相关引用
本申请要求于2008年5月29日提交的美国临时专利申请序列号61/130,187的优先权，其整体在此引入作为参考。
发明领域
本发明涉及使用高粱作为原料(feedstock)从发酵中生产醇(例如乙醇)的非蒸煮方法。该方法包括在非蒸煮工艺中使用植酸酶、具有颗粒淀粉水解活性的淀粉水解酶和非淀粉多糖水解酶。
发明背景
由于石油产品的短缺和高昂价格，可再生能源如生物燃料的应用越来越重要。因此，在过去的几年中生物燃料乙醇市场以两位数的速度增长，预期这种趋势再持续至少三至五年。使用发酵乙醇用于能源的一个问题是这种方法是耗能的，因此仍然需要提高效率。另一个问题是随着使用发酵乙醇的增加，产生了更多的副产品，例如干酒糟加可溶物(DDGS)。例如，在干磨工艺中1公吨玉米仁通常产生约300Kg DDGS。于是，增加乙醇生产来满足快速增长的市场需要，也导致DDGS体积增加。尽管DDGS可以用于动物饲料配方，但是它们通常具有较高水平的植酸，植酸减少可以消化DDGS的动物的数量，并且当被消化时增加污染问题。
许多农业作物本身就是将淀粉转化成葡萄糖以产生多种生物化学品(包括可再生的生物燃料如乙醇)的可行候选物。虽然玉米是使用最广泛的用于生产乙醇的淀粉基发酵原料，但是其它高淀粉含量谷物(如高粱和稻米)也开始被认为是生产乙醇的可行原料。
一般而言，醇发酵工艺、特别是乙醇生产工艺包括湿磨工艺或干磨工艺。对于这些工艺的综述，参见Bothast等人，2005，Appl.Microbiol.Biotechnol.67：19-25和THE ALCOHOL TEXTBOOK，第3版(K.A.Jacques等人编辑)1999 Nottingham University Press，UK。
一般而言，干磨包括多个基本步骤，其包括：研磨、蒸煮、液化、糖化、发酵和固液分离以生产醇和其它副产品。通常，整个谷粒例如玉米被研磨成细颗粒大小，然后在料浆槽中与液体混合。在喷射式蒸煮器中料浆与液化酶(例如α-淀粉酶)一起历经高温，使谷物中的淀粉水解成糊精。混合物冷却，进而用糖化酶(例如葡糖淀粉酶)处理来生产可发酵的葡萄糖。然后在产乙醇微生物的存在下，将含有葡萄糖的醪液发酵约24～120小时。将醪液中的固体与液相分离，获得乙醇和有用的副产品例如酒糟。
最近，已经引入省去蒸煮步骤或减少在高温下处理谷粒的需要的工艺。这些工艺有时称作非蒸煮、低温或温蒸煮，包括研磨谷粒以及将磨碎的谷粒与液体混合以形成料浆，然后在低于颗粒淀粉糊化温度的温度，将料浆与一种或多种具有颗粒淀粉水解活性的酶和任选地酵母混合以生产乙醇和其它副产品(USP 4,514,496、WO 03/066826；WO 04/081193；WO04/106533；WO 04/080923和WO 05/069840)。
尽管这些工艺相对于先前工艺作了某些改进，但是工业需要另外的工艺改进来转化收籽高粱(grain sorghum)，导致较高的碳转化和能效以及高醇产量。
发明概述
在一些实施方案中，本发明涉及由研磨的高粱生产醇的方法，所述方法包括：在低于高粱的淀粉糊化温度的温度和约3.5至约7.0的pH、使具有20至50％w/w干固体(ds)含量的包含磨碎的高粱的料浆(slurry)与至少一种植酸酶、至少一种α淀粉酶(AA)、至少一种葡糖淀粉酶(GA)、至少一种非淀粉多糖水解酶和发酵生物接触约10至约250小时，其中所述至少一种AA和/或至少一种GA具有颗粒淀粉水解活性；和生产醇。在该实施方案的某些方面，所述醇为乙醇；至少一种非淀粉多糖水解酶选自：纤维素酶、β-葡糖苷酶、果胶酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、半纤维素酶或其组合。在该实施方案的某些方面，以酶混合物的形式加入所述植酸酶、α淀粉酶、葡糖淀粉酶和非淀粉多糖水解酶。在该实施方案的其它方面，该方法还包括使料浆与至少一种蛋白酶接触。该蛋白酶可以是酸性真菌蛋白酶。该酸性真菌蛋白酶可以源自木霉属物种(Trichoderma sp.)。在该实施方案的另外方面，以约1ppm至约10ppm的浓度加入该酸性真菌蛋白酶。在该实施方案的又一方面，该方法还包括使料浆与至少第二非淀粉多糖水解酶接触。在该实施方案的另外其它方面，所述接触是在20℃至80℃、在25℃至40℃的温度进行。在其它方面，所述接触是在55℃至77℃的温度进行，然后在加入酵母之前降到25℃至35℃。在该实施方案的其它方面，在接触步骤中提供的植酸酶为约0.01至约10.0FTU/g ds，为约0.1至约5.0FTU/g ds，为约1至约4FTU/g ds。在该实施方案的另外其它方面，该料浆包括收籽高粱和选自玉米、小麦、黑麦、大麦、稻或其组合的至少一种其它谷物的混合物。
在一些实施方案中，本发明涉及由高粱生产乙醇的工艺，所述工艺包括：获得碾碎高粱的料浆；在低于高粱的糊化温度的温度、将所述料浆与包括植酸酶、α淀粉酶、葡糖淀粉酶和非淀粉多糖水解酶的酶组合接触，以产生可发酵糖；和在发酵微生物的存在下、在10℃至40℃的温度，发酵可发酵糖10小时至250小时；和产生乙醇，其中与仅使用α淀粉酶和葡糖淀粉酶的可比方法相比，所述乙醇产量增加。在一些方面，乙醇产量将为至少8％、至少10％、至少12％、至少14％和至少16％v/v。在其它方面，乙醇产量将增加至少1％到至少10％。在一些方面，在45℃至65℃的温度进行所述接触步骤。在其它方面，该工艺包括在接触步骤后降低温度。
在一些实施方案中，本发明涉及由高粱生产乙醇的方法，所述方法包括在低于收籽高粱的淀粉糊化温度的温度、将含有来自收籽高粱的颗粒淀粉的料浆与至少一种植酸酶、至少一种α淀粉酶(AA)、至少一种葡糖淀粉酶(GA)、至少一种非淀粉多糖水解酶、至少一种酸性真菌蛋白酶和发酵生物接触足以生产乙醇的一段时间，其中所述至少一种AA和/或至少一种GA为颗粒淀粉水解酶(GSHE)，其中所述非淀粉多糖水解酶选自：纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、β-葡糖苷酶、β-葡聚糖酶和/或半纤维素酶。
发明详述
本发明的方法包括使用高粱在非蒸煮发酵中联合使用非淀粉多糖水解酶和植酸酶与颗粒淀粉水解酶(GSHE)来增加乙醇产量。使用常规工艺，来自高粱的乙醇产量通常非常低。尽管存在多种导致该低产量的因素，但是高粱中高浓度的鞣质是一种起作用的因素。这是因为当加热时，鞣质与蛋白质、淀粉和其它分子交联，产生网状结构。交联使高粱中的淀粉难以接近酶，导致可发酵糖的损失。因此，非蒸煮工艺的使用可以增加淀粉的可接近性，导致更好的发酵效率，从而增加乙醇产量。该方法还具有通过将植酸水解成肌醇(酵母的营养物)和磷酸盐(酵母和饲料动物的营养物)为酵母提供营养物和/或生长因子的优点。这也导致发酵效率增加。
本发明的方法包括在非蒸煮工艺中使高粱接触发酵生物和接触下列酶(同时地或分开地)：至少一种α淀粉酶、至少一种葡糖淀粉酶(其中所述α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶是颗粒淀粉水解酶(GSHE))、至少一种植酸酶和至少一种非淀粉多糖水解酶(例如，纤维素酶、半-纤维素酶、β葡糖苷酶、β葡聚糖酶、木聚糖酶和/或果胶酶)，以生产醇。该方法还可以包括加入第二酶，例如酸性真菌蛋白酶。该非蒸煮工艺可以在低于高粱的淀粉糊化温度的温度进行。在一些实施方案中，该方法在有助于酵母发酵的温度进行。在一些实施方案中，所述接触作为预处理而发生。在一些实施方案中，所述接触、发酵和/或预处理在低于高粱中颗粒淀粉的淀粉糊化温度的温度发生。在一些实施方案中，预处理在低于高粱中颗粒淀粉的糊化温度、但更接近于非淀粉多糖水解酶和/或用于工艺的其它酶的最适温度的温度发生。与在未加入植酸酶和非淀粉多糖水解酶的情况下进行的实质上类似的方法相比较，该工艺导致乙醇产量增加、发酵效率增加和/或DDGS中植酸的量减少。
