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1、(10)申请公布号 CN 102030824 A (43)申请公布日 2011.04.27 CN 102030824 A *CN102030824A* (21)申请号 200910204094.3 (22)申请日 2009.09.30 C07K 16/08(2006.01) G01N 33/577(2006.01) A61K 51/10(2006.01) A61K 47/48(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 39/42(2006.01) A61P 31/20(2006.01) A61P 1/16(2006.01) A61P 35/00(2006.01) (7。
2、1)申请人 王虹 地址 510663 广东省广州市萝岗区高新技术 产业开发区科学城揽月路 80 号广州科 技创新基地 A 区第四层 (72)发明人 王虹 (54) 发明名称 一种乙型肝炎病毒 X 蛋白单克隆抗体及用途 (57) 摘要 一种乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)单克隆抗体， 其特征是对 HBx N- 端表位或 C- 端表位有特异性 反应， 对载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)和HBV其他 的表达蛋白无反应。 该单抗的制备方法是通过HBx N- 端和 C- 端抗原表位多肽分别与 KLH 的交联途 径免疫接种小鼠、 与骨髓瘤细胞融合而筛选获得 的， 可用于各种HBx蛋白或HBx抗体的免疫检测试 剂。
3、和导向性治疗药物， 应用于乙肝病毒 (HBV) 感 染和肝细胞癌 (HCC) 等疾病诊断和治疗。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 10 页 附图 1 页 CN 102030827 A1/1 页 2 1. 一种单克隆抗体， 其特征是此单克隆抗体与乙型肝炎病毒 X 蛋白 (HBx) 有特异性反 应， 可用于制备 HBx 免疫检测试剂和导向性治疗药物。 2. 权利要求 1 所述的单克隆抗体， 其特征是对 HBx N- 端表位或 C- 端表位有特异性反 应， 对载体蛋白匙孔血蓝蛋白 (KLH) 和 HBV 其他的表达蛋白无。
4、反应。 3. 权利要求 1 所述的单克隆抗体的制备方法， 方法包括 HBx N- 端和 C- 端抗原表位多 肽的化学合成， 表位多肽与匙孔血蓝蛋白 (KLH) 的交联， 免疫接种小鼠， 分离脾细胞与骨髓 瘤细胞融合， 有限稀释法筛选、 克隆对 HBx N- 端和 C- 端抗原表位有反应， 对 KLH 无反应的 能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞， 从杂交瘤细胞培养上清或小鼠腹水分离、 纯化， 获得单克 隆抗体。 4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备HBx免疫检测试剂的用途， 其特征是用酶、 同位 素、 生物素、 荧光物质和高分子微球等物质标记可制备用于诊断乙肝病毒 (HBV) 感染、 肝硬 化和肝细。
5、胞癌 (HCC) 等疾病的各种 HBx 蛋白或 HBx 抗体免疫检测试剂， 包括酶联免疫吸附 (ELISA)、 增强化学发光 (ECL)、 放射免疫检测 (RIA)、 免疫比浊 (IT)、 免疫组织化学 (IHC)、 免疫荧光 (IF) 和免疫印迹 (WB) 检测试剂。 5. 权利要求 1 所述的单克隆抗体在制备导向性治疗药物的用途， 其特征是 (1) 用放射 性同位素或细胞毒素标记或交联此单克隆抗体可制备用于治疗乙肝病毒 (HBV) 感染和肝 细胞癌 (HCC) 疾病的导向性治疗药物 ； (2) 用基因重组技术对此单克隆抗体进行重组和改 造可获得的单链、 单区、 嵌合等基因工程抗体药物。 权。
6、 利 要 求 书 CN 102030824 A CN 102030827 A1/10 页 3 一种乙型肝炎病毒 X 蛋白单克隆抗体及用途 技术领域 0001 本发明涉及一种单克隆抗体， 具体地说， 是一种乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)特异性 的单克隆抗体， 以及该单克隆抗体在制备 HBx 免疫检测试剂和肝病治疗药物中的用途。 背景技术 0002 我国是乙型肝炎病毒(HBV)感染高发地区， 超过10的人携带乙肝病毒。 HBV感染 是引发肝纤维化、 肝硬化和肝癌等肝病的主要因素。在我国， 目前约 80的肝细胞癌 (HCC) 患者合并乙型肝炎病毒 (HBV) 感染， HBV 感染者发生 HCC 的危险。
