新的乳酸菌 发明背景
1.发明领域
本发明涉及一些抑制在人的口中产生齿斑的新的乳酸菌。更具体地讲，通过所述的新的细菌可以抑制不溶于水的葡聚糖(齿斑葡聚糖)这种齿斑的主要成分的产生，所述的葡聚糖(齿斑葡聚糖)是由通常在人的口中进行抑制的细菌产生的。通过所述的新的细菌也可以抑制导致齿龈炎、牙周炎和伴随性口臭(恶臭)的口腔厌氧菌。这些乳酸菌属于Enterococcus spp.、Lactobacillus spp.、Lactococcusspp.和Streptococcus spp.，它们抑制不溶于水的葡聚糖的产生或者抵抗在不溶于水的葡聚糖的生成过程中发挥作用地细菌、或者抑制导致齿龈炎和牙周炎的厌氧菌的生长。
2.现有技术的描述
乳酸菌一般使糖类发酵成乳酸。乳酸菌生存于人和动物的口腔和消化道中，并且用于生产发酵食品，诸如酸奶、干酪等。此外还使用它们来生产诸如药物之类的生物活性物质。具有代表性的这些产生乳酸的细菌为嗜热链球菌、粪肠球菌、耐久肠球菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌以及植物乳杆菌。作为人和动物内脏中的寄居者，已知这些革兰氏阳性乳酸菌通过产生抑制病原菌生长的乳酸和抗菌物质，从而在保持内脏健康的过程中起到了重要的作用。
齿斑的最重要的成分是葡聚糖。葡聚糖或为可溶于水的葡聚糖、即具有1，6-α键作为主要化学键的葡聚糖，或为具有1，3-α键作为主要化学键的不溶于水的葡聚糖(齿斑葡聚糖)。水中的溶解度与1，3-α键的数量成反比。因此，不溶于水的葡聚糖(齿斑葡聚糖)作为齿斑的主要基质。就预防齿斑的能力而言，测试了消化葡聚糖的葡聚糖酶(α-1，6葡聚糖水解酶)。但是，葡聚糖酶对预防齿斑的效果的评价是有问题的(《基本牙齿微生物学》：Appleton & Lange，Norwalk，SanMateo，p.337，1991)，这是因为葡聚糖酶不能消化齿斑葡聚糖这种齿斑的主要基质。人们发现分解齿斑葡聚糖的齿斑葡聚糖酶(内切-α-1，3-葡聚糖酶)对齿斑的消化具有一些作用。但是，齿斑葡聚糖酶对齿斑的分解作用并不重要，并且需要花费太多的时间来表达其效力。因此发现这些酶对于人的口腔中齿斑的形成具有轻微的作用。
就借助乳酸菌来预防齿斑而言，公开号为0-524-732-A2的欧洲专利申请公开了能够在胞外生产葡聚糖酶的唾液链球菌的用途。但是由于葡聚糖酶不能消化齿斑葡聚糖这种齿斑的主要基质，因此其预防齿斑的作用是有问题的。唾液链球菌并不被用作发酵牛奶的起始细菌。
发明概述
由于对乳酸菌阻止不溶于水的葡聚糖或齿斑的产生以及厌氧菌生长的抑制活性进行的深入和彻底的研究，本研究已经基于这样一种假定，即一些寄居于人的口中的乳酸菌可能可以抑制不溶于水的葡聚糖或齿斑的产生或者抑制导致齿龈炎和牙周炎的厌氧菌的生长。通过许多临床试验，已经发现并证实了这些新的菌株具有显著地抑制不溶于水的葡聚糖或者齿斑的产生以及抑制导致齿龈炎和牙周炎的厌氧菌生长的能力。它们分别叫做Enterococcus spp.1357、Lactobacillus spp.V20和Lactococcus spp.1370。目前于1997年7月30日和12月11日将它们保藏在韩国生物科学与生物技术研究院的韩国模式培养物保藏所中(Enterococcus spp.1357的保藏号为KCTC 0360BP，Lactobacillus spp.V20的保藏号为KCTC 0361BP，Lactococcus spp.1370的保藏号为KCTC 0415BP)。
葡聚糖或为溶于水的或为不溶于水的(齿斑葡聚糖)，但每种都是通过由变异链球菌这种在形成齿斑的细菌中最重要的细菌分泌的葡糖基转移酶、从蔗糖合成的。但是，仅有不溶于水的葡聚糖、即齿斑葡聚糖是齿斑的主要基质。
