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1、(10)申请公布号 CN 102071252 A (43)申请公布日 2011.05.25 CN 102071252 A *CN102071252A* (21)申请号 201010578028.5 (22)申请日 2010.12.29 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/65(2006.01) (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大学南路 88 号 (72)发明人 包文斌 吴圣龙 朱国强 朱璟 叶兰 黄小国 黄雪根 曹永忠 孙寿永 潘章源 訾臣 刘璐 华金第 侯小亮 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 卢亚丽 (54) 发明名称。
2、 杀菌通透性增强蛋白基因作为猪大肠杆菌病 的抗性遗传标记的应用 (57) 摘要 本发明涉及筛选一种猪大肠杆菌病抗性 BPI 基因第10外显子HpaII 多态位点的遗传标记。 本 发明是用 BPI 基因外显子 10HpaII 酶切位点作为 猪肠毒素性大肠杆菌菌株抗性的分子标记及其检 测方法与应用， 检测该分子标记的方法包括待测 样品的猪基因组 DNA 的提取及其 PCR 扩增， PCR 产 物经限制性内切酶 HpaII 的酶切， 当待测猪个体 基因型为AA型(445bp)， 则为抗大肠杆菌病个体。 本发明为猪抗病育种工作的分子标记辅助选择提 供一个更加高效准确、 简便易行的分子遗传标记， 可有效。
3、地缓解实际生产中的仔猪腹泻和水肿病问 题， 提高经济效益， 加快育种进程。本发明的检测 方法操作简单， 费用较为低廉， 准确度高。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 1 页 附图 2 页 CN 102071256 A1/1 页 2 1. 杀菌通透性增强蛋白基因第 10 外显子作为猪大肠杆菌病的抗性遗传标记的应用。 2. 如权利要求 1 所述的应用， 其特征在于具体包括以下步骤 ： （1） 提取待测样本的组织 DNA， 备用 ； （2） PCR 扩增 ： 以步骤 （1） 的 DNA 为模板， 用下述引物。
4、进行 PCR 扩增， 上游引物为 ： 5-CCCAACATGGAGATGCAGTTC -3， 下游引物为 ： 5-CAATGAATCAATGAGCACACC -3 ； （3） PCR 扩增产物用限制性内切酶Hap 酶切后经聚丙烯酰胺凝胶电泳银染分析， 只出 现 445 bp 条带的样本为猪大肠杆菌病抗性。 权 利 要 求 书 CN 102071252 A CN 102071256 A1/5 页 3 杀菌通透性增强蛋白基因作为猪大肠杆菌病的抗性遗传标 记的应用 技术领域 0001 本发明属于猪遗传育种及分子标记辅助选择技术领域， 具体涉及猪大肠杆菌病抗 性遗传标记的筛选和应用。 背景技术 000。
5、2 随着我国规模化养猪业的迅猛发展， 猪病对规模化养猪生产的危害也日趋加重， 并成为当前我国养猪业健康发展的主要瓶颈。 疾病给养猪业造成的直接经济损失约占总产 值的 12% 15%。仔猪腹泻和水肿病是规模化猪场最常见的一类疾病， 对哺乳仔猪的危害 尤为严重。据有关资料的统计数字表明， 许多猪群仔猪腹泻性疾病发病率高达 50% 以上， 病 死率高达 15% 20% 左右， 由腹泻和水肿引起的仔猪死亡数占仔猪死亡总数 39.8%。 （何维 明等， 2001 ； 单玉平， 2005） 。产肠毒素性大肠杆菌 （ETEC） 是初生仔猪和断奶仔猪腹泻和水 肿病最常见和最重要的病原菌， 是养猪业中的重要威胁。