7、性是无感染者的 200 余倍。 0003 最新的研究显示， HBV X 蛋白 (HBx) 具有广泛的基因转录调控作用， 与慢性 HBV 感 染者发展成为 HCC 密切相关 1， 2。X 基因位于 HBV 基因组的 1374-1836 位置， 编码 155 个氨 基酸的多肽， 即 HBV X 蛋白 (HBx)3， 4。X 基因常随 HBV 基因组一同整合于肝细胞的染色体 中， 利用宿主细胞转录和翻译体系合成 HBx。HBx 具有广泛的基因转录调控作用， 不仅能够 激活病毒基因调控序列， 而且能够与宿主细胞多种蛋白相互作用， 从而影响宿主细胞周期、 影响细胞增殖分化与凋亡、 使肝细胞发生恶性转化。。
8、HBx 可与转录因子 XPA-1、 DDB1、 RPB5 和 TFIIB 结合， 以提高基因转录水平、 抑制 DNA 的修复、 促进病毒自身复制 ； HBx 还具有反式 激活作用， 可上调多种细胞因子及其受体， 如血管内皮生长因子 (VEGF)、 胰岛素样生长因子 (IGF) 及其受体的表达 ； 激活 C-myt、 N-ras 等癌基因， 与抑癌基因 p53 结合， 抑制 P53 的核 转移及正常的转录调节功能。此外， HBx 还可上调 HepG-2 的细胞端粒酶活性， 改变抑癌基 因 p55 负调控功能， 抑制细胞凋亡， 四细胞发生恶性转化， 与 HCC 的发生密切相关 5， 6。近 几年，。
9、 国外研究显示， 在 40 HBV 感染者和 60-70 HCC 患者的血清中可检测到 HBx 或 HBx 抗体 7， 8。国内已有用 HBxd 单抗用于肝癌放射免疫显像诊断和治疗的研究9， 10。血清 HBx 水平可能成为急慢性乙型肝炎、 肝硬化， 尤其是肝癌实验室诊断的良好指标。 0004 血清免疫学测定方法是检测 HBx 水平的最有效方法。HBx 单克隆抗体的筛选和制 备是免疫检测 HBx 的必要条件。目前， HBx 单克隆抗体的制备方法多采用基因工程表达并 分离HBx全长蛋白作为免疫动物和筛选单克隆抗体的抗原， 存在HBx自身免疫原性较弱， 获 得单克隆抗体效率低的问题。 0005 参。
10、考文献 ： 0006 1范红梅， 杨林.乙型肝炎X蛋白的生物学功能研究进展.国际流行病学传染病 学杂志， 2006， 33(2) ： 100 103 0007 2 彭玉莲 . 乙型肝炎病毒 X 蛋白与肝细胞癌 . 实用医学杂志， 2008， 24(14) ： 2536 2539 0008 3Tang H，Delgermaa L，Huang FJ，et al.The transcriptional transactivation function of HBxprotein is important for its augmentation role in hepatitis B virus r。
11、eplication.J Virol， 2005， 79(9) ： 5548 5556 0009 4Koike K， Tsutsumi T， Fujie H， et al.Molecular mechanism of viral hepatocarcinogenesis.JOncology， 2002， 61(1) ： 29 37 说 明 书 CN 102030824 A CN 102030827 A2/10 页 4 0010 5Zhang XD， Zhang H， Ye LH.Effects of hepatitis B virus X protein on the development 。
12、of livercancer.J Lab Clin Med， 2006， 147(2) ： 58 66 0011 6Tang H， Oishi N， Kaneko Shuichi， et al.Molecular functions and biological roles of hepatitisB virus X protein.Cancer Sci， 2006， 97(10) ： 977983 0012 7Hwang GY， Lin CY， Huang LM， et al.Detection of the hepatitis B virus X protein(HBx)antigenan。
