃)来纯化残余物 以产生标题化合物(I121)(81.5mg，72%)，为棕色粘性油，其直接使用无需 进一步纯化。
(h)4-(4-((4-(2-(3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)吡啶-2-基)乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I122)
将处于DMF(10mL)中的4-(4-((4-((3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)吡啶-2- 基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯 (I121)(81.5mg,0.137mmol)的溶液加入处于DMF(7mL)中的10% Pd/C(170mg)的溶液。在氢气氛下在室温下搅拌反应24小时。通过Celite （硅藻土）垫来过滤反应，用EtOAc(100mL)洗涤。真空除去溶剂以产生 油，在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-40%EtOAc，40-60℃)来纯化 上述油以产生标题化合物(I122)(61.4mg，75%)，为粘性油；1HNMR(400 MHz,CDCl3)δ8.51(s,1H),8.46(dd,J=4.8,1.7Hz,1H),7.56–7.50(m, 3H),7.49(s,1H),7.19–7.14(m,2H),7.12(dd,J=7.7,4.8Hz,1H),4.23(bs, 2H),3.72(s,2H),3.70(s,3H),3.40–3.33(m,2H),3.32–3.23(m,2H),2.80 (t,J=12.1Hz,2H),2.62(tt,J=12.1,3.5Hz,1H),1.81(d,J=12.9Hz,2H), 1.65–1.55(m,2H),1.48(s,9H)。LCMS方法C：rt6.01min；m/z622[M+Na]+, 600[M+H]+,544[M-叔丁基+2H]+。
(i)2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)吡啶-3-基)乙酸锂(I123)
将LiOH.H2O(19.1mg,0.455mmol)加入处于THF(7mL)、水(1.5mL) 和甲醇(1mL)中的4-(4-((4-(2-(3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)吡啶-2-基)乙 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I122)(90.9mg, 0.152mmol)的溶液。在室温下允许搅拌产生的混合物20小时。真空除去 挥发物并用EtOAc(50mL)和饱和NaHCO3水溶液(50mL)稀释残余物。对 层加以分离并用EtOAc(2x50mL)提取水层，合并有机层，用盐水(50mL) 洗涤，在Na2SO4上干燥，过滤并在减压下浓缩，以产生标题化合物 (I123)(81.3mg，91%)，为浅黄色粘性油。
(j)4-(4-((4-(2-(3-(2-氨基-2-氧代乙基)吡啶-2-基)乙基)-5-(三氟甲基)嘧 啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I124)
在氮气氛下，将1-羟基苯并三唑(20.4mg,0.151mmol)、EDCl(29.0mg, 0.151mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.192mL,1.10mmol)加入处于干燥 THF(6mL)和干燥DMF(1mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4- 基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)吡啶-3-基)乙酸锂(I123)(81.3 mg,0.137mmol)的溶液。在10分钟以后，一次性将碳酸铵(106mg,1.10 mmol)加入搅拌的反应混合物。在室温下搅拌反应18小时。真空除去挥发 物并用EtOAc(50mL)稀释残余物，然后用饱和NaHCO3(50mL)洗涤。用 EtOAc(2x50mL)提取水层。用盐水(50mL)洗涤合并的有机层并在Na2SO4上干燥。在过滤以后，真空除去溶剂以产生浅黄色油。在硅胶上通过柱层 析法(处于石油醚中0-100%EtOAc，40-60℃)来纯化粗制材料以产生标题 化合物(I124)(66.3mg，83%)，为白色半固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ 8.50(d,J=0.4Hz,1H),8.49(dd,J=4.8,1.7Hz,1H),7.62(s,1H),7.54(dd, J=7.7,1.7Hz,1H),7.51(d,J=8.7Hz,2H),7.19–7.13(m,3H),5.40–5.35 (m,2H),4.23(s,2H),3.68(s,2H),3.41–3.35(m,2H),3.32–3.24(m,2H), 2.80(t,J=12.6Hz,2H),2.63(tt,J=12.0,3.4Hz,1H),1.81(d,J=12.5Hz, 2H),1.65–1.57(m，溶剂遮掩了峰),1.48(s,9H)。LCMS方法C：rt5.25min； m/z607[M+Na]+,585[M+H]+,529[M-叔丁基+2H]+。
(k)2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 吡啶-3-基)乙酰胺(32)
在氮气氛下将三氟乙酸(0.337mL,4.40mmol)加入处于干燥DCM(15 mL)中的4-(4-((4-(2-(3-(2-氨基-2-氧代乙基)吡啶-2-基)乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I124)(64.3mg,0.110mmol)的溶 液并在室温下搅拌反应23小时。真空除去挥发物并在EtOAc(40mL)和2M NaOH(50mL)之间分配残余物。对层加以分离并用EtOAc(2x30mL)提取水 层。用水(40mL)、盐水(40mL)洗涤合并的有机层并在Na2SO4上干燥。在 过滤以后，在减压下除去溶剂以产生黄色固体，将其悬浮在DCM(5mL) 和环己烷(15mL)中。过滤沉淀物以产生标题化合物(32)(35.5mg，53%)， 为黄色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.05(s,1H),8.64(s,1H), 8.36(dd,J=4.8,1.7Hz,1H),7.62–7.55(m,3H),7.53(s,1H),7.18(dd,J= 7.6,4.8Hz,1H),7.15(d,J=8.6Hz,2H),7.00(s,1H),3.53(s,2H),3.24(s, 4H),3.02(d,J=11.9Hz,2H),2.61–2.52(m，溶剂遮掩了峰),1.67(d,J= 11.3Hz,2H),1.49(qd,J=12.2,3.8Hz,2H)。LCMS方法C：rt1.50,1.59min; m/z485[M+H]+。
实施例33：2-(2-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)吡啶-3-基)乙酰胺(33)
在氮气氛下将甲醛(37wt%，在H2O中；16.5μL，0.222mmol)加入 处于无水甲醇(5mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)吡啶-3-基)乙酰胺(32)(22mg,0.044mmol)的悬浮液。然后 一次性添加三乙酰氧基硼氢化钠(94.0mg,0.444mmol)并在室温下搅拌反 应2小时。真空除去挥发物并用EtOAc(25mL)和饱和NaHCO3水溶液(25 mL)稀释残余物。对层加以分离并用EtOAc(2x25mL)提取水层，用水(25 mL)、盐水(25mL)洗涤合并的有机层并在Na2SO4上干燥。在减压下除去 溶剂以产生白色固体。将固体悬浮在DCM(5mL)和环己烷(20mL)中并过 滤，以产生标题化合物(33)(16mg，72%)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz, d6-DMSO)δ10.06(s,1H),8.64(s,1H),8.36(dd,J=4.8,1.7Hz,1H),7.59 (dd,J=7.7,1.2Hz,3H),7.53(s,1H),7.20–7.13(m,3H),7.00(s,1H),3.53 (s,2H),3.24(s,4H),2.91(d,J=10.6Hz,2H),2.47–2.39(m,1H),2.24(s, 3H),2.12–1.99(m,2H),1.78–1.59(m,4H)。LCMS方法C：rt1.51,1.579 min;m/z499[M+H]+。
实施例34：2-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧 啶-4-基)乙基)异烟酰胺(34)
(a)2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)异烟酸甲酯(I125)
在氮气下将2-溴烟酸甲酯(1.00g,4.63mmol)、PdCl2(PPh3)2(162mg, 0.231mmol)、三苯基膦(60.7mg,0.231mmol)和Cu(I)I(44.1mg,0.231mmol) 放入烘箱干燥的反应烧瓶，然后添加TMS-乙炔(785μL,5.55mmol)、干燥 脱气的THF(5mL)以及三乙胺(5mL)。在室温下搅拌产生的混合物16小 时，然后在减压下蒸发以产生黑色残余物，将其吸附到硅胶上。层析分离 (SiO2，0-20%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)产生标题化合物(I125)(708.6mg， 66%产率)，为暗色液体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.75–8.61(m,1H), 7.98(dd,J=1.0,0.4Hz,1H),7.74(dd,J=5.1,1.6Hz,1H),3.94(s,3H),0.26 (s,9H)。LCMS方法C：rt6.38min；m/z234.1[M+1]+。