6、因素 （Boldin B， 2008） 。尽管当前 对仔猪腹泻和水肿病的一些预防性措施 （如提高管理水平、 改善卫生环境、 注射药物以及亚 单位疫苗接种等） ， 在一定程度上减少了该病的发生， 但并没有从根本上消除断奶仔猪腹泻 和水肿病的发生与流行， 从长远发展考虑， 寻求一种全新的预防与控制策略， 采用遗传学方 法， 培育出抗病新品种 （品系） ， 从遗传素质上永久性地提高仔猪对大肠杆菌病的抵抗能力， 是现代育种学家共同追求的目标。 0003 ETEC 定居在小肠上皮细胞的能力是由菌体表面的宿主特异性肠吸附菌毛介导的， 这种特异性菌毛通称定居因子抗原或黏附素， 确切地说， 黏附素存在于菌毛顶。
7、端。 ETEC中的 大肠杆菌 F18ab 和 F18ac 菌毛在猪体内、 外均可黏附小肠上皮细胞微绒毛和刷状缘， 产 F18 菌毛的大肠杆菌可利用 F18 菌毛介导的细菌在肠道内定居而大量繁殖， 产生肠毒素和志贺 氏样毒素， 从而出现腹泻、 水肿和神经症状。 F18大肠杆菌是目前在养猪业中发生最普遍、 危 害最大的大肠杆菌病原之一(Van den Broeck W, et al. 2000)。 鉴于ETEC F18是引起断 奶仔猪腹泻的主要病原菌之一， 而ETEC F18受体基因又是决定病原菌配体分子特异结合吸 附到宿主组织细胞上的功能基因， ETEC F18 受体基因的突变会引起其编码的菌毛。
8、受体蛋白 结构和功能的改变或丧失， 从而使病原菌和配体分子不能结合上去， 表现对病原菌的遗传 抗性。因此， 对 ETEC F18 受体基因等抗性相关基因的筛选及功能的深入研究将成为抗病育 种的重要基础储备。 0004 杀菌通透性增强蛋白 (bactericidal/permeability-increasing protein, BPI ) 是人和哺乳动物的内源性阳离子蛋白质， 主要存在于多形核白细胞 (Ploymorphneclear leukocytes, PMNs) 的嗜苯胺蓝颗粒中。BPI 除了能杀灭 G- 菌， 中和内毒素或脂多糖 (lipopolysaccharide, LPS) 。
9、的活性外， 还有调理功能、 促进补体活化， 增强吞噬的调理功 能、 抑制血管生成、 抑制炎性介质释放、 抗真菌和原虫等一系列生物学功能， 在动物机体天 然防御中起到了很重要的作用。 0005 国内外关于猪 BPI 基因的多态性及其对疾病的抗性 / 易感性相关的研究鲜见 说 明 书 CN 102071252 A CN 102071256 A2/5 页 4 报道， 在美国专利网中有一段关于猪 BPI 基因的序列， 长 1 452 bp， 没有清楚的注释， 现将其命名为专利 BPI 序列 （United States, Kind Code: A1, Patent Application: 20040。
10、234980） 。在此专利的公开信息中， Christopher 等在约克、 汉普夏、 杜洛克、 长白、 大 白、 野猪和眉山猪中， 检测到BPI基因外显子4和10分别存在Ava II和HpaII酶切多态性， 通过攻毒试验表明其基因型与猪沙门氏菌的易感性有关， 并把 BPI 基因确立为抗病育种候 选基因。 0006 肠毒素性大肠杆菌为猪肠道中主要的革兰氏阴性菌， 本发明利用课题组前期在苏 太猪群体中建立了 F18 大肠杆菌病抗性和敏感性资源家系群体以及大白猪作为试验材料， 利用 PCR-RFLP 技术分析 BPI 基因第 10 外显子 Hpa II 多态性， 通过仔猪小肠上皮细胞分别 与表达 。
11、F18ab 菌毛的野生型大肠杆菌、 表达 F18ac 菌毛含 fed 操纵子全基因的重组大肠杆 菌及表面分泌表达 F18ab 菌毛 FedF 亚单位的重组大肠杆菌进行体外黏附试验， 分析 BPI 基 因第 10 外显子Hpa II 多态性 F18 大肠杆菌感染间的关系， 探讨猪 BPI 基因对肠毒素性大 肠杆菌 F18(ECF18) 菌株的作用机理， 发现本发明 BPI 基因外显子 10Hpa II 酶切位点的遗 传标记与肠毒素性大肠杆菌菌株的抗性有关。 发明内容 0007 本发明是用 BPI 基因外显子 10Hpa II 酶切位点作为猪肠毒素性大肠杆菌菌株抗 性的分子标记及其检测方法与应用，。