13、d anti-HBx antibodies in cases of human hepatocellular carcinoma.J Clin Microbiology， 2003， 41(12) ： 5598 5603 0013 8Pal JO， Nyarady Z， Marczinovits I， et al.Comprehensive regression analysis of hepatitisB virus X antigen level and anti-HBx antibody titer in the sera of patients with HBV infection.P。
14、athology Oncology Research， 2006， 12(1) ： 34 40 0014 9 左强， 张军一， 陈锦章， 罗荣城 .131I 标记抗 CD20 单克隆抗体在荷瘤裸鼠内的 放射免疫显像。肿瘤防治研究， 2007， 34(7) ： 473-477 0015 10 李君， 汤献猷， 刘康达， 等 . 抗 HBx 单抗用于肝癌导向治疗的实验研究。当代 肿瘤学杂志， 1995， 2(1) ： 13-17 发明内容 0016 本发明目的之一是提供HBx蛋白的单克隆抗体， 所述的单克隆抗体对HBx N-端或 C- 端有特异性反应， 对载体蛋白匙孔血蓝蛋白 (KLH) 和其他的。
15、 HBV 表达蛋白无反应。 0017 本发明目的之二是提供HBx N-端和C-端抗原表位多肽通过与载体蛋白匙孔 血蓝蛋白 (KLH) 的交联激发免疫反应， 筛选、 制备 HBx 单克隆抗体的方法， 所述的 HBx N- 端 抗原表位多肽和 C- 端抗原表位多肽是人工化学合成的分别为多肽序列 1(SEQ 1) 和多肽 序列 2(SEQ 2) 所示的 HBx 蛋白 N- 端 11-20 位氨基酸序列 PARDVLCLRP 和 HBx 蛋白 C- 端 127-150 位氨基酸序列 I RLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNF 多肽。 0018 本发明目的之三是提供 HBx 单克隆抗体在制备 H。
16、Bx 蛋白或 HBx 抗体免疫检测试 剂的应用方法， 所述的 HBx 蛋白和 HBx 抗体免疫检测试剂盒是以 HBx 单克隆抗体为主要材 料， 与酶、 同位素、 生物素、 荧光物质和高分子微球等标记物质结合制备的各种酶联免疫吸 附 (ELISA)、 增强化学发光、 放射免疫检测 (RIA)、 免疫比浊、 免疫组织化学 (IHC)、 免疫荧光 (IF) 和免疫印迹 (WB) 等各种免疫检测试剂。 0019 本发明目的之四是提供 HBx 单克隆抗体在制备放射免疫显像诊断试剂和免疫导 向治疗药物的应用方法， 所述的放射免疫显像诊断试剂是用 131I、161Tb、153Sm 或186Re 等放射 性同。
17、位素标记的HBx单克隆抗体， 此标记抗体注射到体内后， 会选择性聚结在肝脏HBx阳性 组织， 用电子发射断层扫描仪 (ECT) 或正电子发射断层扫描仪 (PECT) 显像， 用于 HBV 感染、 肝硬化和肝癌等疾病的诊断方法 ； 所述的免疫导向治疗药物是用 131I、161Tb、153Sm、186Re 等放 射性同位素或细胞毒素标记的 HBx 单克隆抗体， 此标记抗体注射到体内后， 会因单抗选择 性聚结在 HBx 阳性肝癌病灶组织局部而产生的导向性抗肿瘤治疗作用。 0020 实现上述目的的具体方案是 ： 0021 本发明涉及的免疫原HBx N- 端和 C- 端抗原表位多肽的合成是在对 HBx 。
18、蛋白 氨基酸序列的抗原表位进行分析的基础上， 采用人工化学合成方法合成如多肽序列 1(SEQ 说 明 书 CN 102030824 A CN 102030827 A3/10 页 5 1) 和多肽序列 2(SEQ 2) 所示的两条 HBx N- 端和 C- 端抗原表位多肽。 0022 为提高复合多肽的免疫原性， 本领域通用的方法是分别用 HBx N- 端和 C- 端抗原 表位多肽与载体蛋白交联， 以便更好地激发免疫反应， 获得单克隆抗体。 载体蛋白包括匙孔 血蓝蛋白(KLH)、 牛血清白蛋白(BSA)或其他一些免疫原性较高的大分子蛋白。 本发明优选 匙孔血蓝蛋白 (KLH) 作为 HBx 抗原表。
