本发明涉及一种改进的制备式(I)和式(II)的青霉素和头孢菌 素的酶学方法 式中X为S或CH2，R为被任意取代的6元烃环，R1为氢原子、卤 原子、甲基、甲氧基、C1-C4链烯基或通过氧、硫或氮原子与有机基 结合的亚甲基。
US-A-3816253公开了一种制备青霉素或头孢菌素的方法， 该方法是在+5℃至+50℃的温度下，优选+20℃至+40℃下，在 水溶液中有活性微生物或酶的存在下将α-取代的α-氨基酸与7 -氨基头孢烷酸或7-氨基去乙酸基头孢烷酸的衍生物反应。已发 现按照之后的美国专利中所述的方法操作，由于平行的伴随反应生 成了难以从反应混合物中分离的副产物，因此所期望的最终产率大 为降低。
EP-A-0473008提供了一种生产式(I)或式(II)的青霉素及 头孢菌素的方法，其目的在于克服或至少减少上述缺点。在该方法 中，在固定化青霉素酰化酶的存在下将6-氨基青霉烷酸或7-氨 基头孢烷酸与式R-CH(NH2)COOH的α-取代的α-氨基酸或 其活性衍生物反应，反应在水介质中进行，温度为-5℃至+20℃， 优选约+4℃。
EP-A-0473008中清楚地描述了反应条件，其中还详细描述 了25个制备实施例，所需最终产物的产率很高(90％或更高)。
在这一方面应注意到，只有产率足够高(约90％)且最终产物易 于纯化该方法才能工业应用。
EP-A-0473008提到通常以α-取代的α-氨基酸或其活性 衍生物作为原料，具体提及的氨基酸只有D-苯基甘氨酸甲酯。
本申请人按照EP-A-0473008中给出的实施例中所述步骤 进行了许多精心的实验。但所得结果完全不尽人意。
在这一方面已证实，如果反应介质中所述氨基酸的摩尔比小于 4摩尔每摩尔所用的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸，所需最 终产物的产率则很低(小于约60％)，并且因此是工业上不能接受 的。
只有反应中D-苯基甘氨酸甲酯的量为4至6摩尔每摩尔所用 的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸的比例时才能获得工业上 可接受的高产率。
但在这种情况下不仅难以接受成本的增加(D-苯基甘氨酸甲 酯的价格很高)，而且还生成了难以或不可能从反应的所需最终青 霉素或头孢菌素中除去的副产物。
已尝试使用不同的D-苯基甘氨酸酯或不同氨基酸的酯。但这 些尝试都失败了。
使用各种活性氨基酸衍生物得到了同样消极的结果。
德国专利申请号2214444报道了头孢菌素(具体地说是头孢氨 苄)的酶法合成，该方法是在青霉素酰化酶的存在下将7-ADCA 与苯基甘氨酰胺反应。所得产率很低。
PCT/DK91/00188(WO92/01061)和PCT/DK92/00388 (WO93/12250)报道了通过酶法酰化作用制备β-内酰胺抗生素的 方法，根据该方法在固定化青霉素酰化酶的存在下将式(III)的酰 胺 与6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸进行反应。
这些方法是适用的。但发现可估测量的酰胺(III)被酶本身水 解，因此在所需的最终产物中增加了杂质的数量。还有少量最终产 物被同样的酶水解。
早在青霉素酰化酶(E.C.3.5.1.11)的最初应用时就已知，当 存在苯乙酸、苯氧基乙酸和/或其它抑制剂时该酶被抑制，在抑制 剂的存在下酶丧失活性并且催化趋于停止。这是酰化含有痕量苯乙 酸、苯氧基乙酸或其它抑制剂的β-内酰胺环时的一个问题。
寻求不表现这类抑制的酶时常常面临这一问题(参见D.D.Y. Ryu等人，Biotechnology and Bioengineering 1985，Vol.XXVII p.953-960；A.M.Blinkowsky等人，Enzyme Microbial Technol- ogy 1993，Vol.15，p.965-973)。从各种微生物来源(醋杆菌，黄 单孢菌)选择出酶(常见的有氨苄青霉素酰化酶或酰胺酶、头孢菌素 酰化酶或酰胺酶，头孢氨苄合成酶等)。但是，这些酶均不能商购， 也不能大规模制备，而这是工业应用所必需的。由于需要大量研究 投资来改进合成β-内酰胺抗生素的特异性催化剂，因此不赞成使 用这种方法。
