油菜呼吸代谢相关基因BnAOX1及应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102618560 A (43)申请公布日 2012.08.01 CN 102618560 A *CN102618560A* (21)申请号 201110031200.X (22)申请日 2011.01.27 C12N 15/53(2006.01) C12N 9/02(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人 中国农业科学院油料作物研究所 地址 430062 湖北省武汉市武昌区徐东二路 二号 (72)发明人 王汉中 华玮 刘静 刘贵华 王新发 胡志勇 詹高淼 (74)专利代理机构 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人 王敏锋 (54) 。

2、发明名称 油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 及应用 (57) 摘要 本发明公开了一种油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 及应用， 通过筛选基因表达差异， 发现 BnAOX1 基因在油菜高油亲本及高油 F2 混合群体 中表达量高于低油亲本及低油 F2 混合群体。通 过 arabidopsis 网站拟南芥 AOX1 基因的序列和 测序数据库， 寻找与之同源的油菜基因组序列拼 接， 并设计基因编码区序列的两侧引物。以亲本 zy036cDNA 第一链为模板进行 RT-PCR 扩增， 将扩 增得到的片段进行测序， 获得 BnAOX1 基因的编码 区序列， 还包括在添加、 取代、 插入或缺失一个或 多个。

3、核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物。 利用拟南芥作为受体的转基因结果证实， 此类基 因的过量表达可以提高拟南芥种子的含油量， 同 时也增加了种子的粒重。 因此， 此类基因在油菜及 其他油料作物的产油量育种中具有很好的应用前 景。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 6 页 序列表 3 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种分离的基因序列， 其碱基序列为 SEQ ID NO:1 所示的核苷酸序列。 2. 一种分离的蛋白质序列， 其序列为 SEQ I。

4、D NO:2 所示的氨基酸序列。 3. 权利要求 1 或 2 所述的一种分离的蛋白质在提高拟南芥植物种子千粒重中的应用。 4. 权利要求 1 或 2 所述的一种分离的蛋白质在提高拟南芥植物种子含油量中的应用。 权 利 要 求 书 CN 102618560 A 2 1/6 页 3 油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 及应用 技术领域 0001 本发明涉及植物基因工程领域， 更具体涉及一种油菜呼吸代谢相关酶基因 BnAOX1， 同时还涉及一种油菜呼吸代谢相关酶基因 BnAOX1 在提高油料作物的产量和含油 量中的应用。 背景技术 0002 油菜籽是世界上食用植物油和饲用蛋白质的最主要来源之一， 也。

5、是欧洲生物柴油 最重要的原料。油菜是我国种植面积最大的油料作物， 也是继水稻、 小麦、 玉米和大豆之后 我国的第五大农作物。菜籽油是我国居民的主要食用油， 占国产植物油消费总量的 40以 上。 我国作为世界第一植物油消费大国， 植物油的自给率不足40。 为解决这些需求矛盾， 除扩大种植面积外， 提高油菜含油量和产量是提高其单位面积产油量的最有效途径。高产 油量能够显著提高油菜生产效益， 提高油菜籽的总体利润。 0003 植物线粒体电子传递链有多条途径存在， 其中主要有细胞色素主路和抗氰交 替途径支路两条途径。抗氰呼吸 ( 交替途径 ) 指的是对氰化物不敏感的一条呼吸途 径。交替氧化酶 (alt。

6、er native oxidase， AOX) 是植物线粒体呼吸链中抗氰呼吸途径 (cyanide-resistant respiration pathway) 的末端氧化酶， 它广泛存在于高等植物及部 分真菌和藻类中。 交替氧化酶作为交替途径的末端氧化酶， 其内源底物包括还原泛醌和02。 交替途径的呼吸电子流从主路 ( 细胞色素途径 ) 泛醌处分支出来， 绕过复合物 III 和 IV 两 个 ATP 形成位点， 直接由 AOX 催化分子氧的 4 个电子还原成水， 而未用来合成 ATP 的能量则 以热的形式被散失掉。 0004 交替氧化酶是一种双铁羧基蛋白 (di-iron carboxyla。