19、位多肽的载体蛋白。 0023 动物免疫方法采用 HBx 表位多肽和 KLH 的交联蛋白加完全福氏佐剂充分混匀， 皮 下注射法免疫接种BAL B/C小鼠， 每只小鼠背部皮下分多点注射共100g抗原。 2周后， 用 交联蛋白加不完全福氏佐剂加强免疫1次， 3周后再加强免疫1次。 在确认小鼠已激发产生 抗 HBx 抗体后， 分离小鼠脾脏细胞与同系小鼠骨髓瘤融合， HAT 选择培养基筛选能分泌 HBx 单克隆抗体的杂交瘤细胞。上述方法是示例性的， 同样可以用复合多肽和 KLH 交联蛋白免 疫接种到大鼠、 兔、 羊和鸡等其他动物激发产生分泌抗体的浆细胞 ( 免疫细胞 )， 与同系动 物骨髓瘤细胞融合， 。
20、筛选获得分泌 HBx 单克隆抗体的其他种属杂交瘤细胞。 0024 小鼠浆细胞与骨髓瘤细胞的融合按常规方法操作。具体来说， 无菌取脾脏， 400 目 筛网过滤制备成细胞悬液， 按 5 1 的比例与小鼠骨髓瘤细胞 SP2/0 混合进行细胞融合， 融 合促进剂为50聚乙二醇4000(PEG4000)， 细胞培养基为含HAT的10胎牛血清RPMI1640选 择培养基。除上述常规细胞融合方法外， 可以选择电穿孔 ( 点击 ) 融合方法， 也可以选择仙 台病毒 (HVJ) 作为融合促进剂， 或添加二甲亚砜 (DMSO) 等增效剂， 也能达到获得杂交瘤细 胞的目的。 0025 杂交瘤细胞克隆化培养采用有限稀。
21、释法获得单克隆杂交瘤细胞。用来源于 BALB/ C小鼠的巨噬细胞作为饲养细胞先接种于96孔板， 然后每种杂交瘤细胞按每孔10、 5、 1个细 胞接种于铺有饲养细胞的 96 孔板中， 置 5 CO2 培养箱 37培养。4-5 天半量换液， 2 周左 右可用 ELISA 法测定 HBx 单抗。 0026 杂交瘤细胞和 HBx 单克隆抗体的筛选采用 ELISA 法来测定和筛选。用分别包被有 HBx N- 端和 C- 端抗原表位多肽的微孔板测定 HBx 抗体， 以单纯饲养细胞培养上清作阴性 对照 ； 以包被有匙孔血蓝蛋白 (KLH) 的微孔板鉴别抗 KLH 抗体， 以剔除抗 KLH 单克隆抗体。 只有。
22、抗 HBx 阳性、 抗 KLH 阴性杂交瘤细胞用作进一步筛选培养。 0027 HBx 单克隆抗体的制备与纯化可采用二条途径。一是从杂交瘤细胞体外培养上清 中收集 ； 二是将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中， 从小鼠腹水中收集。 前一种方法适用于获取 少量高纯度抗体， 后一种方法适合大量获取抗体。获取的抗体溶液可以用盐析、 凝胶过滤、 亲和层析等方法进行纯化。本发明优选硫酸铵辛酸盐析沉淀法进行纯化。 0028 本发明所涉及的 HBx 单克隆抗体与其他单克隆抗体的用途一样， 可用于制备各种 HBx 蛋白和 HBx 抗体的免疫检测试剂， 包括酶联免疫吸附 (ELISA)、 增强化学发光 (ECL)、 放 。
23、射免疫检测(RIA)、 免疫比浊(IT)、 免疫组织化学(IHC)、 免疫荧光(IF)和免疫印迹(WB)等 各种免疫检测试剂。ELISA 检测试剂及基于 ELISA 的增强化学发光检测试剂是目前临床上 最常用的免疫检测试剂， 其通用的制备方法是选用两株分别与 HBx N- 端和 C- 端抗原表位 反应的单克隆抗体， 一株作为捕获抗体， 一株作为检测抗体。 其中检测抗体用辣根过氧化物 酶 (HRP) 或碱性磷酸酶 (AP) 标记。检测 HBx 蛋白时用捕获抗体包被微孔板， 酶标抗体为检 测抗体 ； 检测HBx抗体时用抗人IgG抗体包被微孔板， 加入HBx抗原和酶标抗体。 ELISA检测 试剂用四。
24、甲基联苯胺 (TMB)、 或邻苯二胺 (OPD) 或其他化学显色底物显色， 用酶标仪测定结 说 明 书 CN 102030824 A CN 102030827 A4/10 页 6 果 ； 增强化学发光检测试剂用化学发光底物鲁米诺 (luminol) 显示结果， 用化学发光检测 仪测定结果。本发明涉及的 HBx 单克隆抗体还可以用任何已知的方法与同位素、 生物素、 荧 光物质和高分子微球等标记物质结合， 制备成放射免疫检测 (RIA)、 免疫组织化学 (IHC)、 免疫荧光 (IF) 和免疫比浊 (IT) 检测试剂。 0029 本发明所涉及的 HBx 单克隆抗体也可应用于制备放射免疫显像诊断试剂。
25、和免疫 导向治疗药物。通用的方法是， 用 131I、161Tb、153Sm 或186Re 等放射性同位素标记单克隆抗体 制备放射免疫显像诊断试剂， 标记抗体注射到体内后， 会选择性聚结在肝脏 HBx 阳性组织， 用电子发射断层扫描仪 (ECT) 或正电子发射断层扫描仪 (PECT) 显像， 用于 HBV 感染、 肝硬 化和肝癌等疾病的诊断 ； 用 131I、161Tb、153Sm、186Re 等放射性同位素或细胞毒素标记单克隆抗 体制备免疫导向治疗药物， 标记抗体注射到体内后， 会因单抗选择性聚结在 HBx 阳性肝癌 病灶组织局部而产生导向性抗肿瘤治疗作用。 还有一种新的方法是应用基因扩增和基。