(b)2-乙炔基异烟酸甲酯(I126)
在0℃下向处于THF(150mL)中的2-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)异烟 酸甲酯(I125)(8.00g,34.2mmol)的溶液添加TBAF(1.0M，在THF中)(51.4 mL,51.4mmol)。允许产生的溶液加温至室温，在此温度下继续搅拌1小 时。用乙酸乙酯(50mL)稀释反应混合物并用10%NaHCO3(50mL)洗涤。 干燥(MgSO4)有机层并在减压下蒸发以产生暗棕色/黑色残余物。将残余物 吸附到硅胶上并通过层析法(SiO2，0-20%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)加以 纯化以产生标题化合物(I126)(4.5g，81%)，为黄色固体；1HNMR(400MHz, CDCl3)δ8.73(dd,J=5.1,0.9Hz,1H),8.01(dd,J=1.5,0.9Hz,1H),7.80 (dd,J=5.1,1.6Hz,1H),3.95(s,3H),3.22(s,1H)。
(c)2-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2-基)乙烯基)异烟酸(E) 甲基酯(I127)
在室温下在氮气下，搅拌处于THF(5mL)中的2-乙炔基异烟酸甲酯 (I126)(100mg,0.621mmol)、Cu(I)Cl(1.84mg,0.0186mmol)、NaOtBu(3.6 mg,0.037mmol)、二频哪醇二硼(189mg,3.74mmol)、Xantphos(10.7mg, 0.0937mmol)和甲醇(40mg,1.2mmol)的溶液4小时。将粗反应混合物吸附 到硅胶上并通过减压蒸发来除去溶剂。通过层析法(SiO2，0-20%乙酸乙酯 /石油醚，40-60℃)进行纯化以产生标题化合物(I127)(141.3mg，79%)，为 黄色液体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.70(dd,J=5.0,0.6Hz,1H),7.93– 7.90(m,1H),7.67(dt,J=4.4,2.2Hz,1H),7.46(d,J=18.3Hz,1H),6.67(d, J=18.3Hz,1H),3.91(s,3H),1.27(s,12H)。
(d)2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙烯基)异烟酸(E)-甲基酯(I128)
将Na2CO3的2.0M水溶液(0.3mL)加入处于1,4-二氧杂环己烷(5mL) 中的4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯 (I45)(100mg,0.103mmol)、2-(2-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂环戊硼烷-2- 基)乙烯基)异烟酸(E)-甲基酯(I127)(76mg,0.26mmol)、Pd(PPh3)4(75mg, 0.66mmol)、LiCl(28mg,0.66mmol)的溶液并在氮气下在90℃下搅拌产生 的混合物16小时。在减压下蒸发粗混合物并吸附到硅胶上。层析分离 (SiO2，0-50%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)产生标题化合物(I128)(110mg， 86%)，为黄色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.84(d,J=4.9Hz,1H), 8.64(s,1H),8.14(d,J=15.1Hz,1H),8.02(s,1H),7.88(dd,J=15.1,1.6Hz, 1H),7.80(dd,J=4.9,1.5Hz,1H),7.60(d,J=8.5Hz,2H),7.36(s,1H),7.25 (m,1H),4.33–4.19(m,2H),4.00(s,3H),2.82(m,2H),2.67(m,1H),1.85(d, J=12.7Hz,2H),1.64(dd,J=12.5,4.0Hz,2H),1.59(s,9H)。LCMS方法C： rt6.93min；m/z584.21[M+1]+,582.1[M-1]-,528.1[M-tBu+2]+。
(e)2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)异烟酸甲酯(I129)
在氢气氛下在大气压下，搅拌处于MeOH(10mL)中的 2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙烯基)异烟酸(E)-甲基酯(I128)(110mg,0.188mmol)、和10%Pd/C(20mg) 的悬浮液16小时。过滤产生的混合物并在减压下蒸发滤液以产生标题化 合物(I129)(70mg，63%)，为黄色液体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(dd, J=5.1,0.7Hz,1H),8.51(s,1H),7.76(s,1H),7.66(dd,J=5.1,1.5Hz,1H), 7.54–7.47(m,3H),7.18(t,J=5.5Hz,2H),4.22(s,2H),3.93(d,J=3.9Hz, 3H),3.43–3.35(m,2H),3.34–3.26(m,2H),2.80(t,J=12.1Hz,2H),2.63 (d,J=3.5Hz,1H),1.82(d,J=12.3Hz,2H),1.67–1.54(m,2H),1.48(d,J= 7.1Hz,3H)。LCMS方法C：rt6.75min；m/z586.1[M+1]+,584.2[M-1]-。
(f)4-(4-((4-(2-(4-氨基甲酰基吡啶-2-基)乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I130)
在室温下搅拌处于THF(5mL)、水(1mL)和MeOH(0.5mL)中的 2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)异烟酸甲酯(I129)(70.0mg,0.120mmol)、和LiOH.H2O(15mg,0.36 mmol)的溶液4小时。在减压下蒸发挥发物以产生黄色固体，将其溶解于 干燥DMF(4mL)。添加HATU(133mg,0.350mmol)、DIPEA(60μL,0.034 mmol)和氯化铵(187mg,3.50mmol)并在室温下搅拌产生的混合物过夜。在 减压下蒸发挥发物并用乙酸乙酯稀释残余物。用10%NaHCO3水溶液洗涤 产生的溶液，然后干燥(MgSO4)有机层并通过减压蒸发来除去挥发物。将 残余物吸附到硅胶上并通过层析法(SiO2，0-100%乙酸乙酯/石油醚， 40-60℃)加以纯化以产生标题化合物(I130)(50mg，50%)，为无色固体；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.67(dd,J=5.1,0.7Hz,1H),8.51(s,1H),7.60(s, 1H),7.55(s,1H),7.53(d,J=8.6Hz,2H),7.44(dd,J=5.1,1.6Hz,1H),7.18 (d,J=8.5Hz,2H),6.37–6.20(m,1H),6.18–5.96(m,1H),4.22(s,2H), 3.34(tt,J=10.4,5.0Hz,4H),2.63(s,1H),1.81(d,J=12.7Hz,2H),1.73(s, 2H),1.60(dd,J=12.7,4.1Hz,2H),1.48(s,9H)。LCMS方法C：rt6.04min； m/z571.2[M+1C,569.2[M-1]-,515.2[M-t-Bu+2]+。
(g)2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)异 烟酰胺(I131)
将三氟乙酸(100μL,0.131mmol)加入处于DCM(4mL)中的 4-(4-((4-(2-(4-氨基甲酰基吡啶-2-基)乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯 基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I130)(50mg,88μmol)的溶液并在室温下搅拌产生 的混合物1小时。在减压下蒸发挥发物并通过层析法(SiO2，0-50% MeOH/DCM)来纯化残余物以产生标题化合物(I131)(28mg，68%)，为无色 固体；1HNMR(400MHz,d4-MeOD)δ8.55(d,J=5.2Hz,1H),8.49(s,1H), 7.74(s,1H),7.61(dd,J=5.2,1.3Hz,1H),7.53(d,J=8.3Hz,2H),7.17(d,J =8.5Hz,2H),3.46(d,J=12.7Hz,2H),3.37(t,J=7.0Hz,2H),3.27(dt,J= 3.2,1.6Hz,5H),3.18–3.04(m,2H),2.83(ddd,J=12.1,8.7,3.6Hz,1H), 2.03(d,J=13.8Hz,2H),1.88(ddd,J=16.7,13.6,3.8Hz,2H)。LCMS方法 C：rt4.44min；m/z471.1[M+1]+,469.1[M-1]-。
(h)2-(2-(2-((4-(1-甲基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)异烟酰胺(34)