7、te protein)， 它不仅具有 其它双铁羧基蛋白共有的结构特点以及去除分子氧的功能， 更重要的是它还可以通过改变 自身结构等方式来主动调节抗氰呼吸途径的运行程度， 进而调节细胞多方面的代谢和功 能， 以适应环境条件的改变， 增强植物适应各种逆境的能力， 调节植物生长速率， 并与细胞 凋亡和光合作用相关。 AOX活性调控受多种因素影响， 环境胁迫、 植物受伤、 冻害、 干旱、 渗透 压及病菌等都可诱导AOX表达。 水杨酸(SA)、 过氧化氢、 乙烯和主呼吸链抑制剂也同样能诱 导 AOX 在植物中的表达。抗氰呼吸活性和 AOX 表达在产热植物的佛焰花序中较高。在非产 热植物中， AOX 表达。

8、水平与发育状态有关， 如在衰老和果实成熟过程中都有 AOX 的表达。 0005 AOX 调节能量代谢， 当能量代谢饱和时， AOX 途径以散热方式释放能量， 维持电子 传递和 TCA。Lambers(1982) 提出的能量溢满理论认为 ： 当主呼吸链活性受到抑制时， 或细 胞还原力偏高时， 电子通过 AOX 传递可使 TCA 循环和糖酵解继续进行。AOX 活性能为 TCA 循 环底物丙酮酸激活， 说明 TCA 循环的底物过高时可诱导 AOX 途径转移部分电子。环境变化 导致 AOX 表达差异， 不仅改变线粒体功能， 也影响线粒体外细胞功能。氧胁迫诱导 AOX 表达 并抗氧化， 当细胞色素途径受。

9、抑时， 主呼吸链产生活性氧 (ROS)， AOX 氧化可使 ROS 下降。在 转基因烟草中 AOX 的超量表达时 ROS 水平下降， 反之 ROS 水平则提高。Hansen 等 (2002) 测 量热呼吸发现环境变化能改变植物生长率， AOX 对植物生长动态起平衡作用。产热植物通 说 明 书 CN 102618560 A 3 2/6 页 4 过 AOX 释放的热量可使花粉散发芳香气味吸引虫媒 (Meeuse 等， 1975)。非产热植物组织中 AOX 的表达与此同产热无关 (Borecky and Vercesi， 2005)。AOX 可有效调控呼吸率保持细 胞能量恒定以保证植物在环境变化时正。

10、常生长 (Hansen 等， 2002)。AOX 不仅使拟南芥在低 温下发芽， 而且 AOX 能防止植物组织在逆境中产生过氧化物而广泛影响细胞功能 (Fiorani 等， 2005)。AOX 在细胞质和一些碳代谢途径中发挥重要作用 (Umbach 等， 2005)。各种环境 胁迫都能改变植物抗氰途径的运行， 但这些研究还很肤浅， 其运行的信号调节机制和生理 意义还不清楚。 发明内容 0006 本发明的目的是在于提供了一种油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1， 本发明提供了这 个基因的核苷酸序列， 如 SEQ ID NO ： 1 所示的 DNA 序列， 也包括与 SEQID NO ： 1 所示的 。

11、DNA 序列至少有70同源性的本物种及其它物种中的基因序列。 该基因属于植物交替氧化酶家 族中的一员， 它通过调节抗氰呼吸途径的运行程度， 来调节细胞多方面的代谢和功能， 以适 应环境条件的改变， 调节植物生长速率， 并与细胞凋亡和光合作用相关。 在拟南芥中该基因 被抑制可导致部分基因表达量发生改变， 但未见对其表型的影响报道。 0007 本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 在提高油 料植物含油量中的应用。 将此基因应用于油料作物育种， 可以提高油料作物种子的含油量， 最大限度的提高油料作物的产油量。 0008 本发明的再一个目的是在于提供了一种油菜呼吸代谢相。

12、关基因 BnAOX1 在提高拟 南芥植物种子千粒重中的应用。通过模式植物拟南芥证实 BnAOX1 基因不但可调控种子含 油量的变化， 同时还增加了千粒重。 0009 为了达到上述目的， 本发明采用了以下技术措施 ： 0010 本发明申请人通过分析油菜含油量差异显著的两亲本及 F2 代分离群体混合样本 的基因表达差异， 筛选出一类在亲本及 F2 代极端分离材料中同时存在表达差异的基因， 其 中包括 BnAOX1 基因。为了验证该基因是否影响种子含油量或种子其它性状， 申请人通过 基因全长的克隆， 表达载体的构建以及模式植物拟南芥的转化。该油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 在提高油料植物含油量和。