因此，该工艺的实施方案包括组合物和方法，其中在发酵过程中使高粱与包括至少一种植酸酶、至少一种α淀粉酶和至少一种葡糖淀粉酶(其中所述α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶是颗粒淀粉水解酶)以及至少一种非淀粉多糖水解酶(例如，纤维素酶、半-纤维素酶、木聚糖酶、β葡糖苷酶、β葡聚糖酶和/或果胶酶)的酶组合物在足以生产乙醇的温度和一段时间内接触。该方法导致乙醇产量增加，发酵效率增加和/或DDGS中植酸的量减少。在一些实施方案中，所述至少一种非淀粉多糖水解酶选自：纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、β葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和果胶酶。该方法还可以包括加入酸性真菌蛋白酶。在一些实施方案中，该方法包括在约3.5至7.0的pH，在有助于发酵生物发酵的温度(例如，28-38℃)，孵育和/或发酵高粱达10至250小时。定义
除非另有说明，本发明的实践涉及通常用于分子生物学、蛋白质工程、重组DNA技术、微生物学、细胞生物学、细胞培养、转基因生物学、免疫学和蛋白质纯化的常规技术，所有这些都是本领域的普通技术。这些技术是本领域技术人员已知的，并描述于很多教科书和参考文献中。本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，无论上文和下文，都通过参考明确并入本文。
除非本文中另外定义，本文中所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员所通常理解的含义。尽管和本文中描述的那些相似或等同的任何方法和材料可以在本发明的实践或试验中使用，但是本文描述了优选的方法和材料。因此，通过参考说明书整体，紧接下面定义的术语将得到更全面的描述。同样，如本文所使用，单数形式的“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数含义，除非上下文另外地明确指出。数值范围包括定义该范围的数字。因此，例如，提及包含“化合物”的组合物时，包括两种或多种化合物的混合物。还应理解，术语“或”通常以包括“和/或”的含义使用，除非上下文另外地明确指出。除非另外指出，氨基酸序列以氨基到羧基的方向从左到右书写。可以理解，本发明并不限于所述的具体方法、方案和试剂，因为根据本领域技术人员使用它们的情形，可以对它们进行改变。此外，本文所提供的标题不是对本发明的各个方面或实施方案的限制，可以通过参考说明书整体而拥有本发明的各个方面或实施方案。因此，通过参考说明书整体，紧接下面定义的术语将得到更全面地定义。然而，为了促进理解本发明，下面对许多术语进行定义。从本发明的说明书和权利要求来看，本发明的其它特征和优点将是明显的。
本文所用的术语″淀粉″是指由植物的复杂多糖碳水化合物组成的、由具有式(C6H10O5)x的直链淀粉和支链淀粉组成的任何物质，其中x可以是任何数。
本文所用的术语″颗粒淀粉″是指生(未蒸煮)淀粉，即存在于植物材料(例如籽粒和块茎)中的天然形式的淀粉。
本文所用的术语“颗粒淀粉底物”是指含有颗粒淀粉的物质。
本文所用的术语″干固体含量(DS)″是指基于干重以％计的料浆中的总固体。
本文所用的术语″料浆(slurry)″是指含有不溶性固体(例如颗粒淀粉)的水性混合物。
本文所用的术语“寡糖”是指具有2至10个以糖苷键连接的单糖单元的任何化合物。这些短链简单糖聚合物包括糊精。
本文所用的术语“可溶性淀粉”是指由不溶性淀粉(例如颗粒淀粉)的水解产生的淀粉。
本文所用的术语“醪液(mash)”是指用于生产发酵产物的液体的可发酵底物的混合物，并且用于指从可发酵底物与一种或多种淀粉水解酶和发酵生物的最初混合到该轮发酵完成的任何发酵阶段。
本文所用的术语“糖化酶”和“淀粉水解酶”是指能转化淀粉为单糖或寡糖(例如己糖或戊糖)的任何酶。
本文所用的术语″颗粒淀粉水解(GSH)酶″和″具有颗粒淀粉水解(GSH)活性的酶″是指能水解颗粒形式的淀粉的酶。
本文所用的术语“非淀粉多糖水解酶”是能够水解复杂碳水化合物聚合物例如纤维素、半纤维素和果胶的酶。例如，纤维素酶(内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶、β葡糖苷酶)、半纤维素酶(木聚糖酶)和果胶酶是非淀粉多糖水解酶。
本文所用的术语“淀粉的水解”是指糖苷键的断裂和水分子的加入。
本文所用的术语“α-淀粉酶(例如，E.C.3.2.1.1)”是指催化α-1，4-糖苷键的水解的酶。这些酶也被描述为实现含有1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中1，4-α-D-糖苷键的外切水解或内切水解的那些酶。
本文所用的术语“糊化”是指淀粉分子通过蒸煮而溶解以形成粘稠悬液。
本文所用的术语“糊化温度”是指包含淀粉的底物开始糊化时的温度。在一些实施方案中，这是糊化开始时的最低温度。确切的糊化温度取决于具体淀粉，并且可以随例如植物种类和环境以及生长条件等因素而变化。对于许多颗粒淀粉，初始淀粉糊化温度范围包括例如大麦(52℃至59℃)、小麦(58℃至64℃)、黑麦(57℃至70℃)、玉米(62℃至72℃)、高直链淀粉玉米(67℃至80℃)、稻(68℃至77℃)、高粱(68℃至77℃)、马铃薯(58℃至68℃)、木薯(59℃至69℃)和甘薯(58℃至72℃)。(参见例如，J.J.M.Swinkels的STARCH CONVERSION TECHNOLOGY中第32-38页，Van Beynum等人编辑(1985)Marcel Dekker Inc.New York和The Alcohol Textbook第3版，A Reference for the Beverage，Fuel and Industrial Alcohol lndustries，Jacques等人编辑，(1999)Nottingham University Press，UK)。
本文所用的术语“低于糊化温度”是指温度小于糊化温度。
本文所用的术语“非蒸煮”是指不加热至高于含淀粉底物的糊化温度的温度。
本文所用的术语“葡糖淀粉酶”是指淀粉葡糖苷酶类酶(例如，E.C.3.2.1.3、葡糖淀粉酶、1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶)。这些是外切作用酶，其从直链淀粉和支链淀粉分子的非还原端释放葡糖基残基。该酶还水解α-1，6和α-1，3键，尽管是以比α-1，4键慢得多的速率。
本文所用的短语“同时糖化和发酵(SSF)”是指一种产生终产物的工艺，其中发酵生物例如产乙醇微生物和至少一种酶例如糖化酶在同一工艺步骤中在相同容器中组合。
本文所用的术语“糖化”是指不可直接使用的多糖被酶转化为单糖或寡糖以便发酵转化为终产物。
本文所用的术语“碾磨(milling)”是指将谷粒分解成更小的颗粒。在一些实施方案中，该术语可与研磨(grinding)交换地使用。
本文所用的术语“干磨”是指碾磨干燥的完整谷粒，其中谷粒的级分例如胚芽和麸皮尚未被有目的地去除。