将甲醛溶液(37%水溶液；24μL，0.30mmol)加入处于干燥MeOH(2 mL)中的2-(2-(2-((4-(哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)异 烟酰胺(I131)(28mg,60μmol)的溶液。添加三乙酰氧基硼氢化钠(63mg, 0.30mmol)并在室温下在氮气下搅拌产生的混合物2小时。添加乙酸乙酯 并将产生的溶液吸附到硅胶上。层析分离(SiO2，0-50%MeOH/DCM)产生 标题化合物(34)(14mg，49%)，为无色固体；1HNMR(400MHz,d4-MeOD) δ8.58(d,J=4.9Hz,1H),8.51(s,1H),7.73(s,1H),7.61(dd,J=5.2,1.6Hz, 1H),7.53(d,J=8.5Hz,2H),7.18(d,J=8.6Hz,2H),3.51–3.31(m,4H), 2.99(d,J=11.7Hz,2H),2.56–2.44(m,1H),2.32(s,3H),2.15(d,J=2.8Hz, 2H),1.87–1.70(m,4H)。LCMS方法C：rt4.50min；m/z485.1[M+1]+,483.1 [M-1]-。
实施例35：2-(2-(2-(2-((4-(吡咯烷-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶 -4-基)乙基)苯基)乙酰胺(35)
(a)4-(((三氟甲基)磺酰基)氧基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羧酸叔丁酯(I132 和I133)
在-78℃下，向处于THF(20mL)中的二(三甲基甲硅烷基)酰胺钠 (1.01g,5.50mmol)的搅拌溶液滴加处于THF(7mL)中的3-氧代吡咯烷-1-羧 酸叔丁酯(0.925g,5.00mmol)的溶液。在搅拌15分钟以后，添加处于THF(12 mL)中的N-苯基-二(三氟甲磺酰亚胺)(1.79g,5.00mmol)并在-78℃下搅拌 反应混合物另外3小时，然后在室温下搅拌1小时。用10%NaHCO3水溶 液淬灭反应混合物并用EtOAc提取。用盐水洗涤有机层，在MgSO4上干 燥，并真空浓缩。在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中20-80%二氯甲烷， 40-60℃)来纯化产生的残余物以产生标题化合物(I132和I133)的混合物 (1.44g，90%)，为浅黄色油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(s,1H),5.66 (d,J=17.5Hz,2H),4.21–4.09(m,8H),1.41(s,18H)。
(b)4-(4-硝基苯基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羧酸叔丁酯(I134和I135)
将2MNa2CO3水溶液(5.70mL,9.09mmol)加入处于1,4-二氧杂环己烷 (10mL)中的4-硝基苯基硼酸(0.909g,1.52mmol,1.2eq)、4-(((三氟甲基)磺酰 基)氧基)-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羧酸叔丁酯(134和135)(1.44g,4.54mmol)、 LiCl(0.385g,9.08mmol)和Pd(PPh3)4(1.57g,1.36mmol)的脱气混合物。在 80-90℃下搅拌反应混合物4小时。将产生的混合物溶解于EtOAc(70mL)， 用H2O(50mL)、盐水(50mL)洗涤有机层，并在Na2SO4上干燥，以产生暗 红色油。在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-20%EtOAc，40-60℃) 来纯化上述油以产生标题化合物(I134和I135)的混合物(0.442g，34%)，为 浅黄色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.41–8.32(m,2H),8.24–8.19 (m,2H),7.81–7.73(m,2H),7.52(dd,J=8.8,2.4Hz),6.43–6.33(m,1H), 4.58–4.48(m,4H),4.42–4.31(m,4H),1.52(s,9H),1.51(s,9H)。
(c)3-(4-氨基苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(I136)
将处于EtOH(10mL)和DMF(10mL)中的4-(4-硝基苯基)-2,3-二氢 -1H-吡咯-1-羧酸叔丁酯(I134和I135)(0.442g,1.52mmol)的溶液加入处于 DMF(10mL)中的10%Pd/C(255mg)的溶液。在室温下在氢气氛下搅拌反 应17小时。通过Celite（硅藻土）垫过滤反应并用EtOAc(130mL)洗涤。 真空除去溶剂以产生棕色油，在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-50% EtOAc，40-60℃)对其加以纯化以产生标题化合物(I136)(0.307g，77%)，为 棕色油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.02(d,J=8.4Hz,2H),6.64(d,J= 8.4Hz,2H),3.85–3.49(m,4H),3.43–3.29(m,1H),3.29–3.15(m,2H), 2.18(d,J=6.5Hz,1H),1.97–1.85(m,1H),1.47(d,J=4.7Hz,9H)。LCMS 方法C：rt4.88min；m/z163.2[M-Boc+H]+。
(d)3-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁 酯(I137)
在0℃下在氮气流下将氯化锌(1.0M，在Et2O中)(1.40mL,1.40mmol) 加入处于1:1DCE/t-BuOH(10mL)中的2,4-二氯-5-(三氟甲基)嘧啶(180μL, 1.29mmol)的溶液。在0℃下搅拌混合物1小时，然后添加处于1:1 DCE/tBuOH(10mL)中的3-(4-氨基苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(I136)(0.307g, 1.17mmol)。接着在0℃下滴加处于1:1DCE/t-BuOH(5mL)中的NEt3(0.180 mL,1.29mmol,1.1eq)的溶液。在最终添加以后，在0℃下剧烈搅拌反应 混合物另外30分钟，然后在室温下搅拌16小时。真空除去溶剂以产生棕 色油状残余物，在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-50%EtOAc， 40-60℃)对其加以纯化以产生浅黄色固体。将固体悬浮在MeOH(15mL) 和水(15mL)中。过滤沉淀物以产生标题化合物(I137)(0.449g，87%)，为 浅黄色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.56 (s,1H),7.53(d,J=8.5Hz,2H),7.40(s,1H),7.26(s,2H),3.92–3.73(m, 1H),3.69–3.51(m,1H),3.48–3.22(m,3H),2.26(s,1H),2.03–1.90(m, 1H),1.48(s,9H)。LCMS方法C：rt6.68min；m/z443.0[M+H]+,441.1 [M-H]-。
(e)3-(4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶 -2-基)氨基)苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(I138)
将处于二甲基甲酰胺(3mL)中的2-乙炔基苯甲酸甲酯(I4)(0.21g, 1.2mmol)的溶液和三乙胺(0.57mL,4.1mmol)加入处于二甲基甲酰胺(4mL) 中的3-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯 (I137)(0.45g,1.0mmol,1eq)、Pd(PPh3)2Cl2(71mg,0.10mmol)、Cu(I)I(30 mg,0.15mmol)和三苯基膦(40mg,0.15mmol,0.15)的混合物。在微波照射 下在120℃下加热反应混合物15分钟。冷却反应并用EtOAc稀释混合物， 然后通过Celite（硅藻土）塞并用EtOAc(60mL)洗涤。添加水(50mL)并分 离层。用EtOAc(2x50mL)提取水层。用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤合并 的有机提取物并在Na2SO4上干燥。在过滤以后，真空除去溶剂以产生暗 棕色残余物，在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-20然后20-50% EtOAc，40-60℃)来纯化残余物以产生标题化合物(I138)(0.53g，90%)，为 橙色油；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.62(s,1H),7.68(dd,J=7.7,1.0Hz, 1H),7.58(d,J=8.4Hz,2H),7.47–7.41(m,2H),7.39–7.30(m,4H),7.24(s, 1H),3.96(s,2H),3.87–3.75(m,1H),3.70(s,3H),3.68–3.52(m,1H),3.48 –3.22(m,3H),2.30-2.21(m,1H),2.02–1.94(m,1H),1.49(s,9H)。LCMS 方法C：rt6.82min；m/z581.1[M+H]+。
(f)3-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基) 氨基)苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(I139)