Enterococcus spp.1357、Lactobacillus spp.V20以及诸如口腔链球菌、温和链球菌、缓症链球菌和血链球菌这样的产生H2O2的链球菌属的细菌(《伯杰氏分类细菌学手册》第2卷：Williams & Wilkins，巴尔的摩，伦敦，洛杉矶，悉尼，1986)对变异链球菌具有生长抑制活性。当在肉汤中与Enterococcus spp.1357、Lactobacillus spp.V20或作为产生H2O2的链球菌属细菌的代表的口腔链球菌(ATCC 35037)一起培养变异链球菌时，变异链球菌形成菌落的数量降至单独培养变异链球菌的菌落数量的约百分之一。由于对变异链球菌的抑制作用，不溶于水的葡聚糖或齿斑的产生也明显受到了抑制。
当把高分子量的葡聚糖加入到变异链球菌的培养肉汤中时，干扰了与不溶于水的葡聚糖结合的葡糖基转移酶，然后抑制接下来的不溶于水的葡聚糖的合成(Shigeyuki H.等人，《普通微生物学杂志》116：51，1980)。Lactococcus spp.1370产生了大量水溶性的葡聚糖；当与这种Lactococcus spp.1370一起培养变异链球菌时，不溶于水的葡聚糖的合成受到了抑制。
一般说来，粘附到牙齿表面上的齿斑提供了一个合适的场所，在该处变异链球菌以及其它的细菌进行繁殖并且导致形成龋齿，因此本研究的一个目的是发现能够抑制由口中的变异链球菌生成不溶于水的葡聚糖或者齿斑的新的细菌。
厌氧菌以很高的比例出现在口腔牙周炎以及齿龈炎中。随着疾病严重程度的增加，厌氧菌的比例显著增加(在牙周炎疾患中约有90％的微生物区系)。导致齿龈炎的主要的厌氧菌为中间普雷沃氏菌和具核梭杆菌。导致牙周炎的主要的厌氧菌包括牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌、中间普雷沃氏菌和具核梭杆茵(《当代口腔微生物学及免疫学》Mosby-Year Book，圣路易斯，1992)。这些厌氧菌在口中产生诸如挥发性硫化合物之类的恶臭的成分。主要的挥发性硫化合物为来自L-半胱氨酸的硫化氢以及来自L-甲硫氨酸的甲硫醇(Persson，S.，《口腔微生物学及免疫学》7：278，1992)。Lactobacillus spp.V20以及诸如口腔链球菌、温和链球菌、缓症链球菌和血链球菌这样的产生H2O2的链球菌属的细菌生成了抑制导致齿龈炎和牙周炎的厌氧菌生长的过氧化氢，从而改善并预防了疾患并减少了所伴随的口臭。过氧化氢是一种通过将-SH官能团转化成氧化的S-S形式来使酶失活的氧化剂，并且用作抗细菌、尤其是抗厌氧菌的消毒剂。
本研究的另一个目的是提供使用了所述乳酸菌的食品或饮料。当食用了含有所述乳酸菌的食品时，其中的乳酸菌能够直接抑制不溶于水的葡聚糖的产生并且对形成齿斑作出贡献的微生物具有抑制其生长的活性，所述的乳酸菌自然会抑制齿斑的形成，并最终预防了龋齿的产生。并且当食品含有能够抑制导致齿龈炎和牙周炎的厌氧菌生长的乳酸菌时，所述的乳酸菌自然会改善并预防齿龈炎、牙周炎以及伴随的口臭。
附图简要描述
通过参照所附的附图、从以下具体实施方案的描述中将会显而易见本发明以上的以及其它的目的和方面，所附的附图表明所述的新菌株对在正牙丝上人造齿斑产生的抑制作用(图1)。
发明详述
从人体中取出乳酸菌，将其在脑心浸液琼脂上划线接种，并在37℃下进行培养。之后，测试分离出的细菌菌落是否能够抑制变异链球菌(Ingbritt菌株)生产的不溶于水的葡聚糖的产生。在一个样品池中，将0.1mL变异链球菌和0.1mL分离出的细菌的培养肉汤接种到补充有0.5％酵母提取物和5％蔗糖的3mL的脑心浸液培养基中。作为对照，将变异链球菌单独接种到含有酵母提取物和蔗糖的脑心浸液培养基中。为使变异链球菌生产出不溶于水的葡聚糖，以与培养箱的水平面呈30°的角度放置样品池并在37℃下培养1天。在除去培养肉汤之后，用4mL蒸馏水洗涤样品池，然后装入3mL蒸馏水。通过分光光度计测量其在550nm下的吸光值(OD)。由于OD值与产生的不溶于水的葡聚糖成正比，因此分离出与对照相比产生了明显较低的OD值的细菌作为齿斑抑制性菌株。