本文所用的术语“液化”是指淀粉转化中的阶段，其中糊化的淀粉被水解而产生低分子量的可溶性糊精。
本文所用的术语“稀酒糟(thin-stillage)”是指所得的发酵的液体部分，其含有溶解的物质和悬浮的细粒，并且与发酵所产生的固体部分分离。在工业发酵工艺中再循环的稀酒糟常常被称为“回流物(back-set)”。
本文所用的术语“容器”包括但不限于槽、缸、瓶、烧瓶、袋、生物反应器及类似物。在一些实施方案中，该术语是指适合于进行本发明所包括的糖化和/或发酵工艺的任何容器。
本文所用的术语“终产物”是指从可发酵底物酶促转化的任何碳源衍生产物。在一些优选的实施方案中，所述终产物是醇，例如乙醇。
本文所用的术语“发酵生物”是指适宜用在发酵中以直接或间接产生终产物的任何微生物或细胞。
本文所用的术语“乙醇生产者”或产乙醇微生物”是指能够从单糖或寡糖生产乙醇的发酵生物。
本文所用的术语“酶促转化”通常是指通过酶作用来修饰底物。本文所用的该术语还指通过酶的作用来修饰可发酵底物，例如含颗粒淀粉的底物。
本文所用的术语“回收的”、“分离的”、“分开的”指的是化合物、蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从与其天然相关的至少一种成分中移出。
本文所用的术语“产量”是指采用本发明的方法所生产的终产物的量。在一些实施方案中，该术语是指终产物的体积，而在其它实施方式中，该术语是指终产物的浓度。
本文所用的术语“发酵效率”是指如所述(Yeast to Ethanol，1993，5，第2版，241-287，Academic Press，Ltd.)，采用以下公式，与来自产葡萄糖底物(即实际淀粉)的理论乙醇重量相比，所生产的醇的实际重量的百分比。考虑基于干重的总淀粉含量、发酵过程中淀粉通过酶促水解向可发酵糖的转化、以及从淀粉到葡萄糖的化学谷粒(chemical grain)。
本文所用的术语“DE”或“葡萄糖当量”是用于测量总还原糖浓度的工业标准，基于干重以D-葡萄糖计算。未水解的颗粒淀粉的DE基本上为0，而D-葡萄糖的DE为100。一种用于测定料浆或溶液的DE的示范性方法在Schroorl的方法(Fehling分析滴定法)中进行了描述。
本文所用的“可发酵糖”是可以被发酵生物(例如酵母)直接消化的糖。可发酵糖的一些实例包括果糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖和半乳糖。
本文所用的“糊精”是葡萄糖的短链聚合物(例如2至10个单元)。本文所用的术语“葡萄糖浆”是指含有葡萄糖固体的水性组合物。葡萄糖浆将具有至少20的DE。在一些实施方案中，葡萄糖浆将含有不多于21％的水，并且将含有不少于25％的还原糖(以葡萄糖计算)。在一些实施方案中，葡萄糖浆将包括至少约90％D-葡萄糖，在另一个实施方案中，葡萄糖浆将包括至少约95％D-葡萄糖。在一些实施方案中，该术语葡萄糖和葡萄糖浆可互换使用。
本文所用的“发酵原料”是指在发酵中用作原材料的谷物或粮食，例如玉米、高粱、小麦、大麦、黑麦等。
本文所用的术语“总糖含量”是指存在于淀粉组合物中的总糖含量。
本文所用的术语“发酵”是指通过微生物酶促厌氧分解有机物质以生产更简单的有机化合物。虽然发酵可以发生在厌氧条件下，但该术语不意指仅限于严格厌氧条件，因为发酵也可以在氧存在下发生。
本文所用的术语“源自”包括术语“起源自”、“得自”或“可得自”和“分离自”，并且在一些实施方案中，如本文所用的，是指从细胞产生核苷酸序列编码的多肽，其中所述核苷酸天然存在于所述细胞中或者已经被插入所述细胞中。
本文所用的术语“回收的”、“分离的”和“分开的”是指蛋白质、细胞、核酸或氨基酸从至少一种和其天然关联的成分中移出。
本文所用的术语“蛋白质”和“多肽”在本文可互换使用。在本公开内容和权利要求中，使用常规的1字母和3字母代码表示氨基酸残基。氨基酸的3字母代码遵循IUPAC-IUB Joint Com mission on Biochemical Nomenclature(JCBN)定义。还应理解，由于遗传密码的简并性，一种多肽可由多于一种核苷酸序列编码。
本文所用的术语“接触”是指将至少一种酶放置得足够接近其相应底物，以使该酶能够将底物转化成至少一种终产物。在一些实施方案中，终产物是“目的产物”(即，终产物是所需的发酵反应结果)。本领域技术人员将认识到混合包含至少一种酶的至少一种溶液与其相应的酶底物可以导致“接触”。
本文提供的标题并不是对本发明的各方面或各实施方案的限制，其可以通过参考说明书整体而被理解。
尽管可以在本发明的实践或测验中使用与本文所述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料，但是此刻描述了示例性和优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过参考并入本文，以公开并且描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。
如果提到了数值范围，可以理解的是除非上下文另有明确要求，在该范围的上下限之间的每个居中值(直到下限的单位的十分之一)也明确地公开。在一个记载的范围内的任何陈述值或居中值与该记载的范围内的任何其它陈述的或居间的值之间的每一个更小范围，也涵盖在本发明中。这些较小范围的上下限可独立地包括或排除在该范围中，并且依据在该记载的范围中任何具体排除的端值，本发明也涵盖其中任一、无一或两个端值包括在该更小范围内的每个范围。若记载的范围包括一个或两个端值，排除所包括的端值之任一或两者的范围也涵盖在本发明中。
提供本文所讨论的出版物仅由于它们于本申请的申请日之前的公开。此处没有内容应被理解为承认本发明无权基于优选权发明而先于该出版物。
示例性实施方案
本发明涉及利用高粱作为原料在非蒸煮发酵方法中增加醇产量的方法。使用常规工艺，来自高粱的乙醇产量通常非常低。尽管有多种因素造成该低产量，但是高粱中高浓度的鞣质具有实质性影响。当加热时，鞣质与蛋白质、淀粉和其它分子交联，产生网状结构。交联使高粱中淀粉不易接近酶，导致可发酵糖的损失。因此，使用非蒸煮工艺可以增加淀粉的可接近性，导致更好的发酵效率，从而增加乙醇产量。
本发明的方法包括将碾磨的高粱与发酵生物以及与下列酶同时或分别接触来生产醇：至少一种α淀粉酶、至少一种葡糖淀粉酶(其中所述α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶是颗粒淀粉水解酶(GSHE))、至少一种植酸酶和至少一种非淀粉多糖水解酶(例如，纤维素酶、半-纤维素酶、β葡糖苷酶、β葡聚糖酶、木聚糖酶和/或果胶酶)。该方法还包括加入第二酶，例如酸性真菌蛋白酶。该非蒸煮工艺可以在低于高粱的淀粉糊化温度的温度进行。在一些实施方案中，该方法在有助于酵母发酵的温度进行。在一些实施方案中，所述接触作为预处理而发生。在一些实施方案中，所述接触、发酵和/或预处理在低于高粱中颗粒淀粉的淀粉糊化温度的温度发生。在一些实施方案中，预处理在低于高粱中颗粒淀粉的糊化温度、但更接近于非淀粉多糖水解酶和/或用于工艺的其它酶的最适温度的温度发生。与在未加植酸酶和非淀粉多糖水解酶的情况下进行的实质上类似的方法相比较，该工艺导致乙醇产量增加，发酵效率增加和/或DDGS中植酸的量减少。
