技术领域
本发明涉及一种鼠肝炎冠状病毒的GFP示踪系统及其应用，特别涉及一种在野生 型鼠肝炎冠状病毒A59株基因组中插入GFP后得到的重组鼠肝炎冠状病毒。
背景技术
冠状病毒是目前已知的基因组最大的单股正链RNA病毒，主要引起呼吸道和消 化道的疾病，是多种经济动物传染性疾病的病原体，常常导致巨大的社会经济损失。 自2003年一种新的SARS-CoV被确定为烈性传染病SARS的病原体以来，冠状病毒 （Coronavirus）便成为全球生命科学研究的热点之一。
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是来源于发光水母（aequorea victoria）的一种功能独特的蛋白质，分子量为27kD，由238个氨基酸组成。自1992 年Prasher等克隆到GFP的cDNA以来，GFP示踪技术已广泛应用于分子生物学研究 领域。结合GFP荧光示踪的技术手段，可分别在细胞和动物水平，对标记分子或物质 进行荧光示踪监测和定量检测。
目前尚未有对鼠肝炎冠状病毒进行GFP示踪的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种鼠肝炎冠状病毒的GFP示踪系统及其应用。所述鼠肝炎 冠状病毒的GFP示踪系统即为一种表达绿色荧光蛋白的重组鼠肝炎冠状病毒。
本发明所提供的重组鼠肝炎冠状病毒，是将野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA 进行替换或插入得到的重组病毒；
所述替换为：将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的片段a中的任一片 段（可由1个、2个或更多个核糖核苷酸组成）替换为片段b；
所述插入为：在所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA中的所述片段a中的任 一位点处插入所述片段b；
所述片段a为序列表中序列1编码的RNA；所述片段b为含有绿色荧光蛋白编码 基因的DNA片段编码的RNA。
所述绿色荧光蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
在本发明中，所述绿色荧光蛋白的编码基因的序列为序列表中序列3的第142-861 位。
进一步，所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段的核苷酸序列为序列表 中序列3。
在本发明的一个实施例中，所述野生型鼠肝炎冠状病毒具体为鼠肝炎冠状病毒 A59株。
在本发明的一个实施例中，所述重组鼠肝炎冠状病毒是将野生型鼠肝炎冠状病毒 基因组RNA进行替换得到的重组病毒；具体的，所述替换中，所述“片段a中的任一 片段”为所述片段a中的序列1的第468-765位核苷酸对应的RNA片段。
由于所述野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组RNA经反转录后得到的cDNA 序列为GenBank号为NC_001846.1的序列（Up date：2012-8-23），相应的，所述重组 鼠肝炎冠状病毒的基因组RNA经反转录后得到的cDNA序列为GenBank号为 NC_001846.1的序列（Up date：2012-8-23）的第27967-28264位（对应序列1的第468-765 位）替换为序列表中序列3，得到的核苷酸序列。
本发明的另一个目的是提供一种制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法。
本发明所提供的制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法具体可包括如下步骤：
（a）将所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列中 位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列分别克隆至质粒pSV2-gpt的 gpt基因的上游和下游，得到重组质粒甲；
所述待取代核苷酸序列或待插入位点位于序列1中；
（b）用含所述野生型鼠肝炎冠状病毒基因组RNA通过反转录得到的cDNA序列 的痘苗病毒载体甲感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒甲转染所述CV-1 细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒甲通过所述位于待取代核苷酸序列或待插 入位点上游和下游的序列发生同源重组，获得以所述gpt基因替代所述痘苗病毒载体 甲中的所述待取代核苷酸序列，或在所述痘苗病毒载体甲中的所述待插入位点处插入 所述gpt基因的重组痘苗病毒载体乙；
（c）将步骤（b）中的所述重组痘苗病毒载体乙中的所述gpt基因替换为所述含 有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段，得到重组质粒乙；
（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体乙感染新的CV-1细胞后，用步骤（c） 获得的重组质粒乙转染所述新的CV-1细胞，所述重组痘苗病毒载体乙与所述重组质 粒乙通过所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游的序列发生同源重组， 获得以所述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段替代所述重组痘苗病毒载体乙 中所述gpt基因的重组痘苗病毒载体丙；
（e）提取步骤（d）得到的重组痘苗病毒载体丙的基因组DNA，通过体外转录， 获得所述重组痘苗病毒载体丙的基因组的全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21 细胞，培养转染后的细胞，获得所述重组鼠肝炎冠状病毒。
在上述方法中，步骤（a）中所述位于待取代核苷酸序列或待插入位点上游和下游 的序列分别为GenBank号为NC_001846.1的序列（Up date：2012-8-23）的第 27500-27966位（对应序列1的第1-467位）和第28265-28700位（对应序列1的第 766-1201位）。