13、千粒重中应用。 0011 一、 基因的来源 ： 0012 一种油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 的制备方法， 其步骤是 ： 0013 以高低含油量品系 zy036 与 y817( 含油量分别为 51和 35 ) 杂交构建 F2 代群 体共得到 169 个后代单株为材料 ； 分别收集各 F2 单株开花后 25 天左右的角果 ( 带角果皮 和胚珠 ) ； 各单株成熟种子进行含油量检测， 将含油量检测大于 47和小于 38.5的单株 的角果分别取等量 200mg 混合组成两极端含油量混合样本分别编号 H( 含油量大于 47的 有 11 株 ) 和 L( 含油量小于 38.5的有 11 株 )， 两。

14、个混样平均含油量相差 11.1。分析 两亲本及两混样表达基因， 找出亲本与 F2 代混样表达量同时表现差异的基因， BnAOX1 基因 即源于此。本研究中所用的亲本材料 zy036 和 Y817， 均由中国农科院油料所生物技术育种 课题组技术人员在王汉中研究员带领下育成。zy036 品系是由中双 4 号、 中双 7 号、 中双 9 号、 华双 3 号、 油研 9 号 ( 中双 4 号、 中双 7 号、 中双 9 号、 华双 3 号、 油研 9 号 ) 构建轮回选 择群体， 轮回选择两代后选优良单株进行小孢子培养轮回选择第三代， 最终经高油定向选 说 明 书 CN 102618560 A 4 3。

15、/6 页 5 择得到。Y817 是杂交品种中油杂 1 号的保持系 ( 中油杂一号制种技术研究与应用， 农村经 济与科技， 2001 年第 10 期 )。 0014 二、 基因的全长克隆 ： 0015 通过筛选基因表达差异， 发现 BnAOX1 基因在油菜高油亲本及高油 F2 混合群体中 表达量高于低油亲本及低油 F2 混合群体。因此申请人根据 arabidopsis 网站拟南芥 AOX1 基因的序列和申请人自己的测序数据库， 寻找与之同源的油菜基因组序列拼接， 并设计基 因编码区序列的两侧引物。以亲本 zy036cDNA 第一链为模板进行 RT-PCR 扩增， 将扩增得到 的片段进行测序， 获。

16、得 BnAOX1 基因的编码区序列， 还包括在添加、 取代、 插入或缺失一个或 多个核苷酸而产生的突变体等位基因或衍生物。一种分离的蛋白质， 其碱基序列为 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸序列。一种分离的蛋白质， 其蛋白质序列为 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸 序列。同时， 利用 arabidopsis 网站上的基因序列设计引物扩增拟南芥中同源基因 AtAOX1 序列。利用拟南芥作为受体的转基因结果证实， 此类基因的过量表达可以提高拟南芥种子 的含油量， 同时也增加了种子的粒重。 因此， 此类基因在油菜及其他油料作物的产油量育种 中具有很好的应用前景。 0016 三、 转基因。

17、载体的构建、 转化及验证 ： 0017 通过上述方法获得了油菜 BnAOX1 基因， 采用一种提高油菜基因表达活性的转基 因拟南芥， 其特征在于与受体对照(非转基因植株)相比， 转基因植物表现为基因表达量增 加， 其具体措施是 ： 0018 一种 PCR8/GW/TOPO 质粒 (invitrogen 公司购买 )， 可以与表达载体质粒重组构建 基因表达质粒的实验方法 (invitrogen 公司购买 )。 0019 一种质粒表达载体Pearleygate100(invitrogen公司购买)， 它含有35S启动子和 翻译控制件。 0020 一种可在植物中表达的宿主菌 ( 如 GV3101， 。