另一种克服酶抑制作用的方法是在进行酶法酰化之前除去所说 的抑制剂，例如PCT/DK91/00188中所述的用有机溶剂进行提取。 准确地说，该方法的主要缺点就是有机溶剂的使用。引入β-内酰胺 环的酶法酰基化就是为了省去所述溶剂的使用从而获得对环境无害 的方法，因此这种方法到目前为止尚未给出令人满意的结果。
在专门研究青霉素酰化酶催化的反应的过程中，本申请人惊奇 地发现上述抑制作用是可以避免的，在即使有大量上述抑制剂存在 的情况下也能反应合成β-内酰胺抗生素。如下文所述，通过加入 一定量的起初未存在的或仅少量存在的抑制剂，在某些情况下甚至 可以利用对合成有益的酶抑制作用。
因此，本发明提供了一种改进的分别制备按前面所述的式(I) 和式(II)的青霉素和头孢菌素的酶学方法，其中，在-5℃至+35℃ 的温度下，在呈游离或固定化形式的青霉素酰化酶的存在下，将式 (IV)或(V)的6-氨基青霉烷酸或7-氨基头孢烷酸 其中X和R1具有上面所述的含义，与式(III)的酰胺或其盐反应 其中R具有上面所述的含义，R2和R3分别独立地为氢原子或者直 链或支链C1-C3烷基，摩尔比为1至6摩尔所述酰胺 (III)每摩尔酸(IV)或(V)，其特征在于向反应混合物中加入式(VI) 的酶抑制剂： 其中： R4为直链或支链C1-C5烷基、被取代或未被取代的芳环、卤素或质 子，Y可以不存在，或者如果存在则为O、S、CH2、苯基或卤素； R5为羧基、直链或支链C1-C4酯或-CONH2基团； R6为H、OH、OCHO或CH3；
抑制剂以0.0001至0.5的摩尔浓度存在。
具体地说，所述抑制剂(VI)以0.0005至0.2的摩尔浓度存在 并且选自苯乙酸、苯氧基乙酸和扁桃酸、以及这些酸的(直链或支链) C1-C5酰胺和酯。
本发明还涉及含有按本发明所述方法制备的青霉素或头孢菌 素、以及药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物。
一般用常规方法制备含青霉素或头孢菌素的药物组合物并以适 宜的药学形式给药。
参照式(I)和(II)，R可以为例如苯基、环己二烯基或者为未被 取代的或被羟基、卤素、烷基、烷氧基、羧基、硝基或氨基取代的环己 烯基。
R1可为氢原子、卤原子、甲基或者与有机基团相结合的亚甲 基，具体地说是与烷氧基或烷氧羰基或含有1至4个选自O、S和N的杂原子的5元或6元杂环基团相结合，杂环基团通过O、S或N原子与亚甲基结合并且可被选自羟基、卤素、烷基、烷氧基、羰基、羧 基、腈基、氨基等基团的一个或多个基团任意取代。
此处所用术语“烷基和烷氧基”是指含有1至6个碳原子，优选 1至4个碳原子的基团。
具有式(III)酰胺的α-氨基酸包括例如D-苯基甘氨酸、D- 对羟基苯基甘氨酸和D-1，4-环己二烯-1-基-甘氨酸。
适宜的酰胺的盐是其诸如氢氯酸、氢氟酸、氢溴酸、硫酸或硝酸 这样的无机酸的盐，或者是其诸如乙酸、甲酸或马来酸这样的有机 酸的盐。
下述酸特别适合于式(IV)和(V)的化合物：
6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基去乙酸基头孢烷酸(7- ADCA)、7-氨基头孢烷酸、7-氨基-3-氯头孢烷酸、7-氨基-3 -甲氧基头孢烷酸、7-氨基苯乙酰基去乙酸基头孢烷酸、7-氨基 苯氧基乙酰基去乙酸基头孢烷酸、7-氨基-3-氯碳头孢菌烷(7- amino-3-chlorocarbacephem)，青霉素G和青霉素V。
一般用青霉素G或V以及7-氨基苯乙酰基-去乙酸基头孢烷 酸分别作为制备6-APA和7-ADCA的原料，然后用后者制备氨 苄青霉素、羟氨苄青霉素、头孢氨苄和头孢羟氨苄。目前为止必需从 这些中间体(6-APA和7-ADCA)中除去苯乙酸或苯氧基乙酸以 便能将中间体用于酶的酰化反应，如PCT/DK91/00188所述。能在 抑制剂存在下合成这些化合物是指不需要纯化中间体便可有利地进 行合成，获得一种节省并避免使用有机溶剂的重要方法。
酶抑制剂可存在于合成开始时的反应混合物中，也可以在反应 期间任一时刻加入。通常也可以在酶反应结束时加入所述抑制剂以 便于产物分离和后继加工。
在现有方法中用作催化剂的酶是青霉素酰胺水解酶，其分类为 E.C.3.5.1.11(也被称为青霉素酰化酶、青霉素水解酶、氨苄青霉素 酰化酶等)，该酶是从任意微生物来源产生的，特别是从黄单胞菌、 假单胞菌、节杆菌、Kluyvera、醋杆菌、埃希氏菌、芽孢杆菌或单胞菌 菌杆产生的。特别优选从大肠埃希氏菌的天然或工程菌株产生的酶。 其中有些酶是可以大量并以固定化形式商购的。