在本发明的一个实施例中，制备所述重组鼠肝炎冠状病毒的方法具体包括如下步 骤：
（a）将GenBank号为NC_001846.1的野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组 cDNA序列（Up date：2012-8-23）的第27500-27966位（对应序列1的第1-467位， 命名为上游同源臂）和第28265-28700位（对应序列1的第766-1201位，命名为下游 同源臂）分别克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游（如酶切位点Not I和Sal I之间） 和下游（如酶切位点Pst I和BamH I之间），得到重组质粒，将其命名为pGPT-IN-ORF4；
（b）用含鼠肝炎冠状病毒（MHV）A59株基因组cDNA的痘苗病毒载体vaccinia virus inf-1（v.v.-inf-1）感染CV-1细胞后，用步骤（a）获得的重组质粒pGPT-IN-ORF4 转染所述CV-1细胞，所述痘苗病毒载体甲与所述重组质粒pGPT-IN-ORF4通过所述 上游同源臂和所述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阳性筛选标记，获 得以所述gpt基因替代所述v.v.-inf-1中的位于GenBank号为NC_001846.1的野生型鼠 肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列（Up date：2012-8-23）的第27967-28264 位核苷酸序列的重组痘苗病毒载体，将其命名为V.V-inf-gpt-in；
（c）将步骤（a）中的所述重组质粒pGPT-IN-ORF4中的所述gpt基因替换为所 述含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片段（序列3），得到重组质粒，将其命名为 pGPT-OUT-GFP；
（d）用步骤（b）得到的重组痘苗病毒载体乙V.V-inf-gpt-in感染新的CV-1细胞 后，用步骤（c）获得的重组质粒pGPT-OUT-GFP转染所述新的CV-1细胞，所述重组 痘苗病毒载体V.V-inf-gpt-in与所述重组质粒pGPT-OUT-GFP通过所述上游同源臂和所 述下游同源臂发生同源重组，以所述gpt基因作为阴性筛选标记，获得以所述含有绿 色荧光蛋白的编码基因的DNA片段（序列3）替代所述重组痘苗病毒载体V.V-inf-gpt-in 中所述gpt基因的重组豆苗病毒载体，将其命名为V.V.-inf-GFP-GPT-OUT；
（e）提取步骤（d）得到的重组痘苗病毒载体V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的基因组 DNA，通过体外转录，获得所述重组痘苗病毒载体V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的基因组的 全长RNA；将所述全长RNA转染BHK-21细胞，培养转染后的细胞，获得所述重组 鼠肝炎冠状病毒（MHV-GFP）。
在上述方法的步骤（e）中，所述培养转染后的细胞，具体为将所述转染后的细胞 （BHK-21）与17CL-1细胞按照1：4的比例混合培养。之后，待细胞出现病变后，收 集细胞培养物，感染新的17CL-1细胞，进而获得所述重组鼠肝炎冠状病毒 （MHV-GFP）。
所述重组鼠肝炎冠状病毒在如下（a1）或（a2）中的应用也属于本发明的保护范 围：
（a1）制备研究鼠肝炎冠状病毒感染机制的产品；
（a2）制备筛选抗鼠肝炎冠状病毒药物的细胞模型。
本发明的又一个目的是提供如下（b1）或（b2）的生物材料：
（b1）含有所述重组鼠肝炎冠状病毒的离体动物细胞或重组菌；
（b2）含有所述重组鼠肝炎冠状病毒的基因组RNA或cDNA的载体。
在本发明的一个实施例中，所述动物细胞具体为BHK-21细胞。
本发明选择绿色荧光蛋白（GFP）作为示踪蛋白具有以下优点：
1、对细胞既无毒性，也无种属、组织和位置特异性；
2、不需要任何反应底物及其他辅助因子，只需要激发光源的激发即可发光；
3、荧光品质稳定，能够克服穿透、毒素、光漂白，高温等不利因素。
本发明选择基于痘苗病毒为载体的冠状病毒反向遗传学系统，与其他反向遗传学 系统相比，痘苗病毒载体具有其他载体所没有的优势。
首先，痘苗病毒载体的载容量比较大，可容纳至少26Kb外源序列。
其次，插入片段在痘苗病毒中比较稳定，随着重组痘苗病毒的增殖，可以获得高 拷贝的外源基因。
第三，痘苗病毒载体可介导高频率的同源重组，便于对基因进行修饰改造。
实验证明，对本发明建立的MHV绿色荧光示踪系统——重组鼠肝炎冠状病毒 （MHV-GFP）感染小鼠肝脏后进行病毒滴度的测定以及肝损伤的分析（谷丙转氨酶氨 酶（ALT）的测定和肝脏病理切片的观察）结果显示，MHV-WT和MHV-GFP病毒感 染小鼠后复制能力和致病力均无显著差异，说明重组病毒MHV-GFP可与野生型病毒 平行应用于MHV的相关研究。另外，本发明所提供的重组病毒MHV-GFP由于绿色 荧光蛋白的信号放大效应，可以极大的提高病毒监测的灵敏度，能够对病毒在小鼠脏 器中的存在与否和病毒的增值情况进行直观初步的观测，设备要求简单。因此，利用 动物模型开展MHV的感染和抗病毒治疗研究时，MHV示踪系统可以对传统的病毒学 研究方法起到很好的辅助和补充作用，不仅极大地扩展了经典模型系统在细胞水平和 动物水平的应用，同时，也为建立新型低剂量病毒亚临床感染动物模型提供了一个新 思路。再则，本发明为抗冠状病毒药物的筛选等应用研究也提供新的技术平台。
附图说明
图1为重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的PCR鉴定结果。其中，泳道M1为DNA分 子量标准Marker15000；泳道M2为DNA分子量标准Marker2000；泳道1和4为用 引物对PSC 40/PSC 55进行扩增的结果；泳道2和5为用引物对GPT L-F/PSC 55进 行扩增的结果；泳道3和6为用引物对GPTR-F/PSC 55进行扩增的结果。