26、因重 组技术对 HBx 单克隆抗体可变区 eDNA 基因进行扩增和重组， 获得人源性 HBx 单克隆抗体、 单链抗体等基因工程抗体药物， 可直接注射到体内用于原发性肝癌治疗。 0030 本发明的突出特点是通过化学合成方法分别 HBx N- 端和 C- 端抗原表位多肽， 并 与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)交联途径来免疫动物， 筛选获得HBx单克隆抗体。 所获 得的单克隆抗体分别是 HBx N- 端表位特异性反应抗体和 C- 端抗原表位特异性反应抗体， 有利于通过双抗体夹心方法制备各种用于 HBx 蛋白或 HBx 抗体检测的 ELISA 和化学发光免 疫检测试剂。 附图说明 ： 0031 附图 。
27、1.Western 免疫印迹分析 HBx N- 端表位单克隆抗体 N2F2 的特异性。Lane1 ： 阴性对照肝细胞HepG2裂解液 ； lane2 ： HBV基因转染肝细胞HepG2.2.15裂解液 ； lane3 ： HBx N- 端抗原表位多肽 ； lane4 ： 单纯匙孔血蓝蛋白 (KLH) ； lane5 ： HBx C- 端表位合成多肽。如 图所示， HBx N-端表位单克隆抗体对HBx N-端抗原表位多肽和肝细胞HepG2.2.15表达HBx 蛋白有较高的特异性反应 ( 显示单一条带 )， 而不与单纯匙孔血蓝蛋白 (KLH)， HBx 表达阴 性肝细胞 HepG2 和 HBx C。
28、- 端表位合成多肽发生反应。 0032 附图 2.Western 免疫印迹分析 HBx C- 端表位单克隆抗体 C3B2 的特异性。Lane1 ： 阴性对照肝细胞HepG2裂解液 ； lane2 ： HBV基因转染肝细胞HepG2.2.15裂解液 ； lane3 ： HBx C- 端抗原表位多肽 ； lane4 ： 单纯匙孔血蓝蛋白 (KLH) ； lane5 ： HBx N- 端抗原表位合成多 肽。如图所示， HBx C- 端表位单克隆抗体对 HBx C- 端抗原表位多肽和肝细胞 HepG2.2.15 表达 HBx 蛋白有较高的特异性反应 ( 显示单一条带 )， 而不与单纯匙孔血蓝蛋白 (K。
29、LH)， HBx 表达阴性肝细胞 HepG2 和 HBx N- 端抗原表位合成多肽发生反应。 具体实施方式 0033 实例一、 HBx 单克隆抗体的筛选 0034 1.HBx N- 端和 C- 端抗原表位多肽的合成 ： 采用 Antigenic Peptides 抗原 表位分析在线软件， 对 HBx 蛋白氨基酸序列的抗原表位进行分析。结果显示， HBx 蛋 白 N- 端 11-20 位 氨 基 酸 序 列 PARDVLCLRP 和 HBx 蛋 白 C- 端 127-150 位 氨 基 酸 序 列 IRLKVFVLGGCRHKLVCSPAPCNF是抗原表位指数较高的区段。 采用人工或化学合成方法。
30、分别合 说 明 书 CN 102030824 A CN 102030827 A5/10 页 7 成如多肽序列 1(SEQ 1) 和多肽序列 2(SEQ 2) 所示的 HBx N- 端和 C- 端抗原表位多肽。 0035 2.HBx N-端或C-端抗原表位多肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的交联 ： 用水溶 解马来酰亚胺活化的匙孔血蓝蛋白 (KLH)maKLH( 美国 Themo Scientific 公司产品 )， 使其 浓度为10mg/ml， 取200l maKLH与400l 10mg/ml的抗原表位多肽磷酸缓冲液(PBS)混 合， 迅速混匀， 室温放置 2 小时使二者交联形成共价复合物。。
31、将交联产物移至孔径为 1KD 的 微量透析管内， 对 PBS 透析 2-3 次以去除金属螯合剂 EDTA， 最后用 PBS 调节交联物至 10mg/ ml 年度。 0036 3. 免疫动物 ： 首次接种取 100l 交联物与 100l 完全福氏佐剂充分混合， 免疫 接种 BALB/C 小鼠 4-5 只， 每只小鼠背部皮下分 2 点接种 20l 共 100g 抗原， 接种前同时 取尾静脉血作为阴性对照 ； 14 天后取 100l 交联物与 100l 不完全福氏佐剂充分混合， 小鼠皮下免疫接种， 同时取尾静脉血 ELISA 法测定 HBx 抗体滴度 ； 21 天后取 100l 交联物 与100l不。