该酶可以游离形式(即溶解)使用，或者可被固定在固体基质 上。对于后者来说，特别优选那些专门用于生物分子固定化的支持 物，如合成环氧脂或吖内酯树脂。
实施例1
通过7-ADCA与D(-)苯基甘氨酰胺的酶法酰化作用合成头 孢氨苄
将9g(42毫摩尔)7-氨基去乙酸基头孢烷酸和15.7g(100毫摩 尔)D(-)苯基甘氨酰胺溶于水中(终体积300ml)。将溶液冷却至 约4℃并调节至pH6.8，然后转入与控制系统(如下文所称的恒- pH-槽)相连的冷却反应器中，通过自动加入4N硫酸保持pH恒 定。
将5400IU固定化形式(在吖内酯或环氧树脂上)的青霉素酰胺 水解酶加入上述溶液中，在恒定的4℃及pH6.8温育。
约75分钟后从溶液中过滤分离出酶。将溶于稀苛性苏打溶液的 约4gβ-萘酚加入该溶液中。回收了16.6g以头孢氨苄/β-萘酚复 合物形式存在的产物，摩尔产率为初始环的74％。然后(按已知方 法)从β-萘酚复合物获得高品质的头孢氨苄一水合物。
实施例2
苯乙酸存在下合成头孢氨苄
将17g(0.077摩尔)含1.18％苯乙酸和1.63％7-氨基苯乙酰 基去乙酸基头孢烷酸杂质的不纯的7-氨基去乙酸基头孢烷酸、以 及42.68g(0.28摩尔)D(-)苯基甘氨酰胺溶于水中，至终体积为 600ml。
将恒-pH-槽调至pH7.6并将恒温槽调至2℃，用7560IU 固定化酶并按照实施例1中所述进行反应。5小时30分钟后中断反 应并滤去青霉素酰化酶。用6gβ-萘酚沉淀产物，所得摩尔产率为 87.5％。然后如实施例1所述获得了头孢氨苄一水合物。
实施例3
从7-氨基苯乙酰基去乙酸基头孢烷酸和D(-)苯基甘氨酰胺 合成头孢氨苄
将16g(0.048摩尔)7-氨基苯乙酰基去乙酸基头孢烷酸溶于水 中，并加入足量稀NaOH至pH8.0，然后将溶液加热至28℃并用 水稀释至终体积为320ml，然后转入与恒-pH-槽相连的适宜的 反应器中并浸于温度控制浴中。
特约14000IU固定化形式的青霉素酰化酶加入该溶液(溶液 A)，然后保持恒定pH(通过加入2N NaOH)和恒定温度。
另外制备浓度约为180g/l的D(-)苯基甘氨酰胺水溶液(溶液 B)。
反应约2小时后，将约190ml溶液B加入溶液A，如需要，调 整pH和温度。通过加入4N硫酸保持pH恒定。
7小时后真空过滤除去酶。通过沉淀头孢氨苄/β-萘酚复合物 从所得溶液中回收头孢氨苄，产量相当于摩尔产率为80.8％。按已 知步骤从头孢氨苄/β-萘酚复合物中回收质量满足市售的头孢氨苄 一水合物。
实施例4
在7-氨基-3-氯头孢烷酸的酶法酰化中抑制剂的用途
如实施例1中的方法进行反应，但用9.85g(0.042摩尔)7-氨 基-3-氯头孢烷酸。反应结束时加入1.5g溶于稀NaOH的苯乙 酸，然后如实施例1-3中所述针对头孢氨苄的方法沉淀头孢氯/β -萘酚复合物。
以7-氨基-3-氯头孢烷酸计的摩尔产率为70％。通过分解头 孢氯/β-萘酚复合物获得头孢氯一水合物(按已知方法)。
实施例5
抑制剂存在下6-氨基青霉烷酸的酶法酰化
用已知方法通过酶解从青霉素G获得6-氨基青霉烷酸(此后 称之为6-APA)，并通过酸沉淀从水溶液中得以分离。按此方法获 得的产物含有苯乙酸杂质。
将20.8g浓度为80％(0.0077摩尔)的潮湿的不纯的6-APA 溶于水中，并按实施例2中所述方法与D(-)苯基甘氨酰胺混合， 得到含有约0.7g/l苯乙酸的溶液。加入6670单位青霉素酰化酶， 并如实施例2中所述方法进行反应。获得82.4％的6-APA转化 率。
实施例6
苯乙酸存在下合成头孢氨苄过程中青霉素G酰化酶的水解抑 制作用
将13g(60.75毫摩尔)7-氨基去乙酸基头孢烷酸(7- ADCA)、46.5g(230.84毫摩尔)D-苯基甘氨酸甲酯.HCl和140mg (1.03毫摩尔)苯乙酸溶于水中至终体积为1000ml。
由17.5g(3000IU)青霉素G酰化酶进行酰化反应，条件是起 始pH为7.25且温度为3℃。约3小时后已有93％的7-ADCA转 化成头孢氨苄。
93％的7-ADCA转化成头孢氨苄后，合成的头孢氨苄产物与 水解形成的D-苯基甘氨酸的比率为2.15，而没有抑制剂时其比率 为1.44。