18、LBA4404 等 )， 本发明优选的是农杆菌 (GV3101， invitrogen 公司购买 )。 0021 一种能够过量表达某基因的转基因拟南芥， 其特征在于拟南芥中所转基因表达量 增加。其应用过程包括下列步骤 ： 0022 1) 将克隆得到的油菜基因与 PCR8/GW/TOPO 质粒连接， 利用 PCR8/GW/TOPO 质粒与 质粒表达载体 Pearleygate100 可以体外重组的特性将油菜基因转移至表达载体 ； 0023 2) 将步骤 1) 中制备的表达载体转入根癌农杆菌 GV3101， 再导入拟南芥植株中。 0024 3) 转基因阳性植株 PCR 鉴定， 除草剂 (Bar， 。

19、草苷膦 ) 筛选后正常条件生长并收获 种子测定含油量。结果表明， 转基因拟南芥种子的含油量与对照拟南芥相比有较大幅度的 提高。 0025 本发明中所用的术语 “转基因植物” 是指含有导入的基因并能够稳定地增强或抑 制所导入的基因表达并产生具有特定的生物学性状的植物。 克隆本发明中所述的油菜基因 的方法是本领域中所常采用的方法如 ： 利用 CTAB 法提取植物叶片 DNA， 提取 mRNA 的方法也 有多种成熟的技术， 如采用 TRIzol Reagent， Invetrogen 公司或 Total RNA extraction， qiagen 公司， 可从商业途径获得。构建 cDNA 文库也是。

20、常用的分子生物学技术。构建本发明 中所述的载体和将载体转染入植株也是本领域中所常采用的方法。其中所涉及的质粒 ( 入 门载体PCR8/GW/TOPO， 质粒表达载体Pearleygate100)， 转染用媒体(如根癌农杆菌GV3101 说 明 书 CN 102618560 A 5 4/6 页 6 和所用试剂 ( 蔗糖等 ) 可从商业途径获得。聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子标记的多态性分析 的最常用手段， 所有试剂如丙烯酰胺、 甲叉丙烯酰胺等均可从商业途径获得。 0026 转基因拟南芥分析 ： 通过在野生拟南芥中过量表达 BnAOX1、 AtAOX1 基因， 转基因 拟南芥整体植株表型与野生型没有明显。

21、区别。收获种子后发现， 转 AOX1 基因的植株种子明 显大于野生型对照。 通过脉冲式核磁共振仪测定含油量， 结果表明转基因植株与对照相比， 含油量均有不同程度的提高， 转基因拟南芥种子含油量与野生型拟南芥相比有明显提高， 最高幅度可达 20以上。而千粒重也有所增加， 增加幅度最高达 25 ( 见表 1)。上述结果 表明， 不仅油菜 AOX1 基因可以提高种子含油量， 同时还可以增加粒重， 而且与此类油菜基 因序列有 70同源性的其它物种基因同样可以提高含油量。 0027 本发明的优点是 ： 本发明中油菜 BnAOX1 基因为首次报导与种子含油量、 粒重相 关。交替氧化酶 (AOX1) 具有其。

22、它双铁羧基蛋白共有的结构特点以及去除分子氧的功能， 属 于植物交替氧化酶家族中的一员。它通过调节抗氰呼吸途径的运行程度， 来调节细胞多方 面的代谢和功能， 以适应环境条件的改变， 增强植物适应各种逆境的能力， 调节植物生长速 率， 并与细胞凋亡和光合作用相关。在拟南芥中该基因被抑制可导致部分基因表达量发生 改变， 但未见对其表型的影响报道。 通过在拟南芥中的转基因研究证实， 此类基因确实可以 提高种子含油量， 同时还可以增加种子粒重。 此类基因可以应用于油菜高含油量育种， 通过 使用组成型启动子 35S 在油菜品种中超量表达此类基因， 得到含油量提高且千粒重增加的 油菜新品种， 加快油菜含油量。

23、育种的步伐。 同时， 将其扩展到其他油料作物如大豆、 花生、 芝 麻等的育种应用中， 最大限度的提高油料作物的产油量。 附图说明 0028 图 1 为一种油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 的拟南芥表达载体示意图 0029 图 2 为一种油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 的拟南芥 T1 代的转基因鉴定结果。 0030 图 3 为一种油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 的野生型对照种子的大小比较示意 0031 图。其中图 3A 为野生对照， 图 3B 为转基因株系的种子。 具体实施方式 0032 实施例 1 ： BnAOX1、 AtAOX1cDNA 编码区序列 0033 一种油菜呼吸代谢相关基。