因此，该工艺的实施方案包括组合物和方法，其中高粱与包括至少一种植酸酶、至少一种α淀粉酶和至少一种葡糖淀粉酶(其中所述α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶是颗粒淀粉水解酶)以及至少一种非淀粉多糖水解酶(例如，纤维素酶、半-纤维素酶、β葡糖苷酶、β葡聚糖酶、木聚糖酶和/或果胶酶)的酶组合物接触。该方法导致乙醇产量增加和/或发酵效率增加和/或DDGS中植酸的量减少。在一些实施方案中，所述至少一种非淀粉多糖水解酶选自：纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、β葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和果胶酶。该方法还可以包括加入酸性真菌蛋白酶。在一些实施方案中，该方法包括在有助于发酵生物发酵的温度(例如28-38℃)孵育和/或发酵高粱。在一些实施方案中，该方法包括在预处理步骤中在低于高粱的淀粉糊化温度的温度孵育高粱，然后在加入发酵生物前降低温度，并在约20℃至40℃的温度继续所述工艺。
在一些方面，本发明涉及酶混合物或组合物，其包括植酸酶和至少一种α淀粉酶和葡糖淀粉酶(其中所述至少一种α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶是颗粒淀粉水解酶(GSHE)以及至少一种非淀粉多糖水解酶(选自纤维素酶、木聚糖酶、半纤维素酶、β葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和果胶酶)的组合。本发明还涉及在非蒸煮工艺中使用该混合物或组合物发酵粒高粱和生产终产物(例如乙醇)。在另一方面，本发明涉及酶混合物或组合物，其包括植酸酶和至少一种GHSE(GA和/或AA)以及至少一种选自纤维素酶、半纤维素酶、β葡聚糖酶、木聚糖酶、β-葡糖苷酶和果胶酶的非淀粉多糖水解酶。该GSHE可以是α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶。在另外的实施方案中，本发明涉及酶混合物或组合物，其包括至少一种植酸酶、至少一种具有GHSE活性的α淀粉酶、至少一种具有GSHE活性的葡糖淀粉酶和至少两种选自纤维素酶、木聚糖酶、半纤维素酶、β葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和果胶酶的非淀粉多糖水解酶。在一个另外的实施方案中，所述组合还可以包括至少一种酸性真菌蛋白酶。该混合物或组合物的一个优点是其导致DDGS中植酸的量减少。当在非蒸煮工艺中使用时，该混合物或组合物的另一个优点是其导致乙醇产量增加。另一个优点是导致产生用于发酵所涉及的酵母的营养物，和导致发酵效率增加。
在一些实施方案中，在非蒸煮工艺的淀粉水解步骤和/或发酵步骤中加入酶混合物和/或组合物。在一些实施方案中，在非蒸煮工艺的预处理步骤中加入酶混合物和/或组合物。在一些实施方案中，在非蒸煮工艺的预处理步骤和发酵步骤中都加入酶混合物和/或组合物。
在一些实施方案中，该方法包括在非蒸煮工艺中使用至少一种植酸酶和至少一种颗粒淀粉水解酶以及至少一种非淀粉多糖水解酶来增加高粱的发酵产量的工艺。该工艺还包括同时或分开地加入发酵微生物和在适宜的发酵温度、但在低于高粱的淀粉糊化温度的温度，孵育所得混合物来生产乙醇。
在一些实施方案中，在非蒸煮工艺中使用所述酶导致发酵效率的显著提高以及所得DDGS中植酸的显著减少。DDGS中植酸的减少可以增加在饲料应用中的有用性。这是因为很多饲养动物(例如非反刍动物，象家禽、鱼和猪)不能消化植酸。植酸的另一个缺点是其通过粪便排出而导致磷酸盐污染问题。
本发明还涉及转化来自高粱的可发酵糖以获得终产物，例如醇(例如乙醇和丁醇)、有机酸(乳酸、柠檬酸)和特殊生物化学品(氨基酸、谷氨酸单钠等)。
在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：1)在低于淀粉糊化温度的温度，将颗粒淀粉与至少一种颗粒淀粉水解酶(AA或GA)、至少一种植酸酶和至少一种非淀粉多糖水解酶接触；2)将温度降至20℃至40℃的温度，和2)发酵，其中用于孵育和发酵的组合时间为约10至250小时，其中所述方法导致乙醇产量更高、发酵效率更高和/或DDGS中的植酸更少。任选地，可以加入第二酶，例如蛋白酶。
至少一种植酸酶、至少一种生淀粉水解酶和至少一种非淀粉多糖水解酶可以以混合物或组合物的形式加入或可以在非蒸煮工艺的预处理或发酵步骤中分开加入。在任一情况下，包括植酸酶、非淀粉多糖水解酶和GSHE的混合物或组合物的一个优点是，与在没有该酶组合的情况下在基本上相同的条件下通过发酵生产的乙醇量相比，其产生更多量的乙醇。在一些实施方案中，所述增加是相对于无植酸酶的方法而言的。在一些实施方案中，所述增加是相对于无至少一种非淀粉多糖水解酶的方法而言的。在一些实施方案中，所述增加是相对于无至少两种非淀粉多糖水解酶的方法而言的。在一些实施方案中，所述增加是相对于无至少一种植酸酶+至少一种非淀粉多糖水解酶的方法而言的。在一些实施方案中，所述增加是相对于有这些酶、但采用常规方法而不是非蒸煮方法的方法而言的。在一些方面，与无至少一种植酸酶和非淀粉多糖水解酶的发酵相比，所述增加为至少约0.1％，包括至少约0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、11％、12％、13％、14％和15％。在一些实施方案中，所述增加为约1％至约10％，包括约1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.1％、3.2％、3.3％、3.4％、3.5％、3.6％、3.7％、3.8％、3.9％、4％、4.1％、4.2％、4.3％、4.4％、4.5％、4.6％、4.7％、4.8％、4.9％、5％、5.2％、5.5％、5.7％、6％、6.2％、6.5％、6.7％、7％、7.2％、7.5％、7.7％、8％、8.2％、8.5％、8.7％、9％、9.2％、9.5％、9.7％和10％。所述增加可以是相对于任何下述方法的增加：1.有或无所述酶的常规方法，2.未加植酸酶的方法，3.未加非淀粉多糖水解酶的方法，4.未加非淀粉多糖水解酶和植酸酶的方法，和5.未加非淀粉多糖水解酶、植酸酶和至少一种GSHE的方法。植酸酶
用于本发明的方法和混合物的具体植酸酶对本发明并不是关键的。植酸酶是能够从肌醇六磷酸释放至少一个无机磷酸的酶。植酸酶根据它们对于最先水解的植酸分子上的特定位置的磷酸酯基团的偏好性而分类(例如，分类为3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26))。植酸酶的一个典型实例是肌醇-六磷酸-3-磷酸水解酶。植酸酶可以获自微生物，例如真菌生物和细菌生物(例如曲霉菌属(Aspergillus)(例如，黑曲霉(A.niger)、土曲霉(A.terreus)和烟曲霉(A.fumigatus))、毁丝霉属(Myceliophthora)(嗜热毁丝霉(M.thermophila))、踝节菌属(Talaromyces)(嗜热踝节菌(T.thermophilus))、木霉属物种(Trichoderma spp)(里氏木霉(T.reesei))和丝孢菌属(Thermomyces)(参见例如，WO 99/49740))。而且植酸酶也可得自青霉属物种(Penicillium)(例如，大麦青霉(P.hordei)(参见例如，ATCC号22053)、桧状青霉(P.piceum)(参见例如，ATCC No.10519)或短密青霉(P.brevi-compactum)(参见例如，ATCC No.48944)(参见例如USP 6,475,762)。