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1、(10)申请公布号 CN 103981248 A (43)申请公布日 2014.08.13 CN 103981248 A (21)申请号 201410167153.5 (22)申请日 2014.04.23 C12P 41/00(2006.01) C12P 13/06(2006.01) (71)申请人 东南大学 地址 210096 江苏省南京市四牌楼 2 号 (72)发明人 蒋立建 付倩倩 何慧 唐赛杰 顾美萍 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 柏尚春 (54) 发明名称 一种拆分外消旋亮氨酸的方法 (57) 摘要 本发明是一种拆分外消旋亮氨酸的。
2、方法， 该 方法以酶法拆分外消旋亮氨酸即 DL- 亮氨酸制备 左旋亮氨酸和右旋亮氨酸， 具体包括以下步骤 ： 第一步 ： 以外消旋亮氨酸为原料， 按照亚硫酰氯 法制备 DL- 亮氨酸甲酯盐酸盐 ； 第二步 ： 将 DL- 亮 氨酸甲酯盐酸盐溶于碱性水溶液中， 加入脂肪酶， 在3040温度下酶催化水解510小时， 再逐 渐冷却到室温， 过滤出不溶物， 即得左旋亮氨酸即 L- 亮氨酸， 并保留滤液 ； 第三步 ： 第二步所得滤液 在碱性条件下继续水解， 结束后用稀酸中和， 过滤 得右旋亮氨酸即 D- 亮氨酸。拆分所用溶剂是水， 生产成本低， 对环境污染小 ； 制备工艺简单、 处理 提纯方便、 设备。
3、要求不高。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书3页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103981248 A CN 103981248 A 1/1 页 2 1. 一种拆分外消旋亮氨酸的方法， 其特征在于 ： 该方法以酶法拆分外消旋亮氨酸即 DL- 亮氨酸制备左旋亮氨酸和右旋亮氨酸， 具体包括以下步骤 ： 第一步 ： 以外消旋亮氨酸为原料， 按照已知的亚硫酰氯法制备 DL- 亮氨酸甲酯盐酸盐 ； 第二步 ： 将 DL- 亮氨酸甲酯盐酸盐溶于碱性水溶液中， 加入脂肪酶， 在 。
4、30 40温度 下酶催化水解 5 10 小时， 再逐渐冷却到室温， 过滤出不溶物， 即得左旋亮氨酸即 L- 亮氨 酸， 并保留滤液 ； 第三步 ： 第二步所得滤液在碱性条件下继续水解， 结束后用稀酸中和， 过滤得右旋亮氨 酸即 D- 亮氨酸。 2. 根据权利要求 1 所述的一种拆分外消旋亮氨酸的方法， 其特征在于所述的脂肪酶包 括 ： 酸性脂肪酶、 中性脂肪酶、 碱性脂肪酶。 3. 根据权利要求 1 所述的一种拆分外消旋亮氨酸的方法， 其特征在于所述的稀酸包括 稀盐酸或稀硫酸， 稀酸的浓度为 0.1-2.0mol/L。 4. 根据权利要求 1 所述的一种拆分外消旋亮氨酸的方法， 其特征在于所述。
5、第二步中的 碱性水溶液所用的碱为 ： NaOH、 KOH、 NaHCO3、 Na2CO3或氨水。 5. 根据权利要求 1 所述的一种拆分外消旋亮氨酸的方法， 其特征在于所述第三步中碱 性条件所需要的碱是 LiOH、 NaOH、 KOH、 K2CO3或 Na2CO3。 权 利 要 求 书 CN 103981248 A 2 1/3 页 3 一种拆分外消旋亮氨酸的方法 技术领域 0001 本发明是一种手性有机化合物的制备技术， 尤其是一种拆分外消旋亮氨酸的方 法。 背景技术 0002 L- 亮氨酸在营养学上， 属于人体的必需氨基酸。L- 亮氨酸可用作营养增补剂， 如 用于配制氨基酸输液及综合氨基酸制。