将处于EtOH(10mL)中的3-(4-((4-((2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基)乙 炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯 (I138)(0.527g,0.906mmol)的溶液加入处于DMF(6mL)中的10% Pd/C(0.500g)的溶液。在室温下在氢气氛下搅拌反应24小时。通过Celite （硅藻土）垫来过滤反应并用EtOAc(80mL)洗涤。真空除去溶剂以产生 黄色油。将其吸收在DMF/EtOH(1:1,10mL)中并添加处于DMF中10% Pd/C(0.500g,1eq)的淤浆。在H2气氛下在室温下搅拌反应另外24小时。 通过Celite（硅藻土）垫来过滤反应并用EtOAc(80mL)洗涤。真空除去溶 剂以产生黄色油，在硅胶上通过柱层析法(处于石油醚中0-45%EtOAc， 40-60℃)对其加以纯化以产生标题化合物(I139)(0.126g，24%)，为棕色油； 1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),7.58(d,J=8.2Hz,2H),7.39(s, 1H),7.30–7.17(m,6H),3.91–3.72(m,2H),3.75(s,2H),3.68(s,3H),3.66 –3.52(m,1H),3.47–3.21(m,3H),3.17–3.04(m,4H),2.23(d,J=20.4Hz, 1H),1.97(dd,J=21.1,10.2Hz,1H),1.48(d,J=3.1Hz,9H)。LCMS方法C： rt6.91min；m/z585[M+H]+,607[M+Na]+。
(g)2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟 甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I140)
将LiOH.H2O(0.015g,0.65mmol,3eq)加入处于THF(7mL)、水(1.5mL) 和甲醇(1mL)中的3-(4-((4-(2-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(I139)(0.13g,0.22mmol)的溶 液，并在室温下允许搅拌产生的混合物70小时。真空除去挥发物并用 EtOAc(50mL)和饱和NaHCO3水溶液(50mL)稀释残余物。对层加以分离 并用EtOAc(2x50mL)提取水层。用盐水(50mL)洗涤合并的有机层，在 MgSO4上干燥并真空除去溶剂，以产生标题化合物(I140)(0.12g，99%)， 为浅黄色油；LCMS方法C：rt6.56min；m/z571.1[M-Li+2H]+,515.1[M-Li- 叔丁基+2H]+,471.1[M-Li-Boc+2H]+,569.2[M-Li-H]-。
(h)3-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨 基)苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(I141)
在氮气氛下将1-羟基苯并三唑(38.0mg,0.28mmol)、EDCl(50.0mg, 0.32mmol)和N,N-二异丙基乙胺(187uL,1.08mmol)加入处于干燥THF(6 mL)和干燥DMF(1mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基) 苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酸锂(I140)(124mg, 0.215mmol)的溶液。在10分钟以后，一次性将碳酸铵(101mg,1.08mmol) 加入搅拌的反应混合物，并在室温下搅拌反应23小时。真空除去挥发物 并用EtOAc(65mL)稀释残余溶液，然后用饱和NaHCO3(65mL)洗涤。用 EtOAc(2x50mL)提取水层。用盐水(50mL)洗涤合并的有机层并在MgSO4上干燥。真空除去溶剂以产生浅黄色油。在硅胶上通过柱层析法(处于石 油醚中0-80%EtOAc，40-60℃)来纯化粗制材料以产生标题化合物 (I141)(76mg，62%)，为白色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H), 8.02(s,1H),7.56(d,J=7.4Hz,2H),7.29–7.20(m，4H，被溶剂遮掩),5.36 (d,J=21.2Hz,2H),3.89–3.76(m,1H),3.66-3.51(m,2H),3.45-3.27(m, 4H),3.15–3.04(m,4H),2.29-2.25(m,1H),2.01-1.94(m,1H),1.49(s,9H)。 LCMS方法C：rt6.37min；m/z570.1[M+H]+,568.2[M-H]-。
(i)2-(2-(2-(2-((4-(吡咯烷-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙 基)苯基)乙酰胺(35)
向处于DCM(20mL)中的3-(4-((4-(2-(2-氨基-2-氧代乙基)苯乙 基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(I141)的溶液 添加TFA(4.0mL)并在室温下搅拌反应混合物30分钟。真空除去溶剂并将 残余物吸收在EtOAc(10mL)和2MNaOH(10mL)中。用EtOAc(2×10mL) 提取有机层，并用水(10mL)、盐水(10mL)洗涤合并的层，然后在MgSO4上干燥。真空除去溶剂以产生黄色固体。将固体悬浮在环己烷中并过滤以 产生棕色固体(42mg)。通过RP-HPLC(Waters，处于H2O中0-80%CH3CN， 经20分钟，流率为10mL/min)来进一步纯化产物。用2MNaOH碱化(pH 10)包含产物的馏分并用EtOAc提取。用盐水(10mL)洗涤合并的有机层， 干燥(MgSO4)并真空除去溶剂，以产生标题化合物(35)(17mg，27%)，为棕 色油；1H-NMR(400MHz,d4-MeOD)δ8.56(d,J=0.6Hz,1H),7.73–7.68 (m,2H),7.33–7.16(m,6H),3.67(s,2H),3.60–3.46(m,2H),3.42–3.33(m, 2H),3.14(m,5H),2.45(dtd,J=10.1,7.1,3.4Hz,1H),2.18–2.05(m,1H)； LCMS方法C：rt4.84min；m/z470.1[M+H]+。
实施例36：2-(2-(2-(2-((4-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)苯基)氨基)-5-(三氟 甲基)嘧啶-4-基)乙基)苯基)乙酰胺(36)
将2-(2-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基) 乙基)苯基)乙酰胺(25)(11mg,0.022mmol)溶解于甲醇(1mL)。添加37%甲 醛溶液(7μL)，接着添加三乙酰氧基硼氢化钠(24mg,0.11mmol)。在室温 下剧烈搅拌混合物两小时，然后浓缩。将残余物悬浮在10%氢氧化钠(1mL) 和盐水(2mL)中，然后用乙酸乙酯(5x2mL)提取。用盐水洗涤合并的乙酸 乙酯相，在硫酸钠上干燥，蒸发并由DCM蒸发残余物，以产生标题化合 物(36)(10.3mg，94%产率)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz,d4-MeOD) δ8.46(d,J=0.5Hz,1H),7.60–7.54(m,2H),7.20(d,J=8.6Hz,2H),7.18– 7.13(m,1H),7.13–7.07(m,3H),3.57(s,2H),3.46(s,2H),3.06(qd,J=6.8, 3.1Hz,2H),3.01–2.94(m,2H),2.54(s,8H),2.29(s,3H)。LCMS方法C： 4.70min；m/z513.2[M+H+];m/z511.0[M-H]-。
实施例37：3-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶 -4-基)乙基)苯甲酰胺(37)
(a)3-碘苯甲酰胺(I142)
将3-碘苯甲酸(2.00g,8.06mmol)溶解于THF(20mL)，然后添加草酰 氯(1.4mL,16mmol)和DMF(0.05mL)，并搅拌产生的混合物2小时。在减 压下蒸发挥发物并将残余物溶解于THF(20mL)和浓氨水(10mL)。在60 分钟以后，添加水(200mL)，并在另外30分钟以后，通过过滤来收集产 生的沉淀物并空气干燥，以产生标题化合物(I142)(1.97g，99%产率)，为 白色粉末；1HNMR(400MHz,d4-MeOH)δ8.23(t,J=1.8Hz,1H),7.90 (ddd,J=7.9,1.7,1.0Hz,1H),7.86(ddd,J=7.8,1.7,1.0Hz,1H),7.24(t,J= 7.8Hz,1H)。LCMS方法C：rt5.29min,m/z248.1[M+H]+。
(b)3-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯甲酰胺(I143)
将3-碘苯甲酰胺(I142)(1.00g,4.05mmol)、二(三苯基膦)氯化钯 (II)(0.142g,5mol%)、碘化铜(I)(0.077g,10mol%)、DMF(4mL)和二异丙 基胺(12mL)装入微波管。用氮气脱气混合物10分钟，然后添加三甲基甲 硅烷基乙炔(0.69mL,4.9mmol)并在微波照射下在120℃下加热产生的混 合物15分钟。在减压下蒸发挥发物并层析(BiotageIsolera，40g二氧化硅 卡套柱，0-100%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃)残余物，以产生标题化合物 (I143)(0.569g，65%产率)，为棕色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.88 (td,J=1.8,0.5Hz,1H),7.78(ddd,J=7.8,1.8,1.2Hz,1H),7.63–7.59(m, 1H),7.40(td,J=7.8,0.5Hz,1H),6.05(brs,1H),5.67(brs,1H),0.26(s, 9H)。LCMS方法C：rt5.94min,m/z218.2[M+H]+。