用于本发明的另外植酸酶可得自隔孢伏革菌属(Peniophora)、大肠杆菌、柠檬酸细菌属(Citrobacter)、肠杆菌属(Enterbacter)和布丘氏菌属(Buttiauxella)(参见例如，WO2006/043178，其提交于2005年10月17日)。用于本发明的另外植酸酶可以获自商业(例如(BASF)、P(Novozymes A/S)、(Danisco A/S，Diversa)和(AB Enzymes)。在一些实施方案中，用于本发明的植酸酶源自细菌布丘氏菌属物种。布丘氏菌属物种包括乡间布丘氏菌(B.agrestis)、布里纳氏布丘氏菌(B.brennerae)、费拉格布丘氏菌(B.ferragutiase)、伽瓦尼布丘氏菌(B.gaviniae)、伊查德氏布丘氏菌(B.izardii)、诺基亚布丘氏菌(B.noackiae)和瓦姆波德布丘氏菌(B.warmboldiae)。布丘氏菌属物种的菌株可得自DSMZ，the German National Resource Center for Biological Material(Inhoffenstrabe 7B，38124Braunschweig，Germany)。以保藏号NCIMB 41248保藏的布丘氏菌属物种菌株P1-29是特别有用的菌株的实例，植酸酶可以由其获得并根据本发明使用。布丘氏菌属的BP-wt和变体例如BP-17也可以用于本发明(参见美国专利申请12/027127，其于2008年2月6日提交)。本发明并不意在限于任何特定植酸酶，因为任何适宜的植酸酶均可用于本发明的方法。具有颗粒淀粉水解活性(GSHE)的酶
具有颗粒淀粉水解活性(GSHE)的酶能够水解颗粒淀粉，并且这些酶已从真菌、细菌和植物细胞中被回收，例如芽孢杆菌属物种(Bacillus sp.)、青霉属物种(Penicillium sp.)、腐质霉属物种(Humicola sp.)、木霉菌属物种(Trichoderma sp.)、曲霉菌属物种(Aspergillus sp.)、毛霉属物种(Mucor sp.)和根霉属物种(Rhizopus sp.)。在一些实施方案中，具有GSH活性的一组特定酶包括具有葡糖淀粉酶活性和/或α-淀粉酶活性的酶(参见Tosi等人，(1993)Can.J.Microbiol.39：846-855)。米根霉(Rhizopus oryzae)GSHE已在Ashikari等人，(1986)Agric.Biol.Chem.50：957-964和USP4,863,864中描述。灰腐质霉(Humicola grisea)GSHE已在Allison等人，(1992)Curr.Genet.21：225-229；WO 05/052148和欧洲专利号171218中描述。泡盛曲霉河内变种(Aspergillus awamori var.kawachi)GSHE已由Hayashida等人，(1989)Agric.Biol.Chem 53：923-929描述。Aspergillus shirousami GSHE已由Shibuya等人，(1990)Agric.Biol.Chem.54：1905-1914描述。
在一些实施方案中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性，并且源自灰腐质霉的菌株，特别是灰腐质霉高温变种的菌株(参见USP4,618,579)。在一些优选的实施方案中，具有GSH活性的腐质霉属酶将与WO 05/052148的SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在其它的实施方案中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性并且源自泡盛曲霉的菌株，特别是泡盛曲霉河内变种的菌株。在一些优选的实施方案中，具有GSH活性的泡盛曲霉河内变种酶将与WO 05/052148的SEQ ID NO：6的氨基酸序列具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在其它的实施方案中，GSHE可以具有葡糖淀粉酶活性并且源自根霉属的菌株，例如雪白根霉(R.niveus)或米根霉(R.oryzae)。源自雪白根霉Koji菌株的该酶以商品名“CU CONC”销售，或来自根霉属的该酶以商品名GLUZYME销售。
另一种具有葡糖淀粉酶活性的有用GSHE为SPIRIZYME Plus(Novozymes A/S)，其还包括酸性真菌淀粉酶活性。
在其它的实施方案中，GSHE可以具有α-淀粉酶活性并且源自曲霉菌属的菌株，例如泡盛曲霉、黑曲霉、米曲霉或河内曲霉(A.kawachi)的菌株，特别是河内曲霉的菌株。
在一些优选的实施方案中，具有GSH活性的河内曲霉酶将与WO 05/118800和WO 05/003311的SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
在一些实施方案中，具有GSH活性的酶为杂合酶，例如含有α-淀粉酶的催化结构域(例如黑曲霉α-淀粉酶、米曲霉α-淀粉酶或河内曲霉α-淀粉酶的催化结构域)和不同真菌α-淀粉酶或葡糖淀粉酶的淀粉结合结构域(例如河内曲霉或灰腐质霉的淀粉结合结构域)的酶。在其它的实施方案中，具有GSH活性的杂合酶可以包括葡糖淀粉酶的催化结构域，例如曲霉菌属物种、踝节菌属物种、Althea物种、木霉属物种或根霉属物种的催化结构域，和不同葡糖淀粉酶或α-淀粉酶的淀粉结合结构域。一些具有GSH活性的杂合酶在WO 05/003311、WO 05/045018；Shibuya等人，(1992)Biosci.Biotech.Biochem 56：1674-1675和Cornett等人，(2003)Protein Engineering 16：521-520中公开。a.葡糖淀粉酶
各种葡糖淀粉酶(GA)(E.C.3.2.1.3.)可作为GSHE和/或第二酶用于本发明。在一些实施方案中，可用于本发明的葡糖淀粉酶具有颗粒淀粉水解活性(GSH)或是一种已被工程化而具有GSH活性的变体。在一些实施方案中，GSH活性是有利的，因为该酶可以发挥作用以分解高粱或混合的高粱和/或其它谷物中颗粒淀粉中的更多淀粉。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶由细胞、植物和/或真菌内源性表达，但在某些替代性实施方案中，葡糖淀粉酶对宿主细胞(例如，细菌、植物和/或真菌)为异源性的。在一些实施方案中，用于本发明的葡糖淀粉酶由丝状真菌和酵母的数种菌株产生。例如，由曲霉菌属和木霉属的菌株产生的市售可得的葡糖淀粉酶可用于本发明。适合的葡糖淀粉酶包括天然存在的野生型葡糖淀粉酶及变体和遗传工程化的突变葡糖淀粉酶(例如杂合葡糖淀粉酶)。杂合葡糖淀粉酶包括，例如具有来自一种生物的GA(例如，踝节菌GA)的催化结构域和来自不同生物(例如，木霉GA)的淀粉结合结构域(SBD)的葡糖淀粉酶。在一些实施方案中，接头被包括在淀粉结合结构域(SBD)或催化结构域中。以下葡糖淀粉酶是可用于本发明的工艺中的葡糖淀粉酶的非限制性实例。黑曲霉G1和G2葡糖淀粉酶(参见例如Boel等人，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381、WO 00/04136和USP 6,352,851)；泡盛曲霉葡糖淀粉酶(参见例如，WO 84/02921)；米曲霉葡糖淀粉酶(参见例如，Hata等人，(1991)Agric.Biol.Chem.55：941-949)和Aspergillus shirousami.(参见例如，Chen等人，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Chen等人(1995)Prot.Eng.8：575-582；和Chen等人，(1994)Biochem J.302：275-281)。