12、 检测该分子标记的方法包括待测样品的猪基因组 DNA 的提取及其 PCR 扩增， PCR 产物经限制性内切酶 Hpa II 的酶切， 当待测猪个体基因型为 AA 型 (445 bp)， 则为抗大肠杆菌病个体。本发明为从遗传素质上永久性地提高仔猪对大肠杆 菌病的抵抗能力提供了有效的分子标记。 0008 本发明的优点 ： 1） 本发明为猪抗病育种工作的分子标记辅助选择提供一个更加高效准确、 简便易行 的分子遗传标记， 为提高仔猪对大肠杆菌病的抵抗能力提供了一种有效的分子标记育种手 段。用该遗传标记对猪的大肠杆菌抗性进行标记辅助选择， 可有效地缓解实际生产中的仔 猪腹泻和水肿病问题， 提高经济效益，。
13、 并为加速改善仔猪抗病能力的分子育种奠定了基础， 将加快育种进程。 0009 2） 本发明的检测方法操作简单， 费用较为低廉， 准确度高， 并可实现自动化的直接 检测， 本发明将在猪的育种中发挥巨大作用。 0010 所述的杀菌通透性增强蛋白 (BPI ) 基因作为猪大肠杆菌病的抗性遗传标记及应 用包括 ： 1. 猪基因组 DNA 的提取 2. 猪 BPI 基因第 10 外显子的引物设计和 PCR 扩增 3. PCR- RFLP 分析 4. 仔猪小肠上皮细胞的黏附试验确定个体大肠杆菌 F18 菌株抗性 / 易感性 ： 5. BPI基因第10外显子Hpa II多态性与F18大肠杆菌抗性间的关系分析。
14、， 确定抗性 遗传标记。 说 明 书 CN 102071252 A CN 102071256 A3/5 页 5 附图说明 0011 图 1 为 BPI 基因第 10 外显子 PCR 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。 0012 图 2 为 BPI 基因第 10 外显子酶切后 3 种基因型的聚丙烯酰胺凝胶电泳图， 其中 M 为 pUC19 DNA/Msp (Hap ) marker， 第 2、 6、 8、 11、 12 泳道为 AA 基因型 ； 第 4、 10 泳道为 BB 基因型， 第 1、 3、 5、 7、 10 泳道为 AB 基因型。 0013 图 3 为断奶仔猪小肠上皮细胞黏附能力的照片 A 。
15、： 标准菌株 107/86 ； B ： rE.coli1534 ； C ： pnirBMisL-fedF（照片均使用油镜镜头， 以 1000 倍放大比例拍摄 )。 0014 图 4 为断奶仔猪小肠上皮细胞黏附能力丧失的照片 A ： 标准菌株 107/86 ； B ： rE.coli1534 ； C ： pnirBMisL-fedF ( 照片均使用油镜镜头， 以 1000 倍放大比例拍摄 )。 具体实施方式 0015 本发明中所涉及的生物材料， 由申请人实验室构建和保存的， 均自申请日起向公 众提供 20 年。 0016 一、 利用 BPI 基因第 10 外显子Hap酶切位点标记对苏太猪和大白猪。
16、核心群全面 检测基因型。 0017 每个个体采耳组织块约 1.0 g， 放入 1.5 mL 的 Eppendoff 管内于冰盒中取回扬州 大学动物遗传育种与繁殖重点学科实验室备用。按常规酚 - 氯仿法提取 DNA。提取的 DNA 用核酸蛋白测定仪测定其含量和纯度， -20 保存备用。根据已公布的猪专利 BPI 基因序 列并参考人(Genebank登录号 ： NM_ 001725 )、 牛(Genebank登录号 ： NM_ 173895)BPI基因 序列的注释， 设计引物扩增BPI基因第10外显子， 上游引物为 ： 5-CCCAACATGGAGATGCAGTTC -3（SEQ ID NO.1）。
