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1、(10)授权公告号 CN 202865231 U (45)授权公告日 2013.04.10 CN 202865231 U *CN202865231U* (21)申请号 201220374824.1 (22)申请日 2012.07.31 C12M 1/34(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) (73)专利权人 上海中优医药高科技有限公司 地址 200433 上海市杨浦区国泰路 11 号复 旦科技园 701 室 (72)发明人 卞雪莲 张奕 王校 (54) 实用新型名称 软骨发育不全致病基因突变检测试剂盒 (57) 摘要 本实用新型提供了一种软骨发育不全致病基 因是否发生突变的。
2、检测试剂盒， 包装盒体 (1)， 包 装盒体(1)内的中间设有口腔拭子(2)， 一侧设有 样本保存管 (3)、 含有正向引物的试管 (4)、 含有 反向引物的试管(5)、 另一侧设有含有PCR扩增试 剂的试管 (6)、 含有 PCR 产物纯化试剂的试管 (7) 和含 DNA 测序试剂的试管 (8)。试管排列位置固 定如图 1 所示。能够快速检测软骨发育不全致病 基因的突变体， 可应用于软骨发育不全的早期诊 断和产前筛查。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)实用新型专利 权利要求书 1 页 说明书 3 页 附图。
3、 1 页 1/1 页 2 1.软骨发育不全致病基因突变检测试剂盒， 其特征是由包装盒体(1)， 包装盒体(1)内 的中间设有口腔拭子 (2)， 一侧设有样本保存管 (3)、 含有正向引物的试管 (4)、 含有反向引 物的试管(5)、 另一侧设有含有PCR扩增试剂的试管(6)、 含有PCR产物纯化试剂的试管(7) 和含 DNA 测序试剂的试管 (8)。 权 利 要 求 书 CN 202865231 U 2 1/3 页 3 软骨发育不全致病基因突变检测试剂盒 技术领域 0001 本实用新型提供了一种软骨发育不全致病基因突变检测试剂盒， 属于分子生物学 技术领域。 0002 背景技术 0003 成纤。
4、维细胞生长因子受体3(fibroblast growth factor receptor3， FGFR3)位于 4p16.3， cDNA 长 4.4kb， 编码 840 个氨基酸残基组成的蛋白， 包含 19 个外显子和 18 个内含 子。FGFR3 是骨骼发育过程中重要的调控分子， 主要通过抑制软骨细胞增生、 分化来抑制软 骨形成过程， 其功能增强型点突变可以导致软骨发育不全。软骨发育不全是小儿遗传性侏 儒症中最常见的类型， 发病率为 1/15000 1/26000， 呈常染色体显性遗传， 该病外显率为 100。 0004 目前国外以及中国台湾地区报道的突变， 97以上位于FGFR3基因第10。
5、外显子的 1138 位核苷酸， 其中 95为 G A 的碱基转换， 其余为 G C 的颠换 ； 两种突变都导致了 FGFR3 第 380 位甘氨酸残基被精氨酸残基取代。研究显示 FGFR3 跨膜区基因 1138 位核苷酸 突变后， 引发 FGFR3 功能持续地、 不依赖配体地激活， 突变的受体拒绝配体介导的调控， 引 起 FGFR3 负向调控骨骼的生长， 进而导致软骨发育不全。 0005 本实用新型将样本采集、 软骨发育不全致病基因突变体检测整合在一个试剂盒 内， 使用更方便快捷， 且成本更低。本实用新型基于直接测序技术， 可以对 PCR 产物直接进 行 DNA 序列分析， 明确突变位点， 是。
6、现有基因突变检测方法中最直接最准确的方法， 且可以 实现机械化自动化， 使测序工作更加简便快捷， 结果判读更直观。 0006 发明内容 0007 本实用新型提供了一种软骨发育不全致病基因是否发生突变的检测试剂盒， 包括 包装盒体 (1)， 包装盒体 (1) 内的中间设有口腔拭子 (2)， 一侧设有样本保存管 (3)、 含有正 向引物的试管 (4)、 含有反向引物的试管 (5)、 另一侧设有含有 PCR 扩增试剂的试管 (6)、 含 有 PCR 产物纯化试剂的试管 (7) 和含 DNA 测序试剂的试管 (8)。能够快速检测软骨发育不 全致病基因的突变体。 0008 为实现以上目的， 本实用新型提。
7、供了一种软骨发育不全致病基因突变检测试 剂 盒， 其特征在于将样本采集、 软骨发育不全致病基因突变体检测整合在一个试剂盒内， 使用 更方便快捷， 且成本更低。 0009 步骤 1. 采集检测样品 ： 0010 用口腔拭子(2)在被测者口腔左右两腮分别各上下刮20次， 保证采集到足量的细 胞样本， 采集完毕， 样本保存于样本保存管 (3) 中。 0011 步骤 2. 采用硅胶吸附法抽提样本的基因组 DNA。 0012 步骤 3 ： PCR 扩增 0013 PCR 扩增试剂 (6)( 总体积为 1ml) 的成分包含 ： 20mM Tris-HCL(PH8.0)、 100mM KCL、 500uM 。