6、剂， 与其他氨基酸共同作用， 修复肌肉， 控制血糖， 给 身体组织供应能量。研究表明， 亮氨酸能够影响控制人体内能量平衡的机制 1 ； 亮氨酸对 人体耐疲劳性及控制肌肉和肝糖原降解有显著作用 2 ； 通过完成糖类的氧化提高机体的氧 化能力且增加骨骼肌肉细胞中线粒体密度 3。此外， 亮氨酸还可用于调味增香剂。D- 亮氨 酸是一种非天然氨基酸， 有助于激光穴位刺激镇痛， 有望作为提高激光穴位刺激镇痛效应 的辅助药 ； 和 D- 苯丙氨酸共同作用， 得到的氨基酸复合制剂可作为治疗马疼痛良好的镇痛 药 4， 包括对术前后的疼痛、 风湿性关节炎、 扭伤和过劳等引起的疼痛 ； 亮氨酸衍生物能够 有效催化脂。
7、肪酮与醛的水相羟醛缩合反应 5 ； 用亮氨酸制备合成的N-稀有脂肪酰-亮氨酸 具有抗菌性能 6 ； 衍生物 N- 酰基 -D- 亮氨酸可以用于手性拆分。 0003 关于 D- 亮氨酸的制备， 文献报道的方法主要有化学拆分法、 酶法和诱导结晶法。 0004 化学拆分相关， 专利 ( 一种拆分制备光活氨基酸的方法 .CN102241555A)7 中用 具有光学活性的 1- 苯基乙磺酸和消旋的取代苯基乙磺酸组成的组合 AES 拆分剂， 在水溶 液中对 DL-Leu 进行拆分得到 D-Leu， 光学纯度 98.2。而在乙腈 / 水比例为 9:1 的溶液 中拆分时， 滤饼在乙腈 / 水溶液里 (9:1)。
8、 溶解， 滴加氨水至 pH 为 5.98， 得到 D-Leu， 光学纯 度 99.6。专利 ( 一种外消旋氨基酸的拆分方法 .CN101659623A)8以 D-DBTA 为拆分剂， 得到 D-Leu， 光学纯度 98.8。文献 The Resolution of Amino Acids.II.Isoleucine， Alloisoleucine， Leucine and Norleucine9外消旋亮氨酸酰化得到N-酰基-DL-亮氨酸 ； 产物与 (-)- 葑胺加入热水中， 反应得到复盐 ； 上述复盐在甲醇中经过分级结晶提纯得 到 N- 酰基 -D- 亮氨酸 (-)- 葑胺复盐， 后者分解得。
9、到 N- 酰基 -D- 亮氨酸， 然后在 3N 盐 酸中回流， 反应液浓缩， 蒸干后， 残余物在甲醇中溶解， 用氨水调 pH 至等电点， 过滤得到滤 饼为D-Leu。 以上方法， 有的拆分剂的价格比较高， 有的中间产品不易于进行后处理， 有的则 反应步骤较多， 操作过程相对复杂， 不方便工业化生产。 0005 专利 (N- 酰基 -DL-Leu 的制备及用途 .CN102617384A)10中首先将 L-Leu 在有 机酸中消旋， 得到 DL-Leu， 外消旋亮氨酸在无机碱溶液中与乙酸酐等酰化试剂作用生成 N- 酰基 -DL-Leu， 将其溶于碱性溶液， 加入 D- 氨基酰化酶， 经酶水解， 。