17、 ， 下游引物为 ： 5-CAATGAATCAATGAGCACACC -3（SEQ ID NO.2） ， PCR 产物大小为 445bp（图 1） 。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，Taq DNA polymerase、 dNTP 购自大连宝生物公司。 0018 PCR 反应体系为 ： 10PCR 缓冲液 2.5 L， 2.5 mmol/L dNTP 1.5 L， 10 mol/ L 引物 ( 上游 )1 L， 10 mol/L 引物 ( 下游 )1 L, Taq 酶 (5 U/L) 0.2 L， 100 ng/L DNA 模板 1 L， ddH2O 17.8 L， 总体积 25 。
18、L。PCR 扩增程序为 ： 94 预变性 4 min ； 94 变性 30 s， 57退火 30 s， 72 延伸 30 s， 32 个循环 ； 72 延伸 7 min ； 4 保存。 0019 酶切反应体系为 10 L， 包括 PCR 产物 3 L， 限制性内切酶Hap (5 U/ L) 0.2 L， 10buffer 1L， ddH2O 5.8 L， 置 37恒温反应 3 h 后， 经 10% 的聚丙烯酰胺 凝胶电泳银染分析， BPI基因第10外显子经限制性内切酶Hap消化后能被完全酶切， 产生 AA 型 (445 bp)， BB 型 (304bp /142bp)， AB 型 (445 b。
19、p/304 bp/142 bp) 3 种条带 （图 2） 。 0020 二、 仔猪小肠上皮细胞的黏附试验确定个体大肠杆菌 F18 菌株抗性 / 易感性。 0021 1) 仔猪小肠上皮细胞的制备 在仔猪断奶前后， 也是最易感染大肠杆菌F18菌株而表现出腹泻症状的35日龄阶段屠 宰取十二指肠、 空肠肠段 15cm 用于小肠上皮细胞的制备。将仔猪剖杀后， 各取十二指肠、 空 肠肠段 15cm 立即放入预冷的 PBR 溶液中， 每段肠管用 PBR 溶液轻柔冲洗三遍后， 再用 30ml 说 明 书 CN 102071252 A CN 102071256 A4/5 页 6 预冷 IPBR 冲洗一遍， 将肠。
20、道外翻后短暂地在 IPBR 溶液中清洗一下， 然后转移到盛有 200ml IPBR 溶液的烧杯中， 于室温下以 100r/min 的速度匀速搅拌 10min。弃肠段， 将烧杯中液体 转移至离心管， 在 0下， 200g， 离心 10min。沉淀重新悬浮在 PBR 溶液中轻轻洗涤一次， 再 次离心， 用预冷的 MEM 重新悬浮沉淀的细胞， 将细胞浓度调整到 106107个细胞 /mL。 0022 2) 细菌的准备 产 F18ab 菌毛标准菌株 107/86（O139:K12:H1） 由美国宾夕法尼亚大学兽医学院微生 物实验室惠赠。能诱导表达 F18ac 菌毛含 fed 操纵子全基因的重组大肠菌 。
21、rE.coli1534 由本实验室构建并保存 （吴圣龙， 原志伟， 鞠慧萍， 黄雪根， 华金弟， 沈家林， 周冠月， 王建业， 谢恺舟， 陈国宏， 朱国强 . 苏太仔猪 FUT1 基因 M307 位点多态性与大肠杆菌 F18 抗病相关 性的体外鉴定 . 中国预防兽医学报 , 2007, 29(10): 783787.） ， 能表面分泌表达 F18ab 菌毛 FedF 亚单位的重组大肠杆菌 pnirBMisL-fedF 也由本实验室构建 （吴圣龙， 原志伟， 鞠 慧萍， 黄雪根， 华金弟， 沈家林， 周冠月， 王建业， 谢恺舟， 陈国宏， 朱国强 . 苏太仔猪 FUT1 基 因 M307 位点多。
22、态性与大肠杆菌 F18 抗病相关性的体外鉴定 . 中国预防兽医学报 , 2007, 29(10): 783787.） 。 0023 将 107/86 标准株大肠杆菌的单个菌落分别接种到 35ml LB 培养基 ,37振荡培 养过夜 （1618h） ， 次日将细菌用 PBS 反复离心洗涤 3 次， 调整细菌浓度至约 1109CFU/ml。 0024 将重组菌 rE.coli1534 的单个菌落首先接种于含 100g/ml 氨苄青霉素的 35ml LB 培养基， 37振荡培养过夜， 次日取出 50l 再接种于 5ml 含 100g/ml 氨苄青霉素的 LB 培养基， 37振荡培养约 2h， 使细菌。