另外的可用于本发明的葡糖淀粉酶还包括得自踝节菌属菌株(例如，埃默森踝节菌(T.emersonii)、T.leycettanus、T.duponti和嗜热踝节菌葡糖淀粉酶(参见例如，WO 99/28488；USP No.RE：32,153；USP No.4,587,215))；木霉属菌株(例如里氏木霉)的那些以及与在US专利公开号2006-0094080中公开的SEQ ID NO：4具有至少约80％、约85％、约90％和约95％序列同一性的葡糖淀粉酶；得自根霉属菌株(例如雪白根霉和米根霉)；毛霉属菌株和腐质霉属菌株((例如，灰腐质霉(参见例如，Boel等人，(1984)EMBO J.3：1097-1102；WO 92/00381；WO 00/04136；Chen等人，(1996)Prot.Eng.9：499-505；Taylor等人，(1978)Carbohydrate Res.61：301-308；USP.4,514,496；USP 4,092,434；USP 4,618,579；Jensen等人，(1988)Can.J.Microbiol.34：218-223和WO 2005/052148的SEQ ID NO：3))的那些。在一些实施方案中，用于本发明的葡糖淀粉酶与WO 05/052148的SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％和约99％序列同一性。其它用于本发明的葡糖淀粉酶包括得自Athelia rolfsii及其变体(参见例如，WO04/111218)和青霉菌属物种(参见例如，产黄青霉(Penicillium chrysogenum))的那些。
市售可得的用于本发明的葡糖淀粉酶包括但不限于L-400和GG9904X、GC480、G-ZYME 480、l-400(Danisco US，Inc，Genencor Division)CU.(Shin Nihon Chemicals，Japan)、GLUCZYME(Amano Pharmaceuticals，Japan(参见例如Takahashi等人，(1985)J.Biochem.98：663-671))。另外的可用于本发明的酶包括由根霉属物种产生的三种形式的葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3)，即“Gluc1”(MW 74,000)、“Gluc2”(MW 58,600)和“Gluc3”(MW 61,400)。本发明并不意在限于任何特定的葡糖淀粉酶，因为任何适合的葡糖淀粉酶均可用于本发明的方法。事实上，本发明并不意在限于这些具体陈述的葡糖淀粉酶和商品化酶。b.α淀粉酶
各种α淀粉酶可以作为GSHE和/或第二酶与植酸酶组合用于本发明的方法。在一些实施方案中，可用于本发明的α淀粉酶具有颗粒淀粉水解活性(GSH)或是已被工程化而具有GSH活性的变体。在一些实施方案中，GSH活性是有利的，因为这些酶可以发挥作用以分解颗粒淀粉底物中更多的淀粉。具有GSHE活性的α淀粉酶包括但不限于：得自河内曲霉(例如，AkAA)、黑曲霉(例如，AnAA)和里氏木霉(例如，TrAA)的那些。在一些实施方案中，α淀粉酶是酸稳定的α淀粉酶，其当以有效量加入时在3.0至7.0的pH范围内具有活性。
此外，在一些实施方案中，α淀粉酶可以是野生型α淀粉酶、其变体或片段、或杂合α淀粉酶，该杂合α淀粉酶可以源自例如来自一种微生物源的催化结构域和来自另一种微生物源的淀粉结合结构域。可与本发明混合物联合使用的其它α淀粉酶的非限制性实例是源自芽孢杆菌属(Bacillus)、曲霉菌属、木霉属、根霉属、镰刀菌属(Fusarium)、青霉属、链孢霉属和腐质霉属的那些。
这些淀粉酶中的一些是市售可得的，例如可从Novo NordiskA/S得到的120-L、LC和SC SAN和SC，Diversa的FL，以及可从Danisco，US Inc.，Genencor Division得到的L、FRED、ETHYL、GC626和G997。
本发明并不意在限于任何特定的α淀粉酶，因为任何合适的α淀粉酶均可用于本发明的方法。事实上，本发明并不意在限于具体述及的的α淀粉酶和商品化酶。非淀粉多糖水解酶
本发明的实施方案包括至少一种植酸酶、至少一种GSHE(AA和/或GA)和至少一种非淀粉多糖水解酶的组合物或混合物。非淀粉多糖水解酶是能够水解复杂碳水化合物聚合物例如纤维素、半纤维素和果胶的酶。例如，纤维素酶(内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶、β葡糖苷酶)、半纤维素酶(木聚糖酶)和果胶酶是非淀粉多糖水解酶。因此，在一些实施方案中，该组合物或混合物可以包括至少一种非淀粉多糖水解酶。在一些实施方案中，该组合物或混合物可以包括至少两种非淀粉多糖水解酶。在一些实施方案中，该酶组合物可以包括至少三种选自纤维素酶、木聚糖酶、半纤维素酶、β葡聚糖酶、β-葡糖苷酶和果胶酶的非淀粉多糖水解酶。例如，当该混合物用于各种应用(例如非蒸煮加工应用)时，可以包括一种或多种非淀粉多糖水解酶。可以在预处理步骤和/或发酵过程中与发酵微生物和其它组分一起使用根据本发明的混合物或组合物。
各种纤维素酶可用于根据本发明的方法。纤维素酶是水解纤维素(β-1，4-D-葡聚糖键)和/或其衍生物例如磷酸溶胀纤维素(phosphoric acid swollen cellulose)的酶组合物。纤维素酶包括外切纤维二糖水解酶(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)和β-葡糖苷酶(BG)(EC3.2.191，EC3.2.1.4和EC3.2.1.21)的分类。纤维素酶的实例包括来自青霉属、木霉属、腐质霉属、镰刀菌属、高温单孢菌属(Thermomonospore)、纤维单胞菌属(cellulomomas)、肉座菌属(Hypocrea)、梭菌属(Clostridium)、高温单孢菌属(Thermomonospora)、芽孢杆菌属、纤维单胞菌属和曲霉菌属的纤维素酶。销售用于饲料应用的、市售可得的纤维素酶的非限制性实例是β-葡聚糖酶如(Adisseo)、(BASF)、BGL(Danisco Genencor)和(AB Enzymes)。一些商品化纤维素酶包括可以使用描述于US20060193897A1中的纤维素酶和内切葡聚糖酶。β-葡糖苷酶(纤维二糖酶)将纤维二糖水解成单个的单糖。各种β葡聚糖酶可与植酸酶联合用于本发明。β葡聚糖酶(内切纤维素酶——酶分类EC 3.2.1.4)也称作内切葡聚糖酶I、II和III，是攻击纤维素纤维以释放较小的纤维素片段的酶，后者进一步被外切纤维素酶攻击而释放葡萄糖。β-葡聚糖酶也可以用于根据本发明的方法。用于本发明方法的商品化β-葡聚糖酶包括BG和TBG(Danisco，US Inc.Genencor Division)。本发明并不意在限于任何特定的β-葡聚糖酶，因为任何合适的β-葡聚糖酶均可用于本发明的方法。