10、中和， 分离， 提纯得到 D-Leu。此法， 反应条件温和， 工艺简洁 ； 但是 D- 氨基酰化酶较不易获得， 价格比较高， 反应 体系中 L-Leu 不容易回收。 0006 文献 Optical Resolution of DL-Amino Acids by Preferential Crystallization Procedure11， 将DL-Leu和苯磺酸制成DL-Leu 苯磺酸盐。 将DL-Leu 苯 磺酸盐在水中溶解， 加入少量 D-Leu-BS 做晶种， 析出 D-Leu苯磺酸盐， 用离子交换法分出 说 明 书 CN 103981248 A 3 2/3 页 4 苯磺酸， 即得D。
11、-Leu。 诱导结晶法制取D-亮氨酸， 延长了生产周期， 增加了生产成本， 而且产 物的光学纯度相对较低， 不适合工业生产。因此， 有必要研究新的拆分方法。 发明内容 0007 技术问题 ： 本发明的目的是提供一种酶法拆分 DL- 亮氨酸制备 L- 亮氨酸和 D- 亮 氨酸的方法， 该方法拆分 DL- 亮氨酸对环境污染小、 工艺简洁、 所得产品光学纯度高而且收 率较高。 0008 技术方案 ： 本发明的拆分外消旋亮氨酸的方法以酶法拆分外消旋亮氨酸即 DL- 亮 氨酸制备左旋亮氨酸和右旋亮氨酸， 具体包括以下步骤 ： 0009 第一步 ： 以外消旋亮氨酸为原料， 按照亚硫酰氯法制备 DL- 亮氨。
12、酸甲酯盐酸盐 ； 0010 第二步 ： 将 DL- 亮氨酸甲酯盐酸盐溶于碱性水溶液中， 加入脂肪酶， 在 30 40 温度下酶催化水解 5 10 小时， 再逐渐冷却到室温， 过滤出不溶物， 即得左旋亮氨酸即 L- 亮氨酸， 并保留滤液 ； 0011 第三步 ： 第二步所得滤液在碱性条件下继续水解， 结束后用稀酸中和， 过滤得右旋 亮氨酸即 D- 亮氨酸。 0012 所述的脂肪酶包括 ： 酸性脂肪酶、 中性脂肪酶、 碱性脂肪酶。 0013 所述的稀酸包括稀盐酸或稀硫酸， 稀酸的浓度为 0.1-2.0mol/L。 0014 所述第二步中的碱性水溶液所用的碱为 ： NaOH、 KOH、 NaHCO3。
13、、 Na2CO3或氨水。 0015 所述第三步中碱性条件所需要的碱是 LiOH、 NaOH、 KOH、 K2CO3或 Na2CO3。 0016 有益效果 ： 本发明酶处理后的酯的溶液在碱水中比酰胺更容易水解 ； 拆分所用溶 剂是水， 生产成本低， 对环境污染小 ； 制备工艺简单、 处理提纯方便、 设备要求不高。 附图说明 0017 图 1 是本发明的工艺路线图。 具体实施方式 0018 本发明以酶法拆分DL-Leu制备左旋亮氨酸和右旋亮氨酸， 首先以DL-Leu为原料， 按照亚硫酰氯法制备 DL- 亮氨酸甲酯盐酸盐。然后将亮氨酸甲酯盐酸盐溶于碱性水溶液 中， 加入容易获得廉价的脂肪酶， 在一定。
14、温度下酶催化水解一段时间， 再逐渐冷却到室温， 过滤出不溶物， 即得左旋亮氨酸 (L- 亮氨酸 )。母液在碱性条件下继续水解， 结束后用酸中 和， 过滤得右旋亮氨酸(D-亮氨酸)。 这是首次使用脂肪酶选择性水解亮氨酸酯制备光活亮 氨酸的方法， 与使用D-氨基酰化酶制备D-亮氨酸相比， 脂肪酶来源更广泛， 价格更便宜， 而 且 L- 亮氨酸便于回收。 0019 本发明中利用脂肪酶能够选择性催化对映体左旋亮氨酸甲酯的水解， 得到左旋亮 氨酸和右旋亮氨酸甲酯， 由于左旋亮氨酸在溶液中溶解度较小， 会从溶液中析出 ； 而右旋亮 氨酸甲酯在溶液中溶解度较大， 则留在溶液中。平衡一段时间后， 通过过滤可以。