图2为重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的PCR鉴定结果。其中，泳道M1 为DNA分子量标准Marker2000；泳道M2为DNA分子量标准Marker15000；泳道1 和5为用引物对GPT L-F/PSC54进行扩增的结果；泳道2和6为用引物对GPT R-F/PSC 54进行扩增的结果；泳道3和7为用引物对GFP UP L/PSC 54进行扩增的结果；泳道 4和8为用引物对GFP UP R/PSC 54进行扩增的结果。
图3为重组病毒MHV-GFP测序鉴定结果示意图。
图4为重组病毒MHV-GFP的一步生长曲线。其中，WT表示野生型MHV A59 株；GFP表示重组病毒MHV-GFP。
图5为重组病毒MHV-GFP感染细胞后的绿色荧光图。
图6为腹腔感染病毒后小鼠体重变化情况，剂量为3×106PFU/只。
图7为各组小鼠血清ALT浓度测定结果，剂量为3×106PFU/只。其中，WT表示 野生型MHV A59株；GFP表示重组病毒MHV-GFP。
图8为各组小鼠肝脏病毒滴度测定结果，剂量为3×105PFU/只。其中，*表示未检 测到病毒；WT表示野生型MHV A59株；GFP表示重组病毒MHV-GFP。
图9为各组小鼠肝脏病理切片（200×），剂量为3×105PFU/只，感染时间为5天。 其中，A为PBS组小鼠；B为MHV-WT感染小鼠；C为MHV–GFP感染小鼠。
图10为重组病毒MHV-GFP感染小鼠肝脏的绿色荧光图，剂量为3×105PFU/只。 其中，A为PBS组小鼠肝脏；B为MHV-GFP感染小鼠11h肝脏荧光；C为MHV-GFP 感染小鼠16h肝脏荧光；D为MHV-GFP感染小鼠24h肝脏荧光。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
毒株、细胞与小鼠：
含鼠肝炎冠状病毒（mouse hepatitis virus，MHV）A59株基因组全长cDNA的痘 苗病毒载体（vaccinia virus inf-1，简称v.v.-inf-1）由英国布里斯托大学Stuart G.Siddell 教授惠赠，记载在“林磊，吴晓燕，常国辉，祝庆余.鼠肝炎冠状病毒非结构蛋白1 内保守序列LLRKxGxKG的功能研究.解放军医学杂志.2010，35（5）：508-512.”一 文中，公众可从中国人民解放军疾病预防控制所获得。
质粒pSV2-gpt（购自ATCC公司，产品目录号：37145TM）、质粒phMGFP（购自 Promega公司，产品目录号：E6421）、CV-1细胞（购自ATCC，产品目录号：CCL-70） 和BHK-21细胞（购自ATCC公司，产品目录号：CCL-10）；17Clone-1（17CL-1）细 胞（参见文献：Sturman,L.S.,and K.K.Takemoto.1972.Enhanced growth of a murine coronavirus in transformed mouse cells.Infect.Immun.6:501–507.）、D980R细胞（参见文献： Kerr,S.M.,and G.L.Smith.1991.Vaccinia virus DNA ligase is nonessential for virus replication:recovery of plasmids from virus-infected cells.Virology，180:625–632.）。
15-18g，6-8周龄的雌性Balb/c小鼠购自维通利华实验动物技术有限公司。
主要试剂和材料：
DMEM培养基，胎牛血清，Platinum Pfx DNA Polymerase，Suoerscript III反转录 酶，脂质体（Lipofectamine 2000）转染试剂等均购自Invitrogen公司；RiboMAX Large Scale RNA Production System T7，Ribo m7G Cap Analog购自Promega公司； Mycophenolic acid（MPA），Hypoxanthine，Xanthine，6-Thioguanine(6-TG)，Gelrite Gellan Gum等均购自sigma公司；Doxycycline hyclate购自BioChemika；Eag Ⅰ限制性内切酶 购自NEB公司；RNeasy Mini Kit购自QIAGEN。
实施例1、GFP标记的重组鼠肝炎冠状病毒的构建
一、同源重组质粒的构建
1、重组质粒pGPT-IN-ORF4的构建及鉴定
将野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列（GenBank号:NC_001846.1， Up date：2012-8-23）的第27500-27966位（对应序列1的第1-467位，命名为上游同 源臂）和第28265-28700位（对应序列1的第766-1201位，命名为下游同源臂）分别 克隆至质粒pSV2-gpt的gpt基因的上游和下游，得到重组质粒pGPT-IN-ORF4。具体 操作如下：
（1）痘苗病毒载体vaccinia virus inf-1基因组DNA的提取
由于痘苗病毒载体vaccinia virus inf-1（简称v.v.-inf-1）含野生型鼠肝炎冠状病毒 （mouse hepatitis virus，MHV）A59株基因组全长cDNA，所以提取其基因组DNA作 为模板，用于扩增所述上游同源臂和所述下游同源臂。具体操作如下：
将痘苗病毒载体vaccinia virus inf-1用DMEM完全培养基进行适当的稀释后，加 入到培养至单层的BHK-21细胞中（MOI=1），于37℃培养，每日观察细胞病变。待 细胞病变达到+++（约3d）时，用细胞刮刮取病变细胞，2000rpm离心8min后，取细 胞沉淀，用于提取痘苗病毒DNA或-70℃冻存备用。
病毒DNA提取步骤如下：
1）取细胞沉淀，加入一定体积的Buffer A（10mM Tris-Cl pH9.0，1mM EDTA） 充分悬浮，冻融3次，并超声波处理3分钟，充分裂解细胞释放病毒。
2）加1/10体积0.5%（0.5g/100ml）的胰蛋白酶，37℃水浴，消化20min。
3）将上述反应液加入到含有蔗糖垫（用1mM的pH9.0的Tris配制）的超速离心 管中，16000rpm，4℃，90min离心。弃上清，用400μl Buffer A重悬沉淀，储存于4 ℃冰箱。
4）加适量RNase-free DNase（具体用量参照产品说明书）到病毒重悬液，37℃， 20min，以消化病毒外的细胞DNA。然后加入终浓度10mM的EDTA，65℃，10min 终止消化。