很多纤维素酶已在科学文献中描述，其实例包括：来自里氏木霉：Shoemaker，S.等人，Bio/Technology，1：691-696，1983，公开了CBHI；Teeri，T.等人，Gene，51：43-52，1987，公开了CBHII；Penttila，M.等人，Gene，45：253-263，1986，公开了EGI；Saloheimo，M.等人，Gene，63：11-22，1988，公开了EGII；Okada，M.等人，Appl.Environ.Microbiol.，64：555-563，1988，公开了EGIII；Saloheimo，M.等人，Eur.J.Biochem.，249：584-591，1997，公开了EGIV；Saloheimo，A.等人，Molecular Microbiology，13：219-228，1994，公开了EGV；Barnett，C.C.，等人，Bio/Technology，9：562-567，1991，公开了BGL1；和Takashima，S.等人，J.Biochem.，125：728-736，1999，公开了BGL2。已经描述了来自木霉属之外的物种的纤维素酶，例如Ooi等人，1990，其公开了由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)产生的编码内切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；Kawaguchi T等人，1996，其公开了来自棘孢曲霉的编码β-葡糖苷酶1的cDNA的克隆和测序；Sakamoto等人，1995，其公开了来自河内曲霉IFO 4308的编码内切葡聚糖酶CMCase-1的cDNA序列；Saarilahti等人，1990，其公开了来自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovara)的内切葡聚糖酶；Spilliaert R等人，1994，其公开了bglA的克隆和测序，编码来自Rhodothermus marinu的耐热性β-葡聚糖酶；和Halldorsdottir S等人，1998，其公开了编码糖基水解酶家族12的耐热性纤维素酶的Rhodothermus marinu基因的克隆、测序和过表达。本发明并不意在限于任何特定的纤维素酶，因为任何合适的纤维素酶均可用于本发明的方法。事实上，本发明并不意在限于具体述及的纤维素酶和商品化酶。
半纤维素酶是分解半纤维素的酶。半纤维素包括各种各样比糖复杂但没有纤维素复杂的多糖，这些多糖存在于植物壁中。在一些实施方案中，木聚糖酶可在本发明方法中用作第二酶。任何合适的木聚糖酶均可用于本发明。木聚糖酶(例如内切-β-木聚糖酶(E.C.3.2.1.8))水解木聚糖主链，可以得自细菌来源(例如，芽孢杆菌属、链霉菌属、梭菌属、热酸菌属(Acidothermus)、小四孢菌属(Microtetrapsora)或高温单孢菌属(Thermonospora))或得自真菌来源(曲霉菌属、木霉属、脉孢霉属(Neurospora)、腐质霉属、青霉属或镰刀菌属(参见例如EP473545；USP5,612,055；WO 92/06209；和WO 97/20920))。用于本发明的木聚糖酶包括商品化制品(例如，和Y5(DaniscoGenencor)、WX(Novozymes A/S)和NATUGRAIN(BASF)。在一些实施方案中，木聚糖酶来自里氏木霉或是来自里氏木霉的变体木聚糖酶，或EP1222256B1中所述的固有耐热性木聚糖酶，以及来自黑曲霉、河内曲霉、塔宾曲霉(Aspergillus tubigensis)、环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)、短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、Neocallimastix patriciarum、青霉属物种、变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、热紫链霉菌(Streptomyces thcrmoviolaceus)、褐色高温单孢菌(Thermomonospora fusca)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、里氏木霉、绿色木霉(Trichoderma viridae)的其它木聚糖酶。第二酶(secondary enzyme)
第二酶包括但不限于：另外的葡糖淀粉酶、另外的α淀粉酶、另外的纤维素酶、另外的半纤维素酶、木聚糖酶、另外的蛋白酶、植酸酶、支链淀粉酶、β淀粉酶、脂肪酶、角质酶、另外的果胶酶、另外的β-葡聚糖酶、半乳糖苷酶、酯酶、环糊精转糖基转移酶(CGTases)、α半乳糖苷酶、糊精酶、β-淀粉酶和其组合。可以使用任何已知的或开发的另外的α淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、β葡聚糖酶和植酸酶，包括本文所公开的那些。
各种酸性真菌蛋白酶(AFP)可用于本发明的方法。酸性真菌蛋白酶包括例如，得自曲霉菌属、木霉属、毛霉属和根霉属，例如黑曲霉、泡盛曲霉、米曲霉和米黑毛霉的那些。AFP可以源自细菌、植物或真菌来源的异源性或内源性蛋白质表达。特别地，从木霉属菌株中分泌的AFP可用于本发明。合适的AFP包括天然存在的野生型AFP以及变体和遗传工程化的突变AFP。用于本发明的一些商品化AFP酶包括(Danisco US，Inc，Genencor Division)和200。
在一些实施方案中，用于本发明的酸性真菌蛋白酶将与SEQID NO：14(参见美国专利申请11/312,290，其于2005年12月20日提交)的氨基酸序列具有至少约85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％和99％序列同一性。本发明并不意在限于任何特定的酸性真菌蛋白酶，因为任何合适的酸性真菌蛋白酶均可用于本发明的方法。事实上，本发明并不意在限于具体述及的酸性真菌蛋白酶和商品化酶。
AFP之外的另外蛋白酶也可与本发明的混合物和/或组合物一起使用。可以使用任何合适的蛋白酶。蛋白酶可以源自细菌或真菌来源。细菌蛋白酶的来源包括来自芽孢杆菌属(例如，解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、缓慢芽孢杆菌(B.lentus)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的蛋白酶。示例性的蛋白酶包括但不限于枯草杆菌蛋白酶，例如可以得自解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶及其突变体(USP 4,760,025)。合适的商品化蛋白酶包括P 3000(Danisco Genencor)和FP(Shin Nihon)。合适的真菌蛋白酶的来源包括但不限于，例如木霉属、曲霉菌属、腐质霉属和青霉属。混合物/组合物
本发明的混合物和组合物包括至少一种植酸酶和α淀粉酶、葡糖淀粉酶(其中至少一种α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶是GHSE)，以及至少一种非淀粉多糖水解酶。在一些实施方案中，α淀粉酶和葡糖淀粉酶两者都是颗粒淀粉水解酶。非淀粉多糖水解酶可以选自纤维素酶、半纤维素酶、β葡糖苷酶和果胶酶。在一些实施方案中，用于非蒸煮应用的该混合物和/或组合物包括至少一种植酸酶、至少一种α淀粉酶(AA)、至少一种葡糖淀粉酶(GA)、至少一种纤维素酶和至少一种酸性真菌蛋白酶。在一些实施方案中，该混合物和/或组合物包括至少一种植酸酶、至少一种α淀粉酶(AA)、至少一种葡糖淀粉酶(GA)、至少一种纤维素酶、至少一种果胶酶、至少一种β葡聚糖酶、至少一种β-葡糖苷酶和至少一种酸性真菌蛋白酶(AFP)。这些酶组分可以以含有混合在一起的两种或两种以上的酶组分的混合制剂形式使用，或酶组分可以在工艺步骤中单个地加入以产生本发明的组合物。可以在发酵的步骤中使用本发明的组合物，以便维持本发明制剂。这可以包括按时间加入组合物的个体组分以便维持制剂，例如同时加入这些组分。