24、因 BnAOX1 的制备方法， 其步骤是 ： 0034 在 NCBI 数 据 库 中 检 索 已 发 表 的 拟 南 芥 基 因 序 列， BLAST NCBI 网 站 的 油 菜 EST 序列， 并结合拟南芥序列设计基因编码序列的两侧引物 (BnAOX1F ： 正向引物 ： 5 -atgatgatgagtcgctacgg-3 ， 反向引物 ： 5 -tcaatgatccaattggag-3 用来从油菜 15 天角果cDNA中扩增对应序列。 拟南芥中的扩增引物分别为 ： AtAOX1(arabidopsis网站)正 向引物 ： 5 -atgatgatgagtcgtcgcta-3 ， 反向引物 。

25、： 5 -tcaatgatatccaatgggagc-3 ， 直接在拟南芥 10 天角果 cDNA 中扩增。 0035 1、 提取油菜、 拟南芥 mRNA。 0036 RNA 的提取 (TRIZOL TM Kit 提取 RNA)， 液氮研磨 100mg 材料。 0037 A. 加 1mlTRIZOL， 室温 (20-25， 以下相同 ) 放置 5min。 0038 B. 加入 200ul 氯仿， 剧烈振荡 30s， 室温放置 2min。 说 明 书 CN 102618560 A 6 5/6 页 7 0039 C.12000g， 15min， 4， 取上清至新管中， 加入 500ul 异丙醇， 。

26、混匀后室温放置 15min。 0040 D.12000g， 15min， 4， 去上清， 加入 1ml70 ( 体积比 ) 乙醇。 0041 E.7500g， 7min， 4， 去上清， 空气干燥。 0042 F.DEPC-H2O 溶解。 0043 2、 cDNA 第一链的反转录采用 RevertAid H Minus First Strand cDNASynthesis Kit(Fermentas)， 操作参照所用试剂盒说明进行。 0044 3、 以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增， 得到了 BnAOX1 及 AtAOX1 基因序列如 ： 一种油菜 呼吸代谢相关基因 BnAOX1， 一种。

27、分离的蛋白质， 其碱基序列为 SEQ ID NO ： 1 所示的核苷酸 序列。一种分离的蛋白质， 其蛋白质序列为 SEQ ID NO ： 2 所示的氨基酸序列所示以及 NCBI 网站数据库中已发表的拟南芥基因序列。 0045 实施例 2 ： 转基因表达载体的构建及拟南芥的转化 ： 0046 将 PCR 扩增得到的基因序列与 TOPO 入门载体 (invitrogen 公司 ) 连接后， 转化到感受态细胞 DH5(invitrogen 公司 ) 中， 壮观酶素筛选， 载体引物 (T7 引物， TAATACGACTCACTATAGGG) 与基因引物 ( 基因上游引物， 引物序列见实施例 1) 扩增。

28、鉴定正 向插入克隆， 质粒经小量制备后与 Pearleygate100(invitrogen 公司 ) 进行重组， 并转化 到感受态细胞 DH5 中， 卡那霉素筛选， 其插入片段经载体引物 (35S 启动子序列引物， CACGTCTTCAAAGCAAGTGGA)与基因引物(基因下游引物， 引物序列见实施例1)PCR鉴定， 示意 图见图 1。 0047 拟南芥的转化过程 ： 0048 试剂配制 ： 0049 渗透培养基 (1L) ： 1/2xMurashige-Skoog ； 5 ( 质量比 ) 蔗糖 ； 0.5 克 MES ； 用 KOH 调至 pH5.7 ； 再加 ： 10ul 1mg/ml。

29、 的 6-BA(6- 苄氨基嘌呤 ) 母液 ； 200 微升 Silwet L-77。 0050 转化步骤 ： 0051 (1) 制备好已转化了相应质粒的农杆菌 (GV3101， 市场可购买 ) 菌液 10ml， 在转化 前一天晚上， 转入大瓶培养过夜， 第二天取出使用时农杆菌液 0.D600 当在 1.2 到 1.6 之间。 0052 (2) 室温 5000rpm 离心 15 分钟。 0053 (3) 弃上清， 将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里， 使 O.D600 在 0.8 左 右。 0054 (4) 将整个植株直接浸泡至农杆菌悬浮液 30s。 0055 (5) 避光培养过夜， 然。