5）向上述反应液中加入1倍体积的2×Proteinase K Digestion Buffer和适量 Proteinase K（终浓度50μg/ml），50℃温育2h。
6）加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（25:24:1），轻轻颠倒混合均匀，13,000rpm 离心5min。将上层水相转入新管（注意不要吸到中间蛋白质层）。
7）向新管中加1倍体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1），轻轻颠倒混合均匀， 14,000rpm离心5min。将上层水相转入新管。
8）加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心15min。
9）弃掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片层，14,000rpm离心10min。用移液 器完全移除液体，加40-100μl无RNase水溶解DNA。
10）提取完成后，于260nm处测定其OD值，以判断DNA浓度和纯度，并-70℃ 冻存备用。
（2）引物的设计与合成
根据野生型鼠肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列（GenBank：NC_001846.1， Up date：2012-8-23）设计并合成如下两个引物对：
扩增上游同源臂的引物对：
L-up：5’-GCGGCCGCCTTCAATACCTAATCCACCCGAC-3’（下划线部分为酶切 位点Not I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_001846.1的第27500-27522位， 即序列1的第1-23位）
L-down：5’-GTCGACGGTAGCAATGAGAATGCTATAAATTG-3’（下划线部分为 酶切位点Sal I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_001846.1的第27941-27966 位的反向互补序列，即序列1的第442-467位的反向互补序列）
扩增下游同源臂的引物对：
R-up：5’-CTGCAGAGAGGTTTTGATTATAGTAC-3’（下划线部分为酶切位点Pst I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_001846.1的第28265-28284位，序列1的 第766-785位）
R-down：5’-GGATCCTCGAGCTGCGTGGCCCTAAAAAG-3’（下划线部分为酶 切位点BamH I的识别序列，其后的序列为GenBank：NC_001846.1的第28678-28700 位的反向互补序列，序列1的第1179-1201位的反向互补序列）
（3）重组质粒pGPT-IN-ORF4的构建及鉴定
以步骤（1）获得的痘苗病毒载体vaccinia virus inf-1基因组DNA为模板，以步骤 （2）设计合成的两个引物对分别进行PCR扩增，得到带有相应酶切位点的上游同源 臂和下游同源臂。首先用限制性内切酶Not I和Sal I双酶切所述上游同源臂，将其与 经过同样双酶切的pSV2-gpt质粒大片段相连，获得中间质粒；接着用限制性内切酶 Pst I和BamH I双酶切所述下游同源臂，将其与经过同样双酶切的所述中间质粒大片 段相连，获得重组质粒，经测序鉴定在pSV2-gpt质粒的酶切位点Not I和Sal I之间插 入了GenBank号为NC_001846.1（Up date：2012-8-23）的序列的第27500-27966位 核苷酸，同时在酶切位点Pst I和BamH I之间插入了GenBank号为NC_001846.1（Up date：2012-8-23）的序列的第28265-28700位核苷酸的重组质粒为阳性，将其命名为 pGPT-IN-ORF4。
2、重组质粒pGPT-OUT-GFP的构建及鉴定
（1）GFP基因片段的获得
从质粒phMGFP中获得本发明所需的绿色荧光蛋白的编码基因，并在其两端添加 上构建重组质粒所需的酶切位点。具体操作如下：
利用GFP特异引物GFP up和GFP down从质粒phMGFP中获得带有相应酶切位 点的GFP基因片段。
GFP up:5’-GTCGACATGGACTACCAAGACGATGACG-3’（下划线部分为酶切位 点Sal I的识别序列，整个序列为序列3的第1-28位的序列）
GFP down:5’-CTGCAGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCC-3’（下划线部分为 酶切位点Pst I的识别序列，整个序列为序列3的第843-873位反向互补序列）
PCR扩增产物的序列为序列表中的序列3。
（2）重组质粒pGPT-OUT-GFP的构建及鉴定
用限制性内切酶Sal I和Pst I双酶切步骤（1）获得的GFP基因片段，与将其与经 过同样双酶切的步骤1构建的重组质粒pGPT-IN-ORF4的载体大片段相连，获得重组 质粒，经测序鉴定将重组质粒pGPT-IN-ORF4的酶切位点Sal I和Pst I之间的gpt基因 取代为序列表中序列3的第7-867位核苷酸的重组质粒为阳性，将其命名为 pGPT-OUT-GFP。序列表中序列3的第142-861位为绿色荧光蛋白的编码基因。
二、重组痘苗病毒的构建
1、重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的构建及鉴定
利用冠状病毒的痘苗病毒载体反向遗传学系统，通过感染-转染CV-1细胞，使痘 苗病毒载体vaccinia virus inf-1与重组质粒pGPT-IN-ORF4通过上游同源臂和下游同源 臂发生同源重组，以E.Coli gpt基因作为阳性筛选标记，利用蚀斑纯化，获得以所述 gpt基因替代所述vaccinia virus inf-1中的位于GenBank号为NC_001846.1的野生型鼠 肝炎冠状病毒A59株的基因组cDNA序列（Up date：2012-8-23）的第27968-28264 位核苷酸序列的重组痘苗病毒载体V.V-inf-gpt-in。具体操作如下：
（1）GPT-IN同源重组细胞培养物的获得