32、完全福氏佐剂充分混合， 小鼠皮下免疫接种， 同时取尾静脉血ELISA法测定HBx 抗体滴度 ； 如果 21 天抗体滴度还不够高， 于 28 天再次取 100l 交联物与 100l 不完全福 氏佐剂充分混合， 小鼠皮下免疫接种， 同时取尾静脉血 EIA 法测定 HBx 抗体滴度。 0037 4. 鼠脾细胞与杂交瘤细胞的融合与培养 ： 末次免疫后第 3 天， 无菌取脾脏， 在 400 目的筛网碾磨过筛， RPMI1640 基础培养基冲洗制备成细胞悬液， 1000rpm 低速离心弃上清， 加入含10胎牛血清的RPMI1640完全培养基， 调节细胞密度为107/ml， 取1ml细胞按51 的比例与 2。
33、106小鼠 SP2/0 骨髓瘤细胞混合， 低速离心弃上清， 用手指弹匀沉淀细胞， 在 37水浴中逐滴加入预热的50聚乙二醇4000(PEG4000)， 边加边混匀， 2分钟后加入10ml 无血清RPMI1640基础培养基， 低速离心弃上清， 沉淀细胞用HAT选择培养基重悬， 接种于24 孔板， 置 5 CO2培养箱 37培养。每 3-4 天换半量 HAT 选择培养基， 15 天后改用 HT 培养 基， 21 天后改用 10胎牛血清的 RPMI1640 完全培养基。克隆形成后， 接种只培养瓶中扩大 培养。用 ELISA 检测到 HBx 抗体后， 冻存部分克隆细胞。克隆化培养采用有限稀释法获得 单。
34、克隆杂交瘤细胞。用来源于 BALB/C 小鼠的巨噬细胞为饲养细胞接种于 96 孔板， 每孔接 种 104饲养细胞。悬浮杂交瘤细胞， 每组杂交瘤细胞按每孔 10、 5、 1 个细胞接种于铺有饲养 细胞的 96 孔板中， 置 5 CO2培养箱 37培养。4-5 天半量换液， 2 周左右可用 ELISA 法测 定 HBx 抗体。 0038 5. 杂交瘤细胞和 HBx 单克隆抗体的筛选 ： 采用 ELISA 法测定每孔杂交瘤细胞培 养上清 HBx 抗体。分别 HBx N- 端和 C- 端抗原表位多肽包被微孔板， 1牛血清蛋白 (BSA) 封闭， 加入待测培养上清孵育 1 小时， 以无杂交瘤细胞培养上清。
35、作阴性对照。用含 0.1 Twen-20 的 PBS 洗涤液洗涤 3 次， 加入辣根过氧化酶 (HRP) 标记的羊抗鼠 IgG 孵育 30 分钟， PBS 洗涤液洗涤 5 次， 加入 100l 四甲基联苯胺 (TMB) 显色液避光显色 10 分钟， 加 2N 硫 酸终止显色， 在酶标仪上于 450nm 处测定吸光度值 (OD 值 )。以包被有匙孔血蓝蛋白 (KLH) 的微孔板筛选抗 KLH 阳性抗体， 以剔除抗 KLH 单克隆抗体。只有抗 N- 端表位或 C- 端表位 阳性、 抗 KLH 阴性杂交瘤细胞才用作进一步筛选。 0039 实例二、 HBx 单克隆抗体的制备、 纯化及鉴定 0040 1。
36、.HBx 单克隆抗体的制备与纯化 ： 对于大量制备单克隆抗体， 选择将杂交瘤细胞 接种到小鼠腹腔中， 收集小鼠腹水获得抗体。抗体的纯化可以用盐析、 凝胶过滤、 亲和层析 等方法进行纯化。 我们优选硫酸铵辛酸盐析沉淀法进行纯化。 (1)腹水的制备 ： 先腹腔 说 明 书 CN 102030824 A CN 102030827 A6/10 页 8 注射 0.5ml Pristane( 降植烷 ) 或液体石腊于 BaLb/c 鼠， 1 2 周后腹腔注射 1106个杂 交瘤细胞， 接种细胞710天后可产生腹水， 密切观察动物的健康状况与腹水征象， 待腹水 尽可能多， 而小鼠频于死亡之前， 处死小鼠， 。
37、收集腹水。(2) 单抗的纯化 ： 收集的腹水用滤纸 过滤去除沉淀和脂质， 滤液用 4 倍体积 60mmol/L 醋酸缓冲液 (pH4.0) 稀释后， 用 NaOH 调， PH值至4.5。 逐滴加入辛酸(终浓度25ul/ml)， 室温h搅拌30分钟后， 以6000-8000r/min， 离心 30 分钟， 收集上清液。上清液经滤纸过滤 2 次， 将滤液与 10PBS(0.1mol/L， pH7.4 按 10 1 比例混合， 调 pH 至 7.4， 置冰浴冷至 4 )。每毫升上述混合液加 0.2778 固体硫酸 铵， 4搅拌30分钟， 以4000-6000r/min离心10-20分钟， 将沉淀溶于。