30、后正常培养至结子， 收获种子作下一步筛选鉴定。 0056 实施例 3 ： 转基因拟南芥的筛选和验证 ： 0057 转化子的筛选 ： 0058 将春化过的拟南芥种子种于浇过饱和花宝二号 ( 商业购买 ) 营养液的人工土中， 并用保鲜膜罩上。两天后光照， 三天后揭膜。 0059 人工培养室条件 ： 相对湿度 80， 恒温 20-240C， 光照强度 80-200umol/M2/S， 光照 周期为 8h 黑暗、 16h 光照培养。一周左右， 喷除草剂 ( 草苷膦 ) 筛选阳性植株。 0060 PCR 鉴定 ： 0061 (1) 用于 PCR 的转化植株总 DNA 的提取 ： 说 明 书 CN 102。

31、618560 A 7 6/6 页 8 0062 A.70 ( 体积比 ) 乙醇擦洗叶片， 称取大约 100mg 0063 B.加入600ul抽提缓冲液(0.2M Tris-Cl， 0.25NaCl， 25mM EDTA， 0.5(质量比) SDS， pH 7.5)， 室温快速研磨。 0064 C.1.5ml Ependorff 管中涡旋混匀 5-10s。 0065 D.12000rpm， 25min， 室温。取上清， 加等体积异丙醇， -20 摄氏度沉淀过夜。 0066 E.12000rpm， 15min， 室温。加入 70 ( 体积比 ) 乙醇 200ul 泡洗 DNA 沉淀。 0067 F。

32、.12000rpm， 15min， 室温。去乙醇。倒置于纸巾上， 待乙醇挥发干净。 0068 G. 加无菌水 100ul 溶解粗提 DNA 沉淀。用分光光度计测定或电泳估测其浓度。 0069 H. 以总 DNA 为模板， 进行 PCR。 0070 (2)PCR 程序 ： 0071 PCR 反 应 混 合 液 的 配 比 同 质 粒 PCR 鉴 定， 依 据 植 物 表 达 载 体 中 35S 启 动 子 序 列 和 BnAOX1、 AtAOX1 基 因 下 游 引 物 5 -tcaatgatccaattggag-3 ， 5 -tcaatgatatccaatgggagc-3 ， 反应的时间和温度。

33、如下 ： 94 3min， 94 45s， 59 45s， 72 2min 30s， 30cycles， 72 5min。 0072 检测结果显示， 大多数转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带， 而阴性对照 则没有， 表明已经获得多株转基因拟南芥株系。 0073 实施例 4. ： 转基因拟南芥种子含油量及千粒重检测 0074 转基因纯合株系生长于 21-23温室中， 收获种子后测其含油量及千粒重的变化 ( 图 3)。结果显示， 转基因拟南芥种子含油量与野生型拟南芥相比有明显提高， 最高幅度可 达 20以上。而千粒重也有所增加， 增加幅度最高达 25。 0075 表 1 过量表达 BnAOX1。

34、、 AtAOX1 基因的拟南芥含油量及千粒重测定结果 0076 说 明 书 CN 102618560 A 8 1/3 页 9 SEQUENCE LISTING 中国农业科学院油料作物研究所 油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 及应用 油菜呼吸代谢相关基因 BnAOX1 及应用 2 PatentIn version 3.1 1 975 DNA 人工合成 1 atgatgatga gtcgctacgg agccaaggta atggtaacta ctggaccaag gctcttctct 60 tccagtgccg tgtctcccaa ccatcttttg aattctaggg ttccggcg。

35、ag agagttcagc 120 aagatgacat ttgagaaaaa gaagaaaacg gaggataacc aatgggagaa aggttcaagt 180 ggtggcaagg gtgatcaagg gaacaaaggg gagcaattaa tcgttagcta ttggggagtg 240 aagcctatga aaatcaccaa agatgatgga actgaatgga aatggagctg ctttcggcca 300 tgggagacgt ataaagcaga tctgacaata gatttgaaga agcatcatgt tccatcgact 360 tt。