将CV-1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，继续培养至80-90%， 感染痘苗病毒载体vaccinia virus inf-1（MOI=1），37℃吸附1h，然后吸除病毒液，获 得感染后的CV-1细胞；按照脂质体2000转染试剂的说明书，将步骤一获得的重组质 粒pGPT-IN-ORF4转染所述感染后的CV-1细胞，继续培养2-3d，直至细胞病变完全， 反复冻融后收集细胞培养物，得到GPT-IN同源重组细胞培养物，于-70℃保存备用。
（2）GPT阳性筛选
GPT阳性的DMEM培养基（pH7.0）：由霉酚酸、次黄嘌呤、黄嘌呤和DMEM培 养基组成；所述霉酚酸在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为25μg/ml，所述次 黄嘌呤在GPT阳性的DMEM培养基中的终浓度为15μg/ml，所述黄嘌呤在GPT阳性 的DMEM培养基中的终浓度为250μg/ml。
2×MEM培养基（pH7.0）：将100ml10×MEM、10ml100×MEM非必需氨基酸和 100ml胎牛血清混合后，用水定容至500ml。
将CV-1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37℃5%CO2的 条件下培养，至80%汇合度时，换成GPT阳性的DMEM培养基继续培养24h。
取上述步骤（1）获得的GPT-IN同源重组细胞培养物，反复冻融3次后，用GPT 阳性的DMEM培养基稀释10倍，感染上述在GPT阳性的DMEM培养基中培养的CV-1 细胞（MOI=1），37℃吸附1h。其间，将0.25%Gelrite（固化剂，质量百分含量）和 2×MEM培养基预热至56℃，且在2×MEM培养基中加入GPT阳性筛选药物（霉酚酸、 次黄嘌呤和黄嘌呤，所述霉酚酸在2×MEM培养基中的终浓度为25μg/ml，所述次黄 嘌呤在2×MEM培养基中的终浓度为15μg/ml，所述黄嘌呤在2×MEM培养基中的终浓 度为250μg/ml）。待病毒吸附完成后，吸除病毒液，将适量0.25%Gelrite和加入了GPT 阳性筛选药物的2×MEM培养基等体积混匀，按3ml/孔加入各孔；室温防治3-5min， 待其凝固后，置于37℃继续培养，直至观察到明显的细胞病变，挑取单个蚀斑，获得 已纯化的重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in，于-70℃保存备用。
（3）重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的鉴定
A.引物设计
根据鼠肝炎冠状病毒A59株（Mouse Hepatitis Virus strain A59）的mRNA序列 （GenBank：NC_001846.1）及GPT基因序列设计鉴定引物如表1。引物由Invitrogen 公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，-20℃保存备用。
表1重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in PCR鉴定所用引物
引物名称 引物序列(5’-3’) 位置 GPT L-F(上游引物） TTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTG 位于pSV2-gpt载体中gpt基因内部靠左侧 GPT R（上游引物） GTATATAGATGTCGAGTTGGGCTGC 位于pSV2-gpt载体中gpt基因内部靠右侧 PSC40(上游引物) GAGCGCGACGACGCTCGATGGTAC GenBank：NC_001846.1的第28183-28206位 PSC55(下游引物) ACATTTCTTTCGAGCTGCGTGGCC GenBank：NC_001846.1的第28686-28709位
B.重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的PCR检测
为了鉴定MHV A59基因组内相应序列（序列1）与gpt基因的重组情况，以已纯 化的相应重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的DNA为模板，以引物对PSC40/PSC55、GPT L-F/PSC55、GPT R-F/PSC55分别进行PCR反应。同时设置以痘苗病毒v.v.-inf-1的DNA 为模板的对照。
反应体系配置如下：
补水至50μl。
PCR反应条件如下：94℃预变性2min；94℃15s、56℃30s、68℃2min，反应 30个循环；68℃7min。
将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
结果如图1所示，以引物对PSC40/PSC55进行PCR扩增，作为对照的痘苗病毒 v.v.-inf-1扩增出相应的目的条带（图1中泳道1），而待鉴定的重组痘苗病毒 V.V-inf-gpt-in无目的条带（图1中泳道4）。以引物对GPT L-F/PSC55、GPT R-F/PSC55 进行PCR扩增，待鉴定的重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in均扩增出相应的目的条带（图1 中泳道5和6），而作为对照的痘苗病毒v.v.-inf-1均无目的条带（图1中泳道2和3）。 以上结果说明步骤（2）得到的重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in构建成功。
2、重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的构建及鉴定
再次通过感染-转染CV-1细胞，使重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in与重组质粒 pGPT-OUT-GFP通过上游同源臂和下游同源臂发生同源重组，以E.Coli gpt基因作为 阴性筛选标记，利用蚀斑纯化，最终获得以含有绿色荧光蛋白的编码基因的DNA片 段（序列3）替代重组痘苗病毒载体V.V-inf-gpt-in中所述gpt基因的重组豆苗病毒载 体V.V.-inf-GFP-GPT-OUT。并通过序列测定，验证GFP基因是否准确导入MHV基因 组相应位点。具体操作如下：