38、少量PBS， 对PBS缓冲 液 4透析过夜， 次日收集抗体溶液冻存， 以备抗体效价及蛋白含量测定。 0041 2.HBx 单克隆抗体效价的测定 ： 采用 ELISA 方法， 用包被有 HBx N- 端或 C- 端抗原 表位多肽的包被微孔板测定杂交瘤细胞培养上清、 腹水和纯化后抗体的效价。将各种含抗 体的液体以10倍稀释的方式不断稀释， 每个反应设3个复孔， 无细胞培养基、 腹水和相应的 抗体稀释液作阴性对照。以 3 个复孔 OD450nm值大于阴性对照的最低稀释度为抗体效价。本 发明共获得 5 株培养上清抗体效价大于 10-4的杂交瘤细胞。其中 HBx N- 端表位特异性抗 体 3 株， 分别。
39、为 N1E3、 N2F2、 N2G4 ； HBx C- 端表位特异性抗体 2 株， 分别为 C3B2 和 C5E8。各 株抗体效价见表 1。 0042 3.HBx 单克隆抗体亚类的鉴定 ： 用购自美国 Sigma 公司的 ISO-1ELISA 试剂盒对上 述 N1E3、 N2F2、 N2G4、 C3B2 和 C5E8 杂交瘤细胞所分泌的单克隆抗体进行亚类分析。此试 剂盒可分析 IgG1、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgA 和 IgM 等抗体亚类。N1E3、 N2F2、 N2G4、 C3B2 和 C5E8 单克隆抗体的亚类分别为 IgG2a、 IgG2b、 IgG1、 IgG2a 。
40、和 IgG1。 0043 表 1. 各株单克隆抗体的效价 0044 0045 4.Western 免疫印迹验证抗体的特异性 ： 分别用 1SDS 上样缓冲液溶解 HBx 抗 原表位复合多肽与载体蛋白匙孔血蓝蛋白 (KLH) 交联蛋白 1g 和 HBV 基因转染肝细胞 HepG2.2.15， 100煮沸变性 5 分钟， 12000rpm 离心 10 分钟， 取上清分别点样到小板 15聚 丙烯酰胺凝胶(PAGE)中， 恒压100V电泳1小时。 电泳后取下凝胶， 浸泡于电转移缓冲液中。 裁剪等大的 PVDF 膜， 经甲醇活化后放在凝胶的正极面， 于湿式电转移槽中恒压 45V 转膜 1 小时。取出 P。
41、VDF 膜， 用 5脱脂奶粉封闭 1 小时， 按 1 2000 加入抗 HBx 单克隆抗体室温 说 明 书 CN 102030824 A CN 102030827 A7/10 页 9 振摇孵育 2 小时， 用含 0.05 Twen-20 的 PBS 洗涤液洗涤 3 次， 加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 孵育 30 分钟， 0.05 Tween-PBS 洗涤 5 次。取出膜置二甲基联苯胺 (DAB) 显色液中避光显 色， 直到条带清晰为止， PBS 洗涤后照相。结果如附图 1 和附图 2 所示， HBx N- 端表位合成 多肽在 1.3KD 显示单一条带， HepG2.2.15 裂解液在 1。
42、7KD 处显示单一条带， 而单纯的 KLH 蛋 白， HBx C- 端表位合成多肽和未转染 HBV 的 HepG2 裂解液无特异性条带显示 ； HBxC- 端表 位合成多肽在 3.0KD 显示单一条带， HepG2.2.15 裂解液在 17KD 处显示单一条带， 而单纯的 KLH 蛋白， HBx N- 端表位合成多肽和未转染 HBV 的 HepG2 裂解液无特异性条带显示。说明 本发明所选的几个 HBx N- 端表位和 HBx C- 端表位单克隆抗体特异性较高。 0046 实例三、 HBx 单克隆抗体用于制备 HBx 蛋白增强化学发光免疫检测试剂盒 0047 1.HBx N- 端与 C- 端表。
43、位特异性单克隆抗体配对实验 ： 对 HBx N- 端表位特异性单 抗 N1E3、 N2F2、 N2G4 和 HBx C- 端表位特异性单抗 C3B2、 C5E8 进行相互配对实验。实验一 ： 分别用 50l20g/ml 的 N- 端表位特异性单抗 N1E3、 N2F2 和 N2G4 作为捕获抗体包被微孔 板， 包被缓冲液是碳酸盐缓冲液 (PH9.5)， 分别用 HRP 标记 HBx C- 端表位特异性单抗 C3B2 和 C5E8 作为检测抗体， 加入梯度稀释的重组 HBx 蛋白和 HBx 阳性质控血清， 洗涤液洗涤 3 次洗去非特异性结合抗原， 分别加入 HRP 标记的 1E34 和 3B23。