23、处于大约对数生长中期， OD600=0.5-0.7 时， 加入诱导剂 100mmol/L IPTG至终浓度为0.2mmol/L, 37继续培养3h后终止诱导, 然后将细菌用PBS 反复离心洗涤 3 次， 调整细菌浓度至约 1109CFU/ml。 0025 将重组菌 pnirBMisL-fedF 的单个菌落接种于含 100g/ml 氨苄青霉素的 5ml LB 培养基， 于 37首先在有氧的环境中振荡培养过夜， 再置于厌氧罐中诱导表达 6h， 然后将 细菌用 PBS 反复离心洗涤 3 次， 调整细菌浓度至约 1109CFU/ml。 0026 上述培养的野生型大肠杆菌及诱导表达后的重组菌与相应单克隆。
24、抗体或抗血清 作玻板凝集试验， 在确认凝集试验阳性， 而阴性对照不凝集后， 将上述细菌用于黏附试验。 0027 3） 仔猪小肠上皮细胞的黏附试验 分别取上述野生菌或诱导表达的重组菌菌液 0.5ml， 在其中添加终浓度为 1% 甘露糖于 37作用30min后和0.5ml小肠上皮细胞混合， 再于37孵育30min,1000r/min离心5min, 用 PBR 溶液悬浮后取 50l 滴于洁净玻片上， 自然干燥， 火焰固定， 用美兰染色 3-5min， 油镜 观察结果。 0028 4） 抗性型和敏感型的判定 断奶仔猪的小肠上皮细胞如均能与表达 F18ab 菌毛标准菌株 107/86、 诱导表达的重组 。
25、大肠杆菌 rE.coli1534 及诱导表达的重组大肠杆菌 pnirBMisL-fedF 发生黏附作用 （图 3） ， 将其定义为大肠杆菌 F18 菌株敏感型 ； 而如果仔猪小肠上皮细胞对上述 3 株大肠杆菌的黏 附能力几乎为零 （图 4） ， 则将其定义为抗性型。 0029 三、 BPI 基因第 10 外显子Hpa II多态性及其与 F18 大肠杆菌感染间的关系分析 及抗性标记的确定 对 BPI 基因第 10 外显子Hpa II 的 3 种基因型个体大肠杆菌 F18 菌株抗性 / 易感性进 说 明 书 CN 102071252 A CN 102071256 A5/5 页 7 行分析， 3 种。
26、基因型个体大肠杆菌 F18 菌株抗性 / 易感性的频率见表 1 ； 对抗性 / 易感性的 频率进行独立性2检验， 结果见表2， 由表2,3可见， AA基因型中大肠杆菌F18菌株抗性型 个体的频率为 90%， 显著或极显著地高于 AB 基因型 （57.1%） 和 BB 基因型 （17.4%） 的个体。 可以将 BPI 基因第 10 外显子Hpa II AA 基因型确定为抗大肠杆菌的分子遗传标记。 0030 表 1 BPI 基因第 10 外显子 Hpa II3 种基因型个体大肠杆菌 F18 菌株抗性 / 易感性的频率表 基因型 数量 抗性型个体数 （频率）敏感型个体数 （频率） AA109（0.9。
27、00）1（0.100） AB74（0.571）3（0.429） BB132（0.154）11（0.846） 表 2 BPI 基因第 10 外显子 Hpa II3 种基因型个体大肠杆菌 F18 菌株抗性 / 易感性 频率表 2 检验 基因型ABBB AA3.88*12.61* AB 3.78 注 (Note) ： 20.05（1） 3.84， 20.01（1） 6.63。 说 明 书 CN 102071252 A CN 102071256 A1/1 页 8 SEQUENCELISTING 扬州大学 杀菌通透性增强蛋白基因作为猪大肠杆菌病的抗性遗传标记的应用 2 PatentInversion3.3 1 21 DNA 人工序列 1 cccaacatggagatgcagttc 21 2 21 DNA 人工序列 2 caatgaatcaatgagcacacc 21 序 列 表 CN 102071252 A CN 102071256 A1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102071252 A CN 102071256 A2/2 页 10 图 4 说 明 书 附 图 CN 102071252 A 。