为了评价产生过氧化氢的能力，将分离出的菌株划线接种到含有0.25mg/mL3，3’，5，5’-N-四甲联苯胺的二盐酸化物和0.01mg/mL辣根过氧化物酶的脑心浸液琼脂上，并且在厌氧培养箱中培养48小时。Lactobacillus spp.V20形成了蓝色的菌落，这表明Lactobacillus spp.V20具有生产过氧化氢的能力。
研究了分离出的菌株的微生物学特性，诸如形态学和生理学特性(表1)以及糖分解代谢的能力(表2)。
表1
形态学与生理学特性 特性 分离出的细菌菌株Enterococccus spp. 1357Lactobacillus spp. V20 Lactobacillus spp. 1370形态学 球菌，链状 杆菌，链状 球菌，链状革兰氏染色 阳性 阳性 阳性孢子的形成 - - -过氧化氢酶的活性 - - -10℃温度下的培养 + - +45℃温度下的培养 + + -pH9.6 + - -40％的胆汁酸 + - +6.5％NaCl + - -在MRS培养基上的生长 - + -3-羟基丁酮的生产 + +马尿酸的水解 + -吡咯烷酮基(pyrrolidonylary)酰胺酶 + -α-半乳糖苷酶 - -β-葡糖醛酸酶 - -β-半乳糖苷酶 + -碱性磷酸酶 - -亮氨酸芳基酰胺酶 + +精氨酸二水解酶 + -
表2
对糖的催化活性 糖 类 分离出的细菌菌株Enterococcus spp. 1357 Lactobacillus spp. V20 Lactococcus spp. 1370阿拉伯糖 - - -扁桃苷 + - -纤维二糖 + + +七叶苷 + + -果糖 + + +半乳糖 + + +葡萄糖 + + +乳糖 + + +麦芽糖 + + +甘露糖醇 - - +甘露糖 + + +松三糖 - - -棉子糖 - - -鼠李糖 - - -水杨苷 + - -山梨糖醇 - - -海藻糖 + + +菊粉 - -淀粉 + +糖原 - -
正如上文提及的那样，与对照相比在体外分离并测定了能够抑制齿斑产生的新的乳酸菌。而且进一步在体内测试了新的特性、即将分离出的新的细菌施入人的口腔中。
实施例I
在一次性的样品池中抑制不溶于水的葡聚糖的产生
将等量的M17培养基与MRS培养基混合在一起并且补充0.5％的酵母提取物、5％的蔗糖和0.1M TES(pH 8.0)。把3毫升配制成的培养基转移到一个一次性样品池中，然后向该样品池中接种75μl变异链球菌的过夜培养物。在培养箱中以与水平面呈30°的角度放置样品池，并在30℃下培养1天。除去内含物，然后用3mL蒸馏水洗涤样品池。之后，用4mL的蒸馏水装满样品池，并通过分光光度计测量550nm下的吸光值。重复这种测量三次并得到了平均值(表3)。
表3
乳酸菌对不溶于水的葡聚糖产生的抑制作用 样品 测试的细菌菌株 OD(550nm)对照I变异链球菌 2.122对照II嗜热链球菌+变异链球菌 2.325第I组Enterococcus spp.1357 0.434第II组Enterococcus spp.1357+变异链球菌 0.713第III组Lactobacillus spp.V20 0.506第IV组Lactobacillus spp.V20+变异链球菌 1.154第V组Lactococcus spp.1370 0.576第VI组Lactococcus spp.1370+变异链球菌 1.020第VII组口腔链球菌 0.511第VIII组口腔链球菌+变异链球菌 0.980
正如表3所示，第I对照组和第II对照组的光密度在550nm处的吸光率为2.122和2.325，而第II测试组、第IV测试组、第VI测试组和第VIII测试组的光密度分别为0.713、1.154、1.020和0.980。这种吸光率的降低表明这些细菌抑制变异链球菌产生不溶于水的葡聚糖。
实施例II
在正牙丝上形成人造齿斑