15、将它们分 开。 0020 得到的右旋亮氨酸甲酯在碱性条件下进行水解反应， 得到右旋亮氨酸钠盐。再经 过稀强酸中和， 生成亮氨酸。调节溶液的 pH 至亮氨酸的等电点， 此时亮氨酸的溶解度最小， 说 明 书 CN 103981248 A 4 3/3 页 5 从溶液中析出， 过滤即得到右旋亮氨酸。 0021 2 拆分条件 0022 将 DL- 亮氨酸甲酯盐酸盐溶于一定量的饱和酶液中， 并加入一定量的碳酸氢钠， 在 30 40下搅拌 5 10 小时， 再冷却至室温， 滤出白色固体。白色固体为左旋亮氨酸。 滤液中含有右旋亮氨酸甲酯， 在NaOH等碱性条件下水解， 再经过稀酸酸化， 调节pH值， 即得 到。
16、光学纯度较高 D- 亮氨酸。 0023 实例 1 ： 0024 称 取 3.62g(0.02mol) 亮 氨 酸 甲 酯 盐 酸 盐 加 入 小 锥 形 瓶 中，再 称 取 1.68g(0.02mol) 碳酸氢钠加入锥形瓶中， 并量取 16ml 饱和脂肪酶溶液加入反应瓶中， 将锥 形瓶放入恒温振荡器内振荡， 设置反应温度为 38， 反应 8h， 然后反应瓶缓慢冷却降温， 真 空抽滤。得到滤饼为 L- 亮氨酸 1.02g, 产率为 77.86， 比旋光度 D20 +14.6 (C 2， 6mol.L-1HCl)。 滤液中含有D-亮氨酸甲酯， 往滤液中加入一定量的氢氧化钠， 溶解后再加 入等体积的。
17、甲醇， 于室温下搅拌 10h， 用 1mol.L-1稀盐酸调节溶液的 pH 到 6， 再反应 1h， 过 滤， 用水洗涤滤饼， 干燥得到 D- 亮氨酸 0.90g， 收率为 68.70， D20 -14.35 (C 2， 6mol.L-1HCl)。 0025 实例 2 ： 0026 称取 3.62g 亮氨酸甲酯盐酸盐加入小锥形瓶中， 再称取 1.68g(0.02mol) 碳酸氢 钠加入锥形瓶中， 并量取 16ml 饱和脂肪酶溶液加入反应瓶中， 将锥形瓶放入恒温振荡器内 振荡， 反应温度为 34， 反应时间为 8h， 然后反应瓶缓慢冷却降温， 真空抽滤。得到滤饼为 L- 亮氨酸 0.92g, 产。
18、率为 70.22， 比旋光度 D20 +14.6 (C 2， 6mol.L-1HCl)。滤 液中含有 D- 亮氨酸甲酯， 往滤液中加入一定量的氢氧化钠， 溶解后再加入等体积的甲醇， 于室温下搅拌 10h， 用 1mol.L-1稀盐酸调节溶液的 pH 到 6， 再反应 1h， 过滤， 用水洗涤滤饼， 干燥得到 D- 亮氨酸 0.94g， 收率为 71.76， D20 -12.52 (C 2， 6mol.L-1HCl)。 0027 实例 3 ： 0028 称取 3.62g 亮氨酸甲酯盐酸盐加入小锥形瓶中， 再称取 1.68g 碳酸氢钠加入锥形 瓶中， 并量取 16ml 饱和脂肪酶溶液加入反应瓶中，。
19、 将锥形瓶放入恒温振荡器内振荡， 设置 反应温度为 38， 反应 9 小时， 然后反应瓶缓慢冷却降温， 真空抽滤。得到滤饼为 L- 亮氨 酸 1.19g， 比旋光度 D20 +14.6 (C 2， 6mol.L-1HCl)。滤液中含有 D- 亮氨酸甲酯， 向滤液中加入固体氢氧化钠， 溶解后再加入甲醇， 连续搅拌 10h， 用 1mol.L-1稀盐酸调节溶 液的 pH 到 6， 再反应 1h， 过滤， 用水洗涤滤饼， 干燥得到 D- 亮氨酸 0.83g， 收率为 63.36， D20 -14.40 (C 2， 6mol.L-1HCl)。 说 明 书 CN 103981248 A 5 1/1 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 103981248 A 6 。