(c)3-乙炔基苯甲酰胺(I144)
将3-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯甲酰胺(I143)(0.565g,2.60mmol)溶 解于THF(33mL)，并添加处于THF(3.25mL,3.25mmol)中的1MTBAF。 在两小时以后，将反应倒入水(200mL)中并用乙醚(3x200mL)提取产生的 溶液。用盐水(200mL)洗涤合并的醚相，在硫酸钠上干燥，然后蒸发，以 产生标题化合物(I144)(0.357g，95%产率)，为褐色固体；1HNMR(400MHz, CDCl3)δ7.92(t,J=1.5Hz,1H),7.83–7.79(m,1H),7.64(dt,J=7.7,1.4Hz, 1H),7.42(td,J=7.8,0.5Hz,1H),6.07(brs,1H),5.77(brs,1H),3.13(s, 1H)。LCMS方法C：rt4.74min,m/z146.2[M+H]+。
(d)4-(4-((4-((3-氨基甲酰基苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基) 苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I145)
将4-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)哌嗪-1-羧酸叔丁基 酯(I94)(0.30g,0.64mmol)、3-乙炔基苯甲酰胺(I144)(102mg,0.70mmol)、 碘化铜(I)(12mg,10mol%)、三苯基膦(17mg,10mol%)、二(三苯基膦)氯 化钯(II)(22mg,5mol%)、DMF(3mL)和三乙胺(0.443mL,3.18mmol)装入 微波管并用氮气脱气5分钟。在微波照射下在120℃下加热产生的混合物 15分钟，然后冷却至室温。将冷却的混合物加入5%碳酸钾水溶液(150mL) 并用乙酸乙酯(3x150mL)提取产生的混合物。用水(200mL)、盐水(200mL) 洗涤合并的乙酸乙酯相，干燥，然后蒸发。层析(BiotageIsolera：12g二 氧化硅卡套柱，20-100%乙酸乙酯/石油醚，40-60℃，然后为0-10%甲醇/ 乙酸乙酯)残余物以产生标题化合物(I145)(107mg，29%产率)，为黄色固 体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.46(s,1H),8.84(s,1H),8.17(s,1H), 8.09(t,J=1.7Hz,1H),8.04(dt,J=7.9,1.4Hz,1H),7.77(dt,J=7.8,1.3Hz, 1H),7.71–7.66(m,2H),7.66–7.52(m),7.27(d,J=8.6Hz,2H),3.44(s, 2H),2.33–2.26(m,4H),1.38(s,9H)。LCMS方法C：rt5.06min；m/z581.1 [M+H]+,525.1[M-tBu+2H]+;m/z579.2[M-H]-。
(e)4-(4-((4-(3-氨基甲酰基苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苄基) 哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I146)
在30℃下在氢气下，在DMF(5mL)和三乙胺(0.15mL)中搅拌 4-(4-((4-((3-氨基甲酰基苯基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苄基)哌 嗪-1-羧酸叔丁酯(I145)(105mg,0.18mmol)和Pd/C(75mg)的悬浮液18小 时。在过滤以后，在减压下蒸发挥发物并层析(BiotageIsolera：4g二氧化 硅卡套柱，0-2%甲醇/乙酸乙酯)残余物，以产生标题化合物(I146)(66.6mg， 63%产率)，为白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO)δ10.20(s,1H),8.67 (s,1H),7.93(s,1H),7.79(s,1H),7.74–7.50(m,8H),7.40–7.35(m,2H), 7.33(s,1H),7.24(d,J=8.6Hz,2H),3.43(s,2H),3.17–3.04(m,4H),2.36– 2.23(m,4H),1.38(s,9H)。LCMS方法C：rt5.05min；m/z585.2[M+H]+;m/z 583.2[M-H]-。
(f)3-(2-(2-((4-(哌嗪-1-基甲基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙 基)苯甲酰胺(37)
将4-(4-((4-(3-氨基甲酰基苯乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苄基) 哌嗪-1-羧酸叔丁酯(I146)(65mg,0.11mmol)溶解于DCM(10mL)，然后添 加TFA(1mL)，并在室温下搅拌产生的混合物18小时。在减压下蒸发挥 发物并在10%氢氧化钠(25mL)和乙酸乙酯(25mL)之间分配残余物。用乙 酸乙酯(3x25mL)提取水相，然后用盐水洗涤合并的乙酸乙酯相，在硫酸 钠上干燥并蒸发。用甲苯(2x2mL)和DCM(2x0.5mL)洗涤残余物以产生标 题化合物(37)(22mg，40%产率)，为白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO) δ10.19(s,1H),8.66(s,1H),7.94(s,1H),7.78(s,1H),7.74–7.64(m,3H), 7.40–7.35(m,2H),7.35–7.29(m,1H),7.23(d,J=8.2Hz,2H),3.38(s,2H), 3.17–3.02(m,4H),2.75–2.61(m,4H),2.29(s,4H)。LCMS方法C：rt4.52 min；m/z485.1[M+H]+;m/z483.1[M-H]-。
实施例38：2-(2-(2-(2-((4-(1-乙基哌啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)吡啶-3-基)乙酰胺(38)
在室温下在惰性气氛下，搅拌处于DMF(5mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(哌 啶-4-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)吡啶-3-基)乙酰胺(32)(74 mg,0.15mmol)、溴乙烷(12μL,0.16mmol)和碳酸钾(63mg,0.46mmol)的 混合物48小时。在减压下除去挥发物并在乙酸乙酯(20mL)和饱和碳酸氢 钠溶液(20mL)之间分配残余物。用乙酸乙酯(2×30mL)提取水层并用盐水 洗涤合并的有机物，然后干燥(MgSO4)。在减压下除去溶剂并层析(Biotage Isolera：C-18反相柱，处于H2O中0-100%MeCN)产生的固体，以产生标 题化合物(38)(22mg，28%)，为灰白色固体；1HNMR(400MHz,d6-DMSO) δ10.07(s,1H),8.65(s,1H),8.37(dd,J=4.8,1.7Hz,1H),7.65–7.57(m, 3H),7.55(s,1H),7.26–7.13(m,3H),7.02(s,1H),3.54(s,2H),3.25(s,4H), 2.98(d,J=11.3Hz,2H),2.48–2.30(m,3H),1.95(q,J=11.7,11.3Hz,2H), 1.73(d,J=10.5Hz,2H),1.63(qd,J=12.4,3.6Hz,2H),1.03(t,J=7.2Hz, 3H)。LCMS方法C：rt4.16min;m/z513[M+H]+。
实施例39：2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4- 基)乙基)吡啶-3-基)乙酰胺(39)
(a)3-(4-((4-((3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)吡啶-2-基)乙炔基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I147)
将处于THF(1mL)和三乙胺(0.199mL,1.43mmol)中的2-(2-乙炔基吡 啶-3-基)乙酸甲酯(I120)(0.100g,0.571mmol)的溶液加入处于二甲基甲酰 胺(3mL)中的3-(4-((4-氯-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔 丁酯(I24)(0.217g,0.476mmol)、Pd(PPh3)2Cl2(0.033g,0.048mmol)、 Cu(I)I(0.014g,0.071mmol)和三苯基膦(0.019g,0.071mmol)的混合物。在微 波照射下在120℃下加热产生的混合物20分钟，然后冷却，脱气10分钟 并在微波照射下在120℃下加热另外20分钟。用乙酸乙酯稀释冷却的混 合物并且使产生的溶液通过Celite（硅藻土）塞，用乙酸乙酯(250mL)洗 涤。除去挥发物以产生棕色固体，对其加以层析(BiotageIsolera：25g二 氧化硅卡套柱，处于石油醚中0-40%EtOAc，40-60℃)，以产生标题化合 物(I147)(0.061g，22%)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),8.62(d,J =1.2Hz,1H),7.72(dd,J=7.9,1.3Hz,1H),7.57(d,J=8.4Hz,2H),7.54(s, 1H),7.35(dd,J=7.9,4.7Hz,1H),7.23(d,J=8.5Hz,1H),4.30-4.06(m) 3.95(s,2H),3.71(s,3H),2.84–2.58(m,3H),2.06-1.98(m),1.70-1.66(m, 2H),1.69–1.51(m,2H),1.47(s,9H)。