将等量的M17培养基与MRS培养基混合在一起并且补充0.5％的酵母提取物、5％的蔗糖和0.1MTES(pH8.0)。把150毫升配制成的培养基倒入烧杯中。把0.016英寸的不锈钢正牙丝(45mg)浸入培养基中。以每mL培养基为2.5×106的浓度接种变异链球菌。之后，以比变异链球菌的浓度高出5倍的浓度将乳酸菌的菌株接种到培养基中，并且在37℃下、在振荡中、于CO2培养箱中培养6.5小时。仅有不溶于水的葡聚糖或齿斑附着在丝上(McCabe，R.M.等人，《Archs oralBoil.》12：1653，1967)。将所述的丝转移到新鲜的烧杯中并且进行拍照(图1)。图1(A)是仅有变异链球菌的培养物的照片，而图1(B)是变异链球菌和Lactococcus spp.1370的共培养物的照片。
测量在丝上形成的人造斑的重量，且结果示于表4中。
表4
乳酸菌对形成人造斑的抑制活性 样品 测试的细菌菌株 产生的斑的重量对照I变异链球菌 75.4mg对照II嗜热链球菌+变异链球菌 92.3mg第I组Enterococcus spp.1357+变异链球菌 0.0mg第II组Lactobacillus spp.V20+变异链球菌 30.9mg第III组Lactococcus spp.1370+变异链球菌 0.0mg第IV组口腔链球菌+变异链球菌 0.0mg
在第I对照组和第II对照组中形成了75.4mg和92.3mg的人造斑，而在第I测试组、第III测试组和第IV测试组中没有形成人造斑。在第II测试组中，斑的重量降至30.9mg。因此，这就清楚地表明这些细菌对于由变异链球菌产生的齿斑具有潜在的抑制活性。
实施例III
人的口中齿斑指数的下降
为了评价新的乳酸菌菌株对人口中的齿斑指数降低的作用，在38个人当中进行了试验，以便通过Quigley与Hein齿斑指数(Harper，D.S.等人，《牙周病学杂志》61：352，1990)获得齿斑的得分。
38名年龄在22至26岁的年轻的成年人自愿参加这一研究。所有的志愿者都接受了全面的口腔病预防，并且暂停了所有的口腔卫生。志愿者象平时一样吃喝，但却停止用牙刷刷牙。在接受口腔病预防后第24小时的时候评定原始的齿斑得分。在揭开除第三磨牙之外的所有的齿斑之后，通过Quigley与Hein齿斑指数来计算齿斑的得分。将志愿者随机地分配成两组(每组为19人)，第I组用Lactococcus spp.1370漱口，而第II组用Lactobacillus spp.V20漱口。测试的细菌的悬浮液是通过在牛奶中培养Lactococcus spp.1370或Lactobacillus spp.V2024小时来制备的。志愿者在口腔病预防之后立即漱一次口，并且在饭后立即用20mLLactococcus spp.1370或Lactobacillus spp.V20在牛奶中的培养物(109CFU/mL)漱两次口、共漱2分钟。在接受口腔病预防之后第24小时的时候再次评定齿斑的得分。在每一组中对除第三磨牙之外的所有牙齿的齿斑得分取平均值并进行统计学分析。结果表明在接受口腔病预防之后第24小时的时候，第I组中齿斑指数下降了0.97，在第II组中下降了0.55(表5)。齿斑指数的降低在统计学上是显著的(p＜0.05)，即Lactococcus spp.1370和Lactobacillus spp.V20显著地减少了口腔中齿斑的形成。
表5
通过细菌漱口药导致齿斑指数的下降 所用的细菌 原始的齿斑得分 的平均值 在用细菌漱口后齿斑 得分的平均值 偏差 Lactococcus spp.1370 2.17 1.20 -0.97* Lactobacillus spp.V20 2.15 1.60 -0.55**p＜0.01通过配成对的t检验验证
实施例IV
在混合的培养物中抑制厌氧菌的生长