（1）GPT-OUT同源重组细胞培养物的获得
将CV-1细胞按照1：2的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，继续培养至80-90% 汇合度，感染步骤1制备的重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in（MOI=1），37℃吸附1h，然 后吸除病毒液，获得感染后的CV-1细胞；按照脂质体2000转染试剂的说明书，将步 骤一获得的重组质粒pGPT-OUT-GFP转染所述感染后的CV-1细胞，继续培养2-3d， 直至细胞病变完全，反复冻融后收集细胞培养物，得到GPT-OUT同源重组细胞培养 物，于-70℃保存备用。
（2）GPT阴性筛选
GPT阴性的DMEM培养基（pH7.0）：由6-硫鸟嘌呤和DMEM培养基组成；所述 6-硫鸟嘌呤在GPT阴性的DMEM培养基中的终浓度为0.5μg/ml。
将D980R细胞按照1：6的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内，于37℃5%CO2的条件下培养，至60-70%汇合度时，换成GPT阴性的DMEM培养基继续培养6h。
取上述步骤（1）获得的GPT-OUT同源重组细胞培养物，反复冻融3次后，用 GPT阴性的DMEM培养基稀释10倍，感染上述在GPT阴性的DMEM培养基中培养 的D980R细胞（MOI=1），37℃吸附1h。待吸附完成后，吸除病毒液，每孔补加GPT 阴性DMEM培养基3ml，置于37℃继续培养，直至观察到明显的细胞病变，挑取单 个蚀斑，获得已纯化的重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT，于-70℃保存备用。
（3）重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的鉴定
A.引物设计
根据鼠肝炎冠状病毒A59株（Mouse Hepatitis Virus strain A59）的mRNA序列 （GenBank：NC_001846.1）、GFP及GPT基因序列设计鉴定引物如表2。引物由 Invitrogen公司合成，用无核酸酶水配制成浓度为10μM的工作液，-20℃保存备用。
表2重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT PCR鉴定所用引物
引物名称 引物序列(5’-3’) 位置 GPT L-F(上游引物） TTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTG 位于pSV2-gpt载体中gpt基因内部靠左侧 GPT R-F(上游引物） GTATATAGATGTCGAGTTGGGCTGC 位于pSV2-gpt载体中gpt基因内部靠右侧 PSC40(上游引物) GAGCGCGACGACGCTCGATGGTAC GenBank：NC_001846.1的第28183-28206位 PSC54(下游引物) CTCGTGTAACCGAACTGTAGTATG GenBank：NC_001846.1的第29084-29107位 GFP UP L(上游引物) CAGTGCTTCAGCCGCTACCC 序列3的第208-227位
GFP UP R(上游引物） CAAGCAGAAGAACGGCATCA 序列3的第468-487位
B.重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的PCR检测
为了鉴定MHV基因组内相应序列（序列1）与GFP基因的重组情况，以纯化的 相应重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的DNA为模板，以引物对PSC40/PSC54、 GPT L-F/PSC54、GPT R-F/PSC54、GFP UP L/PSC54、GFP UP R/PSC54分别进行PCR 反应。同时设置以重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in的DNA为模板的对照。
反应体系配置如下：
补水至50μl。
PCR反应条件如下：94℃预变性2min；94℃15s、56℃30s、68℃2min反应30 个循环；68℃7min。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果。
结果显示，无论是作为对照的重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in，还是待鉴定的重组痘 苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT，以引物对PSC40/PSC54进行PCR均未扩增出相应条 带。以引物对GPT L-F/PSC54、GPT R-F/PSC54进行PCR扩增，作为对照的重组痘苗 病毒V.V-inf-gpt-in均扩增出相应的目的条带（图2中泳道1和2），而待鉴定的重组痘 苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT无目的条带（图2中泳道5和6）。以引物对GFP UP L/PSC54、GFP UP R/PSC54进行PCR扩增，待鉴定的重组痘苗病毒 V.V.-inf-GFP-GPT-OUT均扩增出相应的目的条带（图2中泳道7和8），而作为对照的 重组痘苗病毒V.V-inf-gpt-in无目的条带（图2中泳道3和4）。以上结果说明步骤（2） 得到的重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT构建成功。
三、GFP标记的重组鼠肝炎冠状病毒的构建及鉴定
提取步骤二中纯化并鉴定正确的V.V.-inf-GFP-GPT-OUT重组痘苗病毒的DNA， 进行体外转录，获得V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的RNA，通过脂质体（Lipofectamine2000） 转染BHK-21细胞，培养转染后细胞，收获MHV-GFP重组病毒。用获得的单斑病毒 培养液感染17Cl-1细胞，收取培养上清，得到MHV-GFP的第一代病毒液。对收取的 病毒液进行测序分析，比较MHV A59株野生型病毒的基因序列，再次对同源重组进 行确认分析。具体操作如下：