(b)3-(4-((4-(2-(3-(2-甲氧基-2-氧代乙基)吡啶-2-基)乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I148)
向处于DMF(9mL)和三乙胺(1mL)中的3-(4-((4-((3-(2-甲氧基-2-氧代 乙基)吡啶-2-基)乙炔基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔 丁酯(I147)(0.061g,0.10mmol)的溶液添加处于DMF(3mL)中的Pd/C(0.070 g)的淤浆。在氢气氛下在室温下搅拌产生的混合物16小时。用乙酸乙酯 稀释粗反应混合物，然后通过Celite（硅藻土）垫加以过滤。用乙酸乙酯 洗涤Celite（硅藻土）并合并滤液。真空除去溶剂以产生棕色油，将其吸 收在DMF(9mL)和三乙胺(1mL)中。添加处于DMF(3mL)中的Pd/C(0.070 g)的淤浆，并在氢气氛下在室温下搅拌产生的混合物另外19小时。用乙 酸乙酯稀释粗反应混合物，然后通过Celite（硅藻土）垫加以过滤。用乙 酸乙酯洗涤Celite（硅藻土）并合并滤液。真空除去溶剂以产生棕色油， 对其加以层析(BiotageIsolera：25g二氧化硅卡套柱，处于石油醚中0-50% EtOAc，40-60℃)，以产生标题化合物(I148)(0.030g，49%)，为黄色油；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.50(s,1H),8.46(dd,J=4.8,1.7Hz,1H),7.61– 7.46(m,4H,NH),7.19(d,J=8.6Hz,2H),7.12(dd,J=7.7,4.8Hz,1H),4.35 –3.99(m),3.72(s,2H),3.70(s,3H),3.37(J=7.4Hz,2H),3.28(t,J=6.9 Hz,2H),2.80–2.57(m,3H),2.07–1.95(m),1.91–1.69(m,2H),1.69–1.50 (m,3H),1.46(s,9H)。LCMS方法C：rt=6.00min,m/z600.2[M+H]+。
(c)2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲 基)嘧啶-4-基)乙基)吡啶-3-基)乙酸(I149)
向处于THF(7mL)、水(1.5mL)和MeOH(1mL)中的3-(4-((4-(2-(3-(2- 甲氧基-2-氧代乙基)吡啶-2-基)乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌 啶-1-羧酸叔丁酯(I148)(0.030g,0.050mmol)的溶液添加氢氧化锂一水合物 (0.020g,0.48mmol)。在室温下搅拌反应混合物17小时，然后真空除去挥 发物并在乙酸乙酯(10mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)之间分配残余 物。对层加以分离并用乙酸乙酯(2×10mL)提取水层。用盐水(10mL)洗涤 合并的有机层，干燥(MgSO4)，然后真空除去溶剂，以产生标题化合物 (I149)(0.029g，99%)，为白色固体。LCMS方法C：rt5.50min,m/z=586.1 [M+H]+,584.2[M-H]-。
(d)3-(4-((4-(2-(3-(2-氨基-2-氧代乙基)吡啶-2-基)乙基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I150)
在氮气氛下将1-羟基苯并三唑(20mg,0.15mmol)、EDCl.HCl(32mg, 0.17mmol)和N,N-二异丙基乙胺(45μL,0.26mmol)加入处于干燥DMF(5 mL)中的2-(2-(2-(2-((4-(1-(叔丁氧基羰基)哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲 基)嘧啶-4-基)乙基)吡啶-3-基)乙酸(I149)(29mg,0.051mmol)的溶液。在10 分钟以后，一次性添加碳酸铵(50mg,0.52mmol)，然后在室温下继续搅拌 17小时。添加另外部分的1-羟基苯并三唑(20.0mg,0.15mmol)、 EDCl.HCl(32mg,0.17mmol)和N,N-二异丙基乙胺(45μL,0.26mmol)，然 后在10分钟以后一次性添加碳酸铵(50mg,0.52mmol)。在25℃下搅拌产 生的溶液24小时。真空除去挥发物并在乙酸乙酯(10mL)和饱和碳酸氢钠 (10mL).之间分配残余物。用乙酸乙酯(2×10mL)提取水层，然后用盐水(10 mL)洗涤合并的有机层，干燥(MgSO4)并蒸发至干燥。层析(BiotageIsolera： 10g二氧化硅卡套柱，0-100%EtOAc/石油醚，40-60℃，然后10g二氧化 硅卡套柱，50-100%EtOAc/石油醚，40-60℃)残余物，以产生标题化合物 (I150)(0.023g，77%)，为白色固体；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.49(s,1H), 8.46(dd,J=4.8,1.6Hz,1H),7.77(brs,1H),7.57–7.44(m,3H),7.19(d,J= 8.5Hz,2H),7.14(dd,J=7.6,4.8Hz,1H),5.63(d,J=22.0Hz,2H),4.35– 3.96(m),3.67(s,2H),3.41–3.33(m,2H),3.27(t,J=6.9Hz,2H),2.83– 2.58(m,3H),2.01-1.99(m,1H),1.80–1.71(m,1H),1.68(s,3H),1.65–1.52 (m,2H),1.46(s,9H)。
(e)2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基) 吡啶-3-基)乙酰胺(39)
向处于DCM(7mL)中的3-(4-((4-(2-(3-(2-氨基-2-氧代乙基)吡啶-2-基) 乙基)-5-(三氟甲基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(I150)(23mg, 0.039mmol)的溶液添加TFA(1mL)。在室温下搅拌产生的溶液17小时， 然后真空除去挥发物。在乙酸乙酯(50mL)和NaOH的2.0M溶液(50mL) 之间分配残余物，然后用水(50mL)、盐水(50mL)洗涤有机层并在真空蒸 发以前在MgSO4上干燥，以产生标题化合物(39)(18mg，94%)，为白色固 体；1HNMR(400MHz,d4-MeOH)δ8.52(s,1H),8.37(dd,J=4.9,1.6Hz, 1H),7.67(dd,J=7.7,1.6Hz,1H),7.61(d,J=8.6Hz,2H),7.27–7.17(m, 3H),3.68(s,2H),3.39–3.32(m,2H),3.27(d,J=8.7Hz,2H),3.21-3.14(m, 2H),2.82–2.70(m,3H),2.07–1.94(m,1H),1.94–1.83(m,1H),1.80– 1.64(m,2H)。LCMS方法C：rt4.12min,m/z=485.1[M+H]+,483.1[M-H]-。
实施例40：2-(2-(2-(2-((4-(1-乙基哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基) 嘧啶-4-基)乙基)吡啶-3-基)乙酰胺(40)
将N,N-二异丙基乙胺(18.0μL,0.103mmol)加入处于DMF(5mL)中的 2-(2-(2-(2-((4-(哌啶-3-基)苯基)氨基)-5-(三氟甲基)嘧啶-4-基)乙基)吡啶-3- 基)乙酰胺(39)(17mg,0.034mmol)的溶液。搅拌混合物5分钟，然后添加 溴乙烷(4.0μL,0.051mmol)，并在室温下继续搅拌24小时。添加另外部分 的溴乙烷(4.0μL,0.051mmol)并在室温下搅拌反应混合物另外16小时。真 空蒸发挥发物并在乙酸乙酯(10mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)之间分 配残余物。对层加以分离并用乙酸乙酯(2x10mL)提取水层。用水(10mL)、 盐水(10mL)洗涤合并的有机层并在Na2SO4上干燥。在减压下过滤然后除 去溶剂，以产生米黄色固体，通过质量定向的制备型HPLC对其加以纯化， 以产生标题化合物(40)(6.2mg，36%)，为白色固体：1HNMR(400MHz, d4-MeOH)δ8.54(s,1H),8.38(dd,J=4.8,1.5Hz,1H),7.69-7.66(m,3H), 7.28–7.19(m,3H),3.68(s,2H),3.59–3.46(m,2H),3.38–3.22(m，被 d4-MeOH部分地遮掩),3.19–3.08(m,2H),3.04–2.80(m,3H),2.12–1.99 (m,2H),1.99–1.70(m,2H),1.34(t,J=7.3Hz,3H)。LCMS方法C：rt=4.20 min,m/z=513.2[M+H]+,511.2[M-H]-。
生物学测定
可以利用生化和细胞测定来描绘本发明的化合物的活性。
可以利用AlphaScreenTM技术生化测定来估计针对FAK的主要效力。
可以利用表面等离子体共振(SPR)技术测定，利用BiacoreTMS51传感 器来建立Ka、kd以及因此的KD来进一步研究这种结合的动力学。当与蛋 白质的分离速率大大超过结合速率时，如对于高度有效的化合物可以发生 的，KD给出蛋白-配体结合亲和力的准确度量。
可以借助于利用MesoScaleDiscoverySECTORImager6000仪器进 行的ELISA型测定来估计本发明的化合物在细胞内抑制FAK的能力。在 这种测定中，确定了本发明的化合物抑制Y397-FAK的磷酸化的能力。
可以利用2D增殖测定利用适宜的细胞系来估计本发明的化合物对抑 制细胞增殖（来自非FAK活性）的影响。这表明脱靶活性和来自它们的 潜在毒性。因而，比较Y397-FAK的磷酸化和2D增殖的抑制则给出FAK 特异性介导效应的度量和来自脱靶活性的潜在毒性的量度。
可以利用AlphaScreenTM技术生化测定来估计针对VEGFR3的主要 效力。