在MRS培养基中培养Lactobacillus spp.V2024小时。于厌氧培养箱中在厌氧菌培养肉汤中培养牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃氏菌和具核梭杆菌36小时，所述的培养肉汤每升含有脑心浸液培养基18.5g、酵母提取物5.0g、氯高铁血红素溶液10mL(将50mg的氯高铁血红素溶解到1mL 1N的氢氧化钠溶液中，并加入100mL的蒸馏水)和维生素K溶液0.2mL(将0.15mL的维生素K溶液与30mL 95％的乙醇混合)。于厌氧培养箱中在TSBV培养基中培养伴放线放线杆菌36小时，所述的培养基每升含有胰胨豆胨培养液30g、酵母提取物1.0g、马血清100mL、杆菌肽75mg和万古霉素5mg。将Lactobacillus spp.V20与各种厌氧菌的0.1mL的培养悬浮液以每mL 1.4×108的浓度单独或者混合接种到培养基中，该培养基含有与0.3mL的MRS肉汤混合的3.7mL的厌氧菌培养肉汤或TSBV培养基，并且在厌氧培养箱中培养36小时。将培养悬浮液进行稀释并接种到MRS琼脂、含有3％绵羊血的厌氧菌培养琼脂或TSBV琼脂上。在培养后第72小时的时候，数出菌落的数量。在进行单独培养后，Lactobacillus spp.V20和各种厌氧菌的菌落形成单位均有所增加，而在与Lactobacillus spp.V20一起进行培养后，却找不到各种厌氧菌的菌落。当与不产生过氧化氢的干酪乳杆菌一起培养厌氧菌时，菌落形成单位并未显著减少(表5)。当通过上述方法与各种厌氧菌一起培养作为产生H2O2的链球菌的代表的口腔链球菌(ATCC 35037)时，厌氧菌在培养基上没有形成菌落。
表6
培养后的菌落形成单位 接种的细菌 培养后乳杆菌的菌落 形成单位(/mL) 培养后厌氧菌的菌落 形成单位(/mL)Lactobacillus spp.V20 8.2×108干酪乳杆菌 9.0×108牙龈卟啉单胞菌 1.9×108伴放线放线杆菌 2.0×108中间普雷沃氏菌 1.8×108具核梭杆菌 1.8×108Lactobacillus spp.V20+牙龈卟啉单胞菌 8.0×108 0Lactobacillus spp.V20+伴放线放线杆菌 8.8×108 0Lactobacillus spp.V20+中间普雷沃氏菌 8.9×108 0Lactobacillus spp.V20+具核梭杆菌 7.8×108 0干酪乳杆菌+牙龈卟啉单胞菌 9.1×108 1.5×108干酪乳杆菌+伴放线放线杆菌 9.3×108 1.8×108干酪乳杆菌+中间普雷沃氏菌 8.9×108 1.6×108干酪乳杆菌+具核梭杆菌 9.8×108 1.6×108
后面给出了一些实例，在这些实例中事实上应用了所述的新的乳酸菌。用途实施例I：酸奶
正好在发酵之前将含有所述新的乳酸菌菌株的肉汤培养物以0.1％(体积)的量加入食品中，并与现有的细菌一起进行发酵来生产酸奶食品。得到的酸奶食品由10位评味员品尝。他们指出在测试样品与商购可得的食品(对照物)之间没有风味的差别。
在生产过程的密封步骤之前，以0.2％(体积)的量加入所述的乳酸菌菌株。从参加了品尝测试的10位评味员中总结出了这些如此获得的测试样品在味道上与对照食品并无差别的反映。用途实施例II：奶油
在包装步骤之前，将0.2％(重量)冻干的乳酸菌菌株加入到通过普通工艺生产的奶油食品中。给出这些如此得到的奶油食品作为品尝的样品。用途实施例III：干酪
在包装步骤之前，将0.2％(重量)冻干的乳酸菌菌株加入到通过普通工艺生产的干酪食品中。给出这些如此得到的干酪食品作为品尝的样品。用途实施例IV：冻干的乳酸菌
培养所述的新的乳酸菌并冻干(冷冻干燥)。可以单独或者与其它的细菌或物质一起摄入呈胶囊、片状和小包装形式的这些冻干的细菌。给出这些如此得到的冻干的产品作为品尝的样品。
因此便将所述的乳酸菌菌株应用到各种食品中，其中包括胶质软糖、起酥油、冰淇淋、人造奶油、泡酸菜等等。
从上面的实施例中，显而易见所述的新的乳酸菌株对于在人的口中不溶于水的葡聚糖或者齿斑的产生、或者对导致齿龈炎、牙周炎和伴随性口臭的厌氧菌的生长具有潜在的和持久的抑制活性。
此外，发现所述的新菌株能够应用到各种食品中并且能够直接施用到牙齿上。
根据上述技术，本发明的许多改进和变化都是可能的。