44、 单抗做配对比较实验， TMB 显 色后置酶标仪测定 OD450值。记录灵敏度和稳定性最好的抗体组合。实验一 ： 与实验一刚好 相反， 用 HBx C- 端表位特异性单抗 C3B2 和 C5E8 作为捕获抗体， 用 HRP 标记的 HBx N- 端表 位特异性单抗N1E3、 N2F2和N2G4为检测抗体进行配对实验， 记录灵敏度和稳定性最好的抗 体组合。实验结果显示， C3B2 为捕获抗体， N2F2 为检测抗体的这对抗体组合灵敏度和稳定 性最好。试剂盒选用 C3B2 为捕获抗体， N2F2 为检测抗体。 0048 2.板条包被 ： 利用琥珀酰亚胺酯活化聚苯乙烯(PVC)板条， 用0.05mo。
45、l/L pH9.6碳 酸盐缓冲液配置 C3B2 单抗成 5g/ml 的浓度， 以 100l/ 孔加入活化板条， 4过夜包被微 孔板， 0.05 Tween-PBS 洗涤液洗涤 3 次， 加 3 BSA-PBS 于 37封闭 1h， 再次洗涤 3 次， 吸 干残余液体， 置 4-8保存备用。 0049 3.N2F2单抗的HRP标记 ： 采用简易过碘酸钠法标记抗体。 称取5mg HRP溶解于1ml 蒸馏水中， 加入 0.2ml 新配的 0.1M NaIO4溶液， 室温下避光搅拌 20 分钟。将上述溶液装入 透析袋中， 对 1mM PH4.4 的醋酸钠缓冲液透析， 4过夜。加 20l 0.2M PH。
46、9.5 碳酸盐缓冲 液， 使反应液物的PH升高到9.09.5， 然后立即加入10mg N2F2单抗在1ml 0.01M碳酸盐 缓冲液中， 室温避光轻轻搅拌 2 小时， 加入 0.1ml 新配的 4mg/ml NaBH4液混匀， 再置 4 2 小时。最后将上述液装入透析袋中， 对 0.15M PH7.4PBS 透析， 换液 2-3 次， 4过夜。分光 光度计测定 ( 光程 1cm)OD403nm0.4 测定酶量 (mg/ml)， 用 OD280nm-(OD403nm0.42)0 .940.62 测定抗体 IgG 量 (mg/ml)， 计算单位抗体结合的 HRP 酶量。利用酶标记抗体的化 学发光滴。
47、定方法确定酶标抗体稀释度， 即为该标记物的工作浓度。HRP 标记 N2F2 单抗的工 作浓度一般为 1 5000-1 10000。 0050 4. 试剂盒组成 ： 96 孔板条， HRP 标记 N2F2 单抗、 200.05 Tween-PBS 洗涤液、 化 学发光底物溶液 (A 液和 B 液 )、 HBx 标准品 (10) 和说明书。 0051 5.HBx 定量检测试剂盒 ( 增强化学发光法 ) 的技术指标分析 0052 (1) 灵敏度分析 ： 用 10小牛血清将重组 HBx 蛋白分别稀释至 0.01ng/ml、 0.05ng/ml、 0.1ng/ml、 0.5ng/ml、 1ng/ml、 。
48、5ng/ml、 10ng/ml。使用 HBx 定量检测试剂盒检测， 说 明 书 CN 102030824 A CN 102030827 A8/10 页 10 记录发光强度， 做 3 组平行实验， 取数据平均值， 以 PBS 为阴性对照组， 进行 t 检验， 统计 每组数据与阴性对照组的差异， p 0.01 为阳性。检测结果显示， 试剂盒的检测灵敏度为 0.1ng/ml( 见表 2)。 0053 表 2.HBx 定量检测试剂盒灵敏度 0054 0055 t 检验 ： 与 PBS 比较， *p 0.05，*p 0.01 0056 (2)特异性分析 ： 使用HBx定量检测试剂盒分别检测25mg/ml。
49、球蛋白、 1mg/ml脂蛋 白、 0.1mg/ml 血红蛋白、 2mg/ml HBc、 2mg/ml HBe、 2mg/ml HBs、 2mg/mlHBVDNAP， 记录发光强 度， 做 3 组平行实验， 取数据平均值， 以 PBS 为阴性对照， 进行 t 检验， 统计每组数据与阴性 对照组的差异， p 0.05 为阳性。结果显示 25mg/ml 球蛋白、 1mg/ml 脂蛋白、 0.1mg/ml 血 红蛋白、 2mg/ml HBc、 2mg/ml HBe、 2mg/ml HBs、 2mg/mlHBVDNAP 与 HBx 定量检测试剂盒均不 会发生反应 ( 见表 3)。 0057 表 3.HBx 定量检测试剂盒 ( 增强化学发光法 ) 特异性 0058 0059 t 检验 ： 与 PBS 比较， *p 0.05，*p 0.01 0060 (3) 临床标本检测 ： 应用 HBx 定量检测试剂盒 ( 增强化学发光法 ) 检测 95 例乙型 肝炎病人血清 ( 包括急性肝炎、 慢性肝炎 )、 25 例肝硬化、 30 例肝癌病人血清， 及 80 例健康 体检血清， 按照标准曲线公式计算血清 HBx 浓度， 分别统计阳性率。结果显示， 应用 HBx 定 量检测试剂盒检测慢性乙肝阳性率为 48， 而肝癌的阳性率高达。