可以借助于ELISA型测定来估计本发明的化合物在细胞内抑制 VEGFR3的能力。
FAK生化AlphaScreenTM测定
生物素标记肽用作底物(氨基酸序列：生物素 -Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe- NH2)。FAK酶在昆虫细胞中表达为催化结构域(氨基酸411-686)，其N端 标记有六个组氨酸氨基酸，和烟草蚀纹病毒(TeV)切割序列。在通过超声 处理来溶解细胞以后，通过Ni固定化金属亲和层析法，TeV切割留下N 端甘氨酸，并凝胶过滤，来纯化激酶。在Greiner牌的白色384孔低容量 孔板中进行15μl测定反应。所有反应都包含10mMHEPESpH7.4、25mM NaCl、10mMMgCl2、0.01%(v/v)吐温-20、50μMNa3VO4、0.01%(w/v)白 蛋白（来自鸡蛋白）、111nM肽底物、80μMATP、和4ng/反应FAK酶， 其中在阴性对照反应中省去上述酶。以100nl体积添加化合物，其来自在 DMSO中制备的稀释系列，阳性和阴性对照反应接收相同体积的DMSO 而没有化合物。用粘性密封件密封上述孔板并在30℃下孵育90分钟。通 过同时添加的检测试剂来终止反应。产物形成被量化为在PerkinElmer AlphaScreenTM珠粒（利用涂布有链霉亲合素的供体和抗磷酸酪氨酸 (P-Tyr-100)受体珠粒）之间放大的发光。向每个反应，添加5μl，其包含 10mMHEPESpH7.4、25mMNaCl、100mMEDTA、0.01%(v/v)吐温-20、 和6.25μg/ml的每种珠类型。在以HTSAlphascreenTM模式下在PerkinElmer EnVisionTM酶标仪上读取以前，孵育孔板6小时。通过相对于相同孔板上 的对照，对于每个反应，计算出百分比抑制(%I)(%I=(I-CN)/(CP-CN)，其 中CN/CP分别是阴性/阳性反应的平均值)来获得IC50值，然后相对于化合 物浓度[I]拟合%I数据为%I=(A+((B-A)/(1+((C/[I])^D))))，其中A是下部渐 近线，B是上部渐近线，C是IC50值，且D是斜率因子。 结果
化合物 IC50(nM) 1 2.1 2 2.5 3 1.9 4 1.5 5 2.4 6 4.2 7 9.6 8 6.1 9 7.0 10 2.9 11 3.0 12 6.3 13 0.60 14 21 15 18 16 2.0 17 3.4 18 13 19 7.7 20 0.81 21 2.4 22 2.8 23 0.39 24 0.77 25 3.0 26 20 27 7.2 28 0.30 29 11 30 11 31 3.6 32 3.5 33 6.2 34 5.7 35 7.7 36 2.3 37 15 38 23 39 14 40 51
FAKBiacoreTMSPR测定
利用BiacoreTMS51传感器来确定化合物的结合参数。按照制造商的 推荐，通过伯胺偶联，将抗GST抗体固定在CM5芯片上。
在运行缓冲液(0.01MHEPESpH7.4、0.15MNaCl、0.005%表面活性 剂P20、10mMMgCl2、和1%DMSO)时，在斑点1和2上，捕获N端GST 融合的纯化的FAK酶。随后，在每个循环开始时，通过加载30nM PF-562,271来封闭斑点1。在25℃下，在斑点上，注射浓度系列的测试化 合物。特异性结合被计算为斑点2和1信号之间的差异，接着进行溶剂校 正。拟合成单位点结合模型产生动力学速率常数kd和ka以及平衡结合常 数KD=kd/ka。
对于具有预期的KD<5nM的化合物，仅在抗GST抗体涂布的芯片的 斑点2上捕获到N端GST融合的纯化的FAK酶。在化合物的注射循环以 后，在再次捕获酶以前，用10mM甘氨酸-HCl,pH2.2来再生芯片表面。 如前所述，分析结合传感器克数（sensorgram）。
结果
化合物 KD(nM) 1 0.49 2 1.5 3 0.91 4 0.73 5 0.57 6 6.3 7 2.3 8 1.0 9 7.0 10 0.96 11 0.61 12 0.92 13 0.47 14 6.1 15 5.0 16 1.3 17 3.5 18 13 19 7.8 20 0.63 21 0.44 22 0.99 23 1.3
24 0.77 25 1.1 26 14 27 16.6 28 0.94 29 12.1 30 5.7 31 1.0 32 2.5 33 5.6 34 5.0 35 1.6 36 0.48
P397Y-FAK抑制MSD平台细胞生物标志物测定
可以在以下测定中，测试本发明的化合物的体外活性：
用30μL/孔的小鼠单克隆FAK抗体[63D5](cat#ab72140,Abcam)（其 在PBS中预稀释至1mg/mL的浓度），涂布96孔板(cat#MA6000,MesoScale Discovery)。用粘性薄膜密封孔板并在4℃下孵育16小时。然后从孔板弹 出抗体并添加150μL的3%[w/v]BlockerA(cat#R93AA-1,MesoScale Discovery)。用粘性薄膜重新密封孔板，并在室温下在设定为中等速度的 振荡器上孵育2小时。然后，在下文描述的细胞溶解产物添加以前，用包 含50mMTris-HClpH7.5、0.15MNaCl和0.02%吐温-20的溶液洗涤孔板 三次。
在化合物处理以前2天，将细胞1:2分到T150细胞培养烧瓶中。在 化合物处理前当天，将包含20,000个细胞的200μL培养基接种到白色、 透明底部、经TC处理的、透明的96孔微量滴定板(cat#655098,Greiner Bio-One)的所有孔中，并在37℃和5%CO2下孵育孔板36小时。然后添 加1μL/孔的化合物，其来自在DMSO中制备的稀释系列。阴性对照孔接 收相同体积的DMSO而没有化合物，而阳性对照孔接收处于相同体积的 DMSO中的2μM对照化合物。在37℃和5%CO2下处理细胞1小时。然 后弹出培养基/化合物并添加55μL/孔的冰冷的完全裂解缓冲液。通过添加 1片PhosSTOP完全磷酸酶抑制剂(cat#04906837001,Roche)和1片完全迷 你不含EDTA的蛋白酶抑制剂(cat#04693159001,Roche)/10mL的不完全裂 解缓冲液(150mMNaCl、20mMTris-HClpH7.5、1mMEDTA、1mMEGTA、 1%Triton-X100)来制备完全裂解缓冲液。在冰上孵育孔板30分钟，其中 每5分钟高速孔板振动30秒。将40μL/孔的细胞溶解产物转移到如上文描 述的涂布的、封闭的和洗涤的96孔微量滴定板。用粘性薄膜密封96孔板 并在4℃下孵育16小时。然后用包含50mMTris-HClpH7.5、0.15MNaCl 和0.02%吐温-20的溶液洗涤孔板三次并排干。添加25μL/孔的检测溶液 (1%[w/v]BlockerA(cat#R93AA-1,MesoScaleDiscovery)，在50mM Tris-HClpH7.5、0.15MNaCl和0.02%吐温-20中，并具有1:600兔多克隆 FAK磷酸Y397抗体(cat#ab39967,Abcam)、1:1000抗兔磺基标记抗体 (cat#R32AB-1MesoScaleDiscovery)和1:40重构BlockerD-M (cat#D609-0100,RocklandImmunochemicalsforResearch))，并用粘性薄膜 重新密封孔板，然后在室温下在设定为中等速度的孔板振荡器上孵育1小 时。然后用包含50mMTris-HClpH7.5、0.15MNaCl和0.02%吐温-20的 溶液洗涤孔板三次，并排干。然后添加150μL/孔的ReadBufferT+表面活 性剂(cat#R92TC-1,MesoScaleDiscovery)，并利用MesoScaleDiscovery SECTORImager6000仪器来定量pFAK-397水平。
首先通过相对于在相同孔板上的对照，计算每个溶解产物的百分比抑 制(%I)(%I=(S-CP)/(CN-CP))来确定IC50值，其中S是样品结果，CN是仅 DMSO处理的阴性对照的平均结果，并且CP是2μM处理的阳性对照的平 均结果。%I是相对于化合物浓度[I]描绘的并且利用以下方 程，%I=(A+((B-A)/(1+((C/[I])^D))))来拟合数据，其中A是下部渐近线，B 是上部渐近线，C是IC50值，并且D是斜率因子。
MDA-231-LNA细胞的结果
化合物 IC50(nM) 在2μM下对照的反应% 1 59 114 2 58 96 3 27 99 4 140 105 5 70 109 6 440 108 7 260 114 8 124 105 9 214 105 10 37 109 11 116 112 12 522 106 13 26 111 14 572 71 16 36 111 17 60 89
18 880 98 20 13 111 21 1 87 22 23 91 23 8 120 24 12 107 25 25 85 27 341 107 28 7 86 30 281 119 31 39 139 33 24 84
2D细胞增殖测定
在细胞接种前两天，将细胞1:4分到T75细胞培养烧瓶中。在这种测 定中可以采用多种癌细胞系。
在细胞接种的当天，将100μL/孔的包含1000-5000个细胞的培养基加 入96孔微量滴定板(Cat.#655180,greinerbio-one)，除了其中添加100μ培 养基的孔G12和H12之外。在第二孔板中，在相同浓度下接种单行细胞。 该第二孔板称作t=0孔板并用来计算在添加测试试剂以前的相对细胞数。 在37℃/5%CO2下孵育包含细胞的孔板24小时。然后添加0.5μL/孔的化合 物，其来自在DMSO中制备的稀释系列。对于每组平板，包括具有已知 效力的化合物，以估计测定性能。阴性对照孔接收相同体积的DMSO而 没有化合物。背景信号由仅包含培养基的孔确定。在对其他孔板添加化合 物的当天，利用基于刃天青的试剂(参见下文)的添加来读取t=0孔板。然 后在37℃和5%CO2下温育化合物添加至其中的包含细胞的孔板3天。
在孵育3天以后，通过添加20μl/孔的具有以下典型组成的基于刃天 青的试剂来量化细胞增殖：在PBS缓冲液中，刃天青，Sigma#R7017-1G， 0.015%w/v；亚甲蓝，Sigma#MB-1(25g)，0.0025%w/v；六氰基铁(III)酸 钾，Sigma#P8131-100G，0.033w/v；六氰基铁(II)酸钾三水合物，Sigma# P9387-100G，0.042%w/v。在(579Ex/584Em)处或其附近确定荧光以前，用 基于刃天青的试剂孵育孔板1-4小时(37℃,5%CO2)。