8、dNTPs、 3mM MgCl2溶液、 0.1U Taq DNA 聚合酶 /ul。 0014 检测在 ABI9700 型 PCR 扩增仪上进行， 每个样本分为 1 个反应孔， 每个反应孔放入 说 明 书 CN 202865231 U 3 2/3 页 4 FGFR3 正反向引物 (4)(5) 各 0.5ul( 引物浓度为 10umol/L)， 加入检测样品 2ul， PCR 反应液 7.5ul， 去离子水 4.5ul， 反应孔总体积 15ul。 0015 反应条件为 95预热 10 分钟 ； 再进行 35 个循环的 95、 45 秒， 60、 45 秒， 72、 60 秒 ； 72、 7 分钟后。
9、， 降温至 4。 0016 步骤 4 ： PCR 产物纯化 0017 每一个反应孔反应体系总体积为7ul， 由PCR产物纯化试剂4ul和PCR产物3ul组 成。反应条件为 ： 37、 60 分钟 ； 80、 15 分钟。 0018 步骤 5 ： DNA 测序反应 0019 每一个反应孔反应体系总体积为 5ul， 由 PCR 纯化产物 1ul、 DNA 测序试剂 1ul、 测 序引物1ul和去离子水2ul组成。 反应条件为 ： 96 2分钟 ； 25个循环的96、 10秒 ； 50、 5 秒 ； 60、 4 分钟 ； 60、 4 分钟。 0020 反应结束后每管加入 1ul 125mM 乙二胺四。
10、乙酸 EDTA 和无水乙醇 15ul， 室温沉淀 15 分钟 ； 3650 转 / 分， 4离心 30 分钟， 轻轻倒去上清液 ； 每孔加 30ul 70乙醇， 3650 转 / 分， 4离心 15 分钟， 倒去上清液 ； 室温放置 20 分钟后加入 HIDI 溶液 8ul， 上测序仪。 0021 步骤 6 ： 结果分析 0022 在测序仪上进行结果读取， 用软件 Chromas 查阅测序检测结果。 附图说明 0023 图 1 为本实用新型的结构示意图 ； 0024 图 2 为 FGFR3 基因第 10 号外显子实验无突变结果示意图 ； 0025 图 3 为 FGFR3 基因第 10 号外显子。
11、实验有突变结果示意图 ； 具体实施方式 0026 以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。 0027 实施例 0028 步骤 1. 采集检测样品 ： 0029 用口腔拭子(2)在被测者口腔左右两腮分别各上下刮20次， 保证采集到足量的细 胞样本， 采集完毕， 样本保存于样本保存管 (3) 中。 0030 步骤 2. 采用硅胶吸附法抽提样本的基因组 DNA。 0031 步骤 3 ： PCR 扩增 0032 PCR 扩增试剂 (6)( 总体积为 1ml) 的成分包含 ： 20mM Tris-HCL(PH8.0)、 100mM KCL、 500uM dNTPs、 3mM MgCl2溶液、 0.1U。
12、 Taq DNA 聚合酶 /ul。 0033 检测在 ABI9700 型 PCR 扩增仪上进行， 每个样本分为 1 个反应孔， 每个反应孔放入 FGFR3 正反向引物 (4)(5) 各 0.5ul( 引物浓度为 10umol/L)， 加入检测样品 2ul， PCR 反应液 7.5ul， 去离子水 4.5ul， 反应孔总体积 15ul。 0034 反应条件为 95预热 10 分钟 ； 再进行 35 个循环的 95、 45 秒， 60、 45 秒， 72、 60 秒 ； 72、 7 分钟后， 降温至 4。 0035 每一个反应孔反应体系总体积为7ul， 由PCR产物纯化试剂4ul和PCR产物3ul。
13、组 成。反应条件为 ： 37、 60 分钟 ； 80、 15 分钟。 说 明 书 CN 202865231 U 4 3/3 页 5 0036 每一个反应孔反应体系总体积为 5ul， 由 PCR 纯化产物 1ul、 DNA 测序试剂 1ul、 测 序引物1ul和去离子水2ul组成。 反应条件为 ： 96 2分钟 ； 25个循环的96、 10秒 ； 50、 5 秒 ； 60、 4 分钟 ； 60、 4 分钟。 0037 反应结束后每管加入 1ul 125mM 乙二胺四乙酸 EDTA 和无水乙醇 15ul， 室温沉淀 15 分钟 ； 3650 转 / 分， 4离心 30 分钟， 轻轻倒去上清液 ； 。
14、每孔加 30ul 70乙醇， 3650 转 / 分， 4离心 15 分钟， 倒去上清液 ； 室温放置 20 分钟后加入 HIDI 溶液 8ul， 上测序仪。 0038 步骤 4 ： 结果分析 0039 在测序仪上进行结果读取， 用软件 Chromas 查阅测序检测结果。 0040 1. 未检出突变 ： 未发现 FGFR3 基因存在突变， 分析结果如图 2 所示 ； 0041 2. 检出突变 ： 发现 FGFR3 基因第 10 外显子上存在 G1138A 点突变， 分析结果如图 3 所示。 说 明 书 CN 202865231 U 5 1/1 页 6 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 202865231 U 6 。