1、重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT基因组DNA的提取
将重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT用DMEM完全培养基进行适当的稀释后， 加入到培养至单层的BHK-21细胞中（MOI=1），于37℃培养，每日观察细胞病变。 待细胞病变达到+++（约3d）时，用细胞刮刮取病变细胞，2000rpm离心8min后，取 细胞沉淀，用于提取痘苗病毒DNA或-70℃冻存备用。
病毒DNA提取步骤如下：
1）取细胞沉淀，加入一定体积的Buffer A（10mM Tris-Cl pH9.0，1mM EDTA） 充分悬浮，冻融3次，并超声波处理3分钟，充分裂解细胞释放病毒。
2）加1/10体积0.5%（0.5g/100ml）的胰蛋白酶，37℃水浴，消化20min。
3）将上述反应液加入到含有蔗糖垫（用1mM的pH9.0的Tris配制）的超速离心 管中，16000rpm，4℃，90min离心。弃上清，用400μl Buffer A重悬沉淀，储存于4 ℃冰箱。
4）加适量RNase-free DNase（具体用量参照产品说明书）到病毒重悬液，37℃， 20min，以消化病毒外的细胞DNA。然后加入终浓度10mM的EDTA，65℃，10min 终止消化。
5）向上述反应液中加入1倍体积的2×Proteinase K Digestion Buffer和适量 Proteinase K（终浓度50μg/ml），50℃温育2h。
6）加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇混合液（25:24:1），轻轻颠倒混合均匀，13,000rpm 离心5min。将上层水相转入新管（注意不要吸到中间蛋白质层）。
7）向新管中加1倍体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1），轻轻颠倒混合均匀， 14,000rpm离心5min。将上层水相转入新管。
8）加2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，轻轻颠倒混合均匀，14,000rpm离心15min。
9）弃掉上清，加0.5ml70%乙醇漂洗DNA片层，14,000rpm离心10min。用移液 器完全移除液体，加40-100μl无RNase水溶解DNA。
10）提取完成后，于260nm处测定其OD值，以判断DNA浓度和纯度，并-70℃ 冻存备用。
DNA纯度=A260/A280=2.0，浓度达2000ng/μl。
2、体外转录
取上述步骤1提取的重组痘苗病毒V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的基因组DNA（约 10μg），加入50μl10×NEB Buffer 3和100U Eag I内切酶，加水补足体积至500μl；混 匀后，于37℃酶切2h。经酚/氯仿/异丙醇（体积比25:24:1）抽提后，加入2.5倍体积 的污水乙醇沉淀，13000rpm离心15min，弃上清，加0.5ml70%乙醇洗涤，13000rpm 离心15min，吸除上清液，加入20μl无核酸酶的水，获得酶切回收的DNA，-20℃保 存备用。以上述酶切回收的DNA为模板，用Promega公司RiboMAX RNA T7试剂盒 进行体外转录反应，得到V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的RNA，于-80℃保存备用。
3、RNA转染及MHV-GFP重组病毒的获得
将长至汇合度为100%的BHK-21细胞按1:15的比例接种到六孔板，于常规条件 下培养。当细胞长至汇合度为80-90%时，进行RNA的转染。取12μl的Lipofectamine 2000，稀释于100μl的Opti-MEM中，另取步骤2得到的重组痘苗病毒 V.V.-inf-GFP-GPT-OUT的RNA溶液45μl稀释于100μl的Opti-MEM中，室温静置 10min后，将两者轻轻混匀，静置20min，然后将转染混合物用Opti-MEM补足到1ml； 吸出BHK-21细胞原有培养液，用Opti-MEM清洗六孔板内BHK-21细胞，然后将转 染液加到六孔板待转染孔中，并将细胞于37℃细胞培养箱中培养6h。6h后弃掉含转 染试剂的培养液，加入3ml DMEM培养液，37℃、5%CO2恒温培养箱继续培养24h。
将长至汇合度为100%的17CL-1细胞按1:10的比例由75cm2培养瓶传至6孔板内， 于37℃、5%CO2条件下培养，使其在BHK-21细胞转染24h后，刚好长至汇合度为 100%。将17CL-1细胞及转染后的BHK-21细胞用胰酶消化后，按4：1比例混合，接 种至75cm2细胞培养瓶中，33℃，5%CO2恒温培养箱进行培养，并观察细胞病变（CPE）。 待细胞出现病变后，取细胞培养物于荧光显微镜下观察绿色荧光。收集细胞培养物， -70℃保存、备用。
17CL-1细胞按1:8的比例接种至6孔板内，于37℃、5%CO2条件下培养，至细 胞90%时进行病毒感染。
将病变细胞培养物冻融3次后，用DMEM完全培养基将病毒液分别作10-1，10-2， 10-3，10-4，10-5，10-6等10倍梯度稀释，移除17CL-1细胞六孔板原有的培养基，取病 毒稀释液感染六孔板17CL-1细胞（1ml/孔），37℃孵育2h；期间，将0.25%Gelrite（固 化剂，质量百分含量）和2×MEM培养基预热至56℃；待病毒吸附完成后，吸除病 毒液，将0.25%Gelrite和2×MEM培养基等体积混匀，按3ml/孔加到六孔板各孔中； 室温放置3-5min，待其凝固后，置于37℃培养箱继续培养，直至观察到明显蚀斑。挑 取单个蚀斑，-70℃保存备用。
如上方法，进行3-4次蚀斑纯化，即可获得较纯的相应MHV-GFP重组病毒。
4、MHV-GFP重组病毒的扩增
17CL-1细胞按1:8的比例接种至75cm2细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2条件下培 养，待细胞长至汇合度为90%时，感染步骤3所得的蚀斑纯化后的MHV-GFP重组病 毒，进行增殖，待细胞100%病变后，收取感染细胞培养混合物，获得大量的MHV-GFP 重组病毒。