对于每个经处理的孔，相对于在相同孔板上的对照，使用以下方程式 计算出增殖的百分比抑制(%I)：%I=(S-B)-(T0-B)/(CN-B)-(T0-B)，其中S是 样品结果，B是背景荧光，T0是t=0的值并且CN是仅DMSO处理的阴性 对照的平均结果。对于IC50确定，%I是相对于化合物浓度[I]描绘的，并 且利用以下方程来拟合数据：%I=(A+((B-A)/(1+((C/[I])^D))))，其中A是 下部渐近线，B是上部渐近线，C是IC50值，并且D是斜率因子。
MDA-231-LNA细胞的结果
化合物 IC50(μM) 1 1.15 2 3.21 3 1.63 4 1.73 5 1.54 6 3.91 7 1.73 8 1.16 9 3.58 10 1.43 11 2.25 12 1.70 13 >1.0 14 4.49 15 2.37 16 2.00 17 3.51 18 >5 19 1.49 20 1.46 21 0.80 22 1.07 23 4.82 24 1.70 25 2.89 26 >5.5 27 2.81 28 1.35 29 >5 30 >5 31 4.10 32 >5 33 1.52 34 7.85 35 >10 36 5.62 37 2.79 38 >10
VEGFR3生化测定
可以在以下测定中测试本发明化合物的体外活性：
生物素标记肽用作底物(氨基酸序列：生物素 -Glu-Gly-Pro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Tyr-Gly-Trp-Met-Asp-Phe- NH2)。购买VEGFR3细胞质结构域(氨基酸798-1298)作为N端GST融合 蛋白(“酶”)。在Greiner牌白色384孔低容量孔板中运行15μl测定反应。 所有反应都包含10mMHEPESpH7.4、10mMMgCl2、0.01%(v/v)吐温-20、 50μMNa3VO4、0.01%(w/v)白蛋白（来自鸡蛋白）、1mM二硫苏糖醇、111nM 肽底物、500μMATP、和3.8ng/反应酶，其中在阴性对照反应中省去上述 酶。以100nl的体积添加化合物，其来自在DMSO中制备的稀释系列，阳 性和阴性对照反应接收相同体积的DMSO而没有化合物。用粘性密封件 密封孔板并在30℃下孵育90分钟。通过同时添加的检测试剂来终止反应， 具体如下：将产物形成定量为在PerkinElmerAlphaScreenTM珠粒（使用涂 布有链霉亲合素的供体和抗磷酸酪氨酸(P-Tyr-100)受体的珠粒）之间的放 大发光。向每个反应，添加5μl，其包含10mMHEPESpH7.4、25mMNaCl、 100mMEDTA、0.01%(v/v)吐温-20、和6.25μg/ml的每种珠粒类型。在 PerkinElmerEnVisionTM酶标仪上以HTSAlphascreenTM模式读取以前，孵 育孔板6小时。对于每个反应，相对于在相同孔板上的对照，通过计算出 百分比抑制(%I)来获得IC50值(%I=(I-CN)/(CP-CN)，其中CN/CP分别是 阴性/阳性反应的平均值)，然后将相对于化合物浓度[I]的%I数据拟合 为%I=(A+((B-A)/(1+((C/[I])^D))))，其中A是下部渐近线，B是上部渐近 线，C是IC50值，并且D是斜率因子。
在一些情况下(下文用*指示)，还以稍微改变的形式来进行上述测定。 在这些情况下，VEGFR3细胞质结构域(氨基酸818-1177，缺少UniProt 登陆号P35916的949-1002)被表达并纯化为N端六-His-融合蛋白(“酶”)， 而不是使用N端GST-融合蛋白。
结果
化合物 IC50(nM) 1 10 2 120* 3 1.1 4 4.0 5 12 6 52 7 48
8 4.8 9 2.5 10 4.0 11 2.5 12 12 13 70 14 101 15 37 16 11 17 31 18 664 19 37 20 5.0 21 25 22 15 23 12 24 3.9 25 14 26 51 27 30 28 10 29 68 30 7 31 12 32 5.1* 33 16* 34 184* 35 53* 36 16 37 254 38 23* 39 23* 40 46*
Flt4磷酸基ELISA测定
可以在以下测定中测试本发明化合物的体外活性：
以200,000个细胞/孔(体积1mL)，将成年人皮肤淋巴微血管内皮细胞 (HMVEC-dLyAD)(Cat#CC-2810,Lonza)接种于处于EndogroMV完全液 (Cat#SCME004,Millipore)中的透明底部、经TC处理的12孔板(Cat# 665180,GreinerBio-One)，并在37℃和5%CO2下孵育孔板6小时。用 EndogroBasal(Cat#SCME-BM,Millipore)+0.1%BSA(Cat#A8412, Sigma)更换培养基，并孵育细胞另外一段时间(在37℃和5%CO2下过夜)。
用100μL的总VEGFR2捕获抗体(Part#841888,HumanTotal VEGFR3/Flt4ELISAKit,Cat#DYC3491,R&DSystems)、或磷酸基VEGF R3捕获抗体(Part#841885,Human磷酸基VEGFR3/Flt4ELISAKit,Cat# DYC2724,R&DSystems)涂布96孔Maxisorp免疫孔板(Cat#439454, Nunc)。在室温下涂覆和孵育孔板过夜。
弹出包被抗体并用洗涤缓冲液(磷酸缓冲盐水溶液(137mMNaCl、 2.7nMKCL、8.1nMNa2HPO4、1.5mLKH2PO4、pH7.2-7.4)、0.05%吐温20) 洗涤孔板三次。然后将300μL封闭缓冲液(5%v/v吐温20、5%w/v蔗糖， 在PBS中)加入孔中并在室温下孵育孔板2小时。弹出封闭溶液，洗涤孔 板三次，并排干。
在Endogrobasal(Cat#SCME-BM,Millipore)+0.1%BSA(Cat#A8412, Sigma)（具有恒定的0.1%DMSO浓度）中，制备化合物稀释系列。将439μL 样品或载体对照加入细胞单层。在37℃和5%CO2下处理细胞1小时。将 250ng/mL的重组人VEGF-C(Cat#2179-VC,R&DSystems)加入孔并在 37℃和5%CO2下孵育孔板另外10分钟。
除去培养基和化合物并用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水溶液 (Cat#21600-044,Invitrogen)洗涤细胞单层一次。将130μL裂解缓冲液加入 孔中，收获细胞溶解产物，转移到管中并储存在冰上。通过添加10μL蛋 白酶抑制剂混合物(Cat#P8340,Sigma-Aldrich)、10μLPMSF(苯基甲磺酰 基氟,Cat#P7626,Sigma-Aldrich，制备为500mMDMSO原液)/1mL的 PhosphosafeTM提取试剂(Cat#71296,Merck)来制备完全裂解缓冲液。
然后在ICDiluent#18(5%吐温20/PBS)中1:2稀释收获的样品，将 100μL转移到总VEGFR3和磷酸基VEGFR3涂布的、封闭的和洗涤的96 孔板，并在室温下孵育2小时。然后用洗涤缓冲液洗涤孔板三次（如上文 描述的）并排干。
为了检测总VEGFR3，将在ICDiluent#1(1%w/vBSA(Cat#A7906, Sigma-Aldrich)/PBS)中稀释的100μL的检测抗体(总VEGFR3检测抗体部 分#841888，在总VEGFR3试剂盒中)加入孔并在室温下孵育孔板2小时。 然后在洗涤缓冲液中洗涤孔板三次并排干。将在ICdiluent#1链霉亲合素 -HRP中稀释的100μL链霉亲合素-HPR（部分#890803，在总VEGFR3试 剂盒中)，加入孔中，并在室温下孵育20分钟，接着洗涤（如上文描述的）。 添加100μL底物溶液(用于ELISA的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)液体底 物系统，Cat#T0440,Sigma-Aldrich)并在黑暗中在室温下孵育孔板20分 钟，接着添加50μL终止溶液(2NH2SO4)。
利用MultiskanAscent酶标仪和Ascent软件（匹配450nm滤光片） 来量化总VEGFR3水平。
为了检测磷酸基VEGFR3，将100μL检测抗体(抗磷酸基-酪氨酸-HRP 检测抗体，部分#841403，在磷酸基VEGFR3试剂盒中)稀释于ICDiluent #1(1%w/vBSA/PBS)中，加入孔中并在室温下孵育孔板2小时。然后在洗 涤缓冲液中洗涤孔板三次（如上文描述的）并排干。添加100μL底物溶液 (用于ELISA的3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)液体底物系统，Cat#T0440, Sigma-Aldrich)，并在黑暗中在室温下孵育孔板20分钟，接着添加50μL 终止溶液(2NH2SO4)。
利用Multiscanascent酶标仪和ascent软件（匹配450nm滤光片）来 量化磷酸基VEGFR3水平。
按照以下公式，相对于总VEGFR3，通过首先计算磷酸基VEGFR3 的水平，来确定IC50值：
SRP = SP ST ]]>
其中SRP是样品相对磷酸基水平，SP是磷酸基VEGFR3读数并且 ST是总VEGFR3读数。
然后按照以下公式，计算出相对于载体对照(VEGF-C刺激的)每种溶 解产物的百分比抑制(%I)：
其中SRP是样品相对磷酸基水平（如上文计算的）。
%I是相对于化合物浓度描绘的并且利用S形剂量反应曲线(GraphPad Prism4，用于Windows)并借助地以下方程来拟合数据(Y=底部+(顶部-底 部)/(1+10^(LogEC50-X)))，其中X是浓度的对数，Y是反应。Y开始于底 部并以S形运行到顶部。
结果
化合物 IC50(nM) 3 80 5 240 8 127 11 67 12 81 16 36 17 44 20 30 21 113 22 30 24 71 25 66 30 658 31 67 33 81 36 169