36、accggaca aattagctta ctggacggtt aaatctctcc gatggcctac cgatttgttc 420 ttccagaggc ggtacggatg ccgagcgatg atgttggaaa cggtagcagc ggttccagga 480 atggtcggag gaatgttagt acactgcaaa tcgctgaggc ggtttgaaca aagcggcggt 540 tggatcaaag cactccttga agaagcagag aacgagagaa tgcacttgat gacattcatg 600 gaagtcgcaa aacccaattg 。

37、gtacgaacgt gccctcgtga tcgccgttca aggcgttttc 660 ttcaacgcat atttcctcgg atacataatc tcgcccaagt ttgctcaccg tatggttgga 720 taccttgagg aagaagcaat ccactcttac actgaattcc tcaaggaact tgataatggt 780 aacatcgaaa acgttcctgc accagccata gccattgatt actggaggct ccctgctgat 840 gcaacgcttc gtgatgttgt catggtggtt cgtgctgat。

38、g aagcacatca ccgtgacgtt 900 aaccattatg catccgatat tcattaccaa ggtcgtgaac ttaaggaagc tccagctcca 960 attggatatc attga 975 2 324 PRT 人工合成 2 序 列 表 CN 102618560 A 9 2/3 页 10 Met Met Met Ser Arg Tyr Gly Ala Lys Val Met Val Thr Thr Gly Pro 1 5 10 15 Arg Leu Phe Ser Ser Ser Ala Val Ser Pro Asn His Leu Leu As。

39、n Ser 20 25 30 Arg Val Pro Ala Arg Glu Phe Ser Lys Met Thr Phe Glu Lys Lys Lys 35 40 45 Lys Thr Glu Asp Asn Gln Trp Glu Lys Gly Ser Ser Gly Gly Lys Gly 50 55 60 Asp Gln Gly Asn Lys Gly Glu Gln Leu Ile Val Ser Tyr Trp Gly Val 65 70 75 80 Lys Pro Met Lys Ile Thr Lys Asp Asp Gly Thr Glu Trp Lys Trp Ser。

40、 85 90 95 Cys Phe Arg Pro Trp Glu Thr Tyr Lys Ala Asp Leu Thr Ile Asp Leu 100 105 110 Lys Lys His His Val Pro Ser Thr Leu Pro Asp Lys Leu Ala Tyr Trp 115 120 125 Thr Val Lys Ser Leu Arg Trp Pro Thr Asp Leu Phe Phe Gln Arg Arg 130 135 140 Tyr Gly Cys Arg Ala Met Met Leu Glu Thr Val Ala Ala Val Pro Gl。

41、y 145 150 155 160 Met Val Gly Gly Met Leu Val His Cys Lys Ser Leu Arg Arg Phe Glu 165 170 175 Gln Ser Gly Gly Trp Ile Lys Ala Leu Leu Glu Glu Ala Glu Asn Glu 180 185 190 Arg Met His Leu Met Thr Phe Met Glu Val Ala Lys Pro Asn Trp Tyr 195 200 205 Glu Arg Ala Leu Val Ile Ala Val Gln Gly Val Phe Phe As。

42、n Ala Tyr 210 215 220 Phe Leu Gly Tyr Ile Ile Ser Pro Lys Phe Ala His Arg Met Val Gly 225 230 235 240 Tyr Leu Glu Glu Glu Ala Ile His Ser Tyr Thr Glu Phe Leu Lys Glu 245 250 255 Leu Asp Asn Gly Asn Ile Glu Asn Val Pro Ala Pro Ala Ile Ala Ile 260 265 270 Asp Tyr Trp Arg Leu Pro Ala Asp Ala Thr Leu Ar。

43、g Asp Val Val Met 275 280 285 Val Val Arg Ala Asp Glu Ala His His Arg Asp Val Asn His Tyr Ala 290 295 300 Ser Asp Ile His Tyr Gln Gly Arg Glu Leu Lys Glu Ala Pro Ala Pro 序 列 表 CN 102618560 A 10 3/3 页 11 305 310 315 320 Ile Gly Tyr His 序 列 表 CN 102618560 A 11 1/1 页 12 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102618560 A 12 。