5、MHV-GFP重组病毒基因组的鉴定
用QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit试剂盒提取步骤4获得的MHV-GFP重组病毒 的RNA，用Invitrogen公司SuperscriptⅢ反转录酶进行反转录：
（1）配制反转录酶反应体系如下：
65℃加热5min，然后冰浴3min
Psc56：5′-tggacgaccagaattaagatgagg-3′（GeBank：NC_001846.1的第28324-28347 位的反向互补序列，即序列1的第825-848位的反向互补序列）
（2）向上述体系中补加以下成分：
混匀后，55℃扩增反应1h，70℃加热15min进行酶失活。
补加1μl的RNase抑制剂，37℃作用20min。收集反应物，-20℃保存备用。
（3）以上述反转录产物为模板，以引物Psc39：5′-gtgatgagtatggaggacaccagg-3′ （GeBank：NC_001846.1的第27839-27862位，即序列1的第340-363位）和Psc56： 5′-tggacgaccagaattaagatgagg-3′（GeBank：NC_001846.1的第28324-28347位的反向互 补序列，即序列1的第825-848位的反向互补序列）进行PCR扩增。扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，观察结果并回收相应的目的条带（约1000bp），送样测序。将测序 结果与MHV A59株野生型病毒的基因组cDNA序列进行比对，再次对同源重组进行 确认分析。结果显示：与MHV A59株野生型病毒的基因组cDNA序列相比，MHV-GFP 重组病毒基因组的cDNA序列将MHV A59株cDNA序列（GenBank号：NC_001846.1， Up date：2012-8-23）的第27967-28264位（对应序列1的第468-765位）替换为序列 表中序列3所示的含有GFP编码基因的DNA片段序列（图3）。
实施例2、MHV-GFP重组病毒的生物学活性检测
一、MHV-GFP重组病毒一步生长曲线的测定
用实施例1制备的MHV-GFP重组病毒感染（MOI=1）17Cl-1细胞，37℃吸附1h 后，移除病毒液，用DMEM清洗细胞3次，以去除残留的未感染病毒，然后于33℃ 用含有10%（体积百分含量）FBS的DMEM培养细胞。于感染后0-24h内不同时间 点（0、2、4、6、8、10、12、24h）收取病毒，对收取病毒在33℃进行蚀斑分析以测 定其病毒滴度（PFU/ml），进而绘制一步生长曲线。实验同时以野生型MHV A59株作 为对照，检测MHV-GFP重组病毒与其一步生长曲线的差异。实验重复三次。
病毒一步生长曲线的测定结果如图4所示，从图中可以看出，MHV-GFP重组病 毒的复制周期和病毒的最高滴度，与野生型MHV A59株没有明显差异。
二、MHV-GFP重组病毒的细胞水平评价
用实施例1制备的MHV-GFP重组病毒感染17Cl-1细胞（MOI=0.05），48小时后 于荧光显微镜下观察绿色荧光情况。
荧光显微镜的连续观察结果显示：感染重组病毒MHV-GFP的单层细胞，不仅在 病毒的蚀斑区域可观察到明亮的绿色荧光，同时，在蚀斑区域的外围也可清晰地观察 到细胞间连成一线并呈放射状扩散的绿色荧光（如图5）。因此，获得的重组病毒 MHV-GFP，不仅可通过绿色荧光的观察，准确、清晰的反映病毒在细胞水平的增殖、 感染情况，同时，也可通过荧光信号的放大示踪效果，对病毒的早期感染进行定量监 测和病毒的细胞间扩散进行实时监测。
三、MHV-GFP重组病毒的动物水平评价
将24只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠（15-18g/只）随机分为3组：PBS对照组、 野生型MHV A59株（MHV-WT）组和MHV-GFP重组病毒组，每组8只。
每组的接种方案如表3所示。接种方式为腹腔注射，三组均为单次注射，每次注 射剂量均为1.0ml。
表3每组的接种方法
免疫后，对各组小鼠进行如下几方面的观察与检测：
1、每天观察小鼠发病情况并测定其体重变化。
结果显示：重组病毒（MHV-GFP）与野生型病毒（MHV-WT）腹腔接种小鼠后， 感染小鼠均出现弓背，耸毛，体重下降（图6，3×106PFU/只），行动迟缓等典型征状； 且相同感染时间（自接种日起10d内），两组病毒感染小鼠均无死亡。
2、在接种日起的不同时间点（1、2、5h），摘眼珠法抽取小鼠血液，进行血液丙 氨酸转氨酶（ALT）的检测。采用Biovision公司的丙氨酸转氨酶（ALT）活性检测试 剂盒（产品目录号：K752-100）进行检测，具体操作按照试剂盒说明书进行。实验重 复三次，结果取平均值。
血液ALT值的检测结果如图7（病毒感染剂量为3×106PFU/只）所示，从图中可 以看出，在相同感染时间点，MHV-GFP组和MHV-WT组小鼠血液ALT值无显著差 异。
3、在接种日起的不同时间点，取各组小鼠肝脏。将其中一部分肝脏组织，研磨后 离心取上清，通过蚀斑实验，测定病毒滴度；实验重复三次，结果取平均值。另一部 分部分肝脏组织制备病理切片，观察肝脏病理损伤，在荧光显微镜观察病毒的扩散和 增殖情况。
小鼠肝脏病毒滴度测定结果如图8（病毒感染剂量为3×105PFU/只）所示，从图中 可以看出，在相同感染时间点，MHV-GFP组和MHV-WT组小鼠肝脏内的病毒滴度无 显著差异。
小鼠肝脏的病理切片光镜观察结果如图9（病毒感染剂量为3×105PFU/只，感染5 天后）所示，从图中可以看出，MHV-GFP组和MHV-WT组小鼠肝脏细胞均出现胞浆 疏松化和气球样变等典型病毒性肝炎特征。另外，荧光显微镜对MHV-GFP组小鼠肝 脏病毒的扩散和增殖情况的观察结果（图10，病毒感染剂量为3×105PFU/只）显示： 在MHV-GFP感染小鼠11小时后，即可在肝脏组织切片上观察到病灶部位的荧光显示， 显示出MHV-GFP更加灵敏的病毒早期感染检测优势；24小时内的连续观察显示，感 染小鼠肝组织的绿色荧光信号逐渐加强，这表明重组病毒MHV-GFP具有较好的连续 监测和示踪效果。
综合本实施例的实验结果，可见与野生型MHV A59株相比，MHV-GFP重组病毒 的毒力、复制能力和致病力均无明显差异，即MHV-GFP重组病毒中，外源基因GFP 的导入，对病毒的体内生物学活性无显著影响。