植酸酶可以以有效减少DDGS和/或稀酒糟中的植酸的量提供。在一些实施方案中，植酸酶以有效增加肌醇和/或磷酸的量加入。在一些实施方案中，植酸酶的量为至少0.01FTU/g DS，包括至少0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、1.9、2.0、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95和100FTU/g DS。在一些实施方案中，植酸酶以约0.01FTU/g DS至约100FTU/g DS或以上的量加入。在一些实施方案中，植酸酶以约2.0至约50FTU/g DS加入。在一些实施方案中，植酸酶以约1至约10FTU/g DS加入。
本发明的混合物和组合物包括至少一种植酸酶。在一些实施方案中，植酸酶与至少一种AA、至少一种GA(其中该至少一种AA和/或至少一种GA具有颗粒淀粉水解活性)和至少一种非淀粉多糖水解酶组合使用。在其它的实施方案中，该颗粒淀粉水解酶是葡糖淀粉酶和α淀粉酶。在其它的实施方案中，本发明的混合物或组合物包括至少一种植酸酶、至少一种具有GSH活性的α淀粉酶、至少一种具有GSHE的葡糖淀粉酶、至少一种纤维素酶和至少一种其它非淀粉多糖水解酶。
可以与植酸酶组合使用的、含有GHSE葡糖淀粉酶和GSHEα淀粉酶的组合物为STARGENTM 001，其为酸稳定性α淀粉酶和葡糖淀粉酶的混合物(从Danisco US，Inc.，Genencor Division市售可得)。可以向其中加入本文所公开的其它酶。
在一些实施方案中，GSHE是α淀粉酶，并且接触步骤和/或发酵步骤中的有效剂量为0.01至15SSU/g DS；0.05至10SSU/g DS；0.1至10SSU/g DS；以及0.5至5SSU/g DS。
在一些实施方案中，接触步骤和/或发酵步骤中的葡糖淀粉酶的有效剂量为0.01至15GAU/g DS；0.05至10GAU/g DS；0.1至10GAU/gDS，甚至0.5至5GAU/g DS。E.高粱
从农艺学上来讲，高粱是用于高粱属植物的通用名。特别感兴趣的品种是收籽高粱。在世界各地高粱也称为稷(millet)和milo。
使用常规工艺从碾碎的玉米生产乙醇的大多数工厂平均具有92％发酵效率。高粱的发酵效率低得多。当评价高粱作为乙醇生产的发酵原料时，多种因素可以影响发酵产量和可消化性。参考表1，其中列出了某些因素。从不溶性淀粉生产可溶性糊精的常规工艺包括在耐热性α淀粉酶的存在下将磨碎的整个谷粒或淀粉料浆加热至95℃以上用于液化，然后冷却，调节pH，之后在葡糖淀粉酶和酵母的存在下发酵而转化为乙醇。然而，使用这种工艺，与玉米相比，高粱的较低发酵效率导致较低的醇产量(参见例如，Enzeogen等人2005，J.Cereal Sci.42：33-44；和Duodu等人；2004，J.Cereal Sci.38：117-131)。而且已知，高粱在动物中的可消化性与玉米相比更差，尤其是在高粱暴露于在高温/高压喷射蒸煮过程中遇到的升高的温度之后(参见例如，Duodu等人2004，同上引文)。
可以比较不同商品化面粉的植酸含量(mg/g)(参见表2，采自“Phytic acid content in milled cereal products and breads(碾碎的谷类产品和面包中的植酸含量)”，Carcia-Estepa等人1999，Food Research Intl 32：217-221)。表2：商品化面粉的植酸含量 面粉 量(植酸mg/谷粒g) 大麦 6.32 玉米 10.78 黍 10.64 燕麦 7.44 稻 5.52 黑麦 4.52 高粱 10.12 小麦 4.04 全麦 22.20
表2显示玉米、黍和高粱面粉含有约10mg/g植酸。麸皮中植酸的值通常比谷粒的胚乳中的高。一些谷粒含有天然存在的植酸酶，其可能被用于去除至少一些植酸。这些包括黑麦、小麦麸皮、小麦和大麦。然而，玉米、高粱和稻含有低于20植酸酶单位/Kg(参见例如，Ravindran，V.；Bryden，W.L.；Kornegay，E.T.1995.Phytates：occurrence，bioavailability and implications in poultry nutrition(植酸盐：发生、生物利用度和家禽营养中的问题).Poultry and Avian Biology Reviews，6(2)，125-143)。因此，高粱含有大量的植酸，并且具有非常低的植酸酶活性以消化该植酸。F.使用方法
在一些实施方案中，待加工的高粱与水溶液混合以获得料浆。该水溶液可以例如从水、稀酒糟和/或回流物(backset)获得。在一些实施方案中，料浆具有5-60％；10-50％；15-45％；15-30％；20-45％；20-30％和25-40％的DS。
在一些实施方案中，料浆在发酵中与酶混合物或组合物接触。在一些实施方案中，料浆在预处理中以及在发酵前与酶混合物或组合物接触。在一些实施方案中，在预处理中以及在发酵中均加入酶混合物和/或组合物。可以单剂量地或分剂量地使料浆与至少一种植酸酶、至少一种GSHE、至少一种非淀粉多糖水解酶和/或本发明的酶混合物或组合物接触，只要维持酶制剂即可。因此，分剂量意味着将所需制剂中的总剂量分一个以上的部分(包括两个部分或三个部分)加入。在一些实施方案中，在开始时加入总剂量的一部分，并在工艺中的特定时间加入第二部分。在一些实施方案中，该剂量的至少一部分以预处理形式加入。在一些实施方案中，本发明的酶混合物或组合物中的至少一种酶可以固定在柱或固体基质上。
酶混合物或组合物可以在预处理和/或发酵步骤中在低于高粱中颗粒淀粉的糊化温度的温度加入。在一些实施方案中，在发酵步骤中在有助于发酵生物发酵的温度例如20-40℃加入酶混合物和/或组合物。或者，预处理可以在低于高粱的淀粉糊化温度的温度进行。在一些实施方案中，该温度为20℃至90℃；在其它的实施方案中，该温度保持在50℃至77℃；55℃至77℃；60℃至70℃、60℃至65℃；55℃至65℃和55℃至68℃。在另外的实施方案中，该温度为至少45℃、48℃、50℃、53℃、55℃、58℃、60℃、63℃、65℃和68℃。在其它的实施方案中，该温度不超过65℃、68℃、70℃、73℃、75℃和80℃。
在一些实施方案中，如果预处理在低于高粱的糊化温度但高于发酵生物的发酵温度的温度进行，那么在加入发酵生物.之前降低温度。
预处理和/或发酵可以在3.5至7.0的pH范围；还有在3.5至6.5的pH范围；还有在4.0至6.0的pH范围进行，在一些实施方案中，在4.2至5.5的pH范围进行。在一些实施方案中，预处理在最接近于酶混合物和/或组合物中的一种或多种酶的最适pH的pH进行。
在一些实施方案中，预处理过的糖蜜用发酵微生物进行发酵。在一些实施方案中，接触步骤(预处理)和发酵步骤可以在同一反应容器中同时进行或相继进行。一般而言，发酵工艺如The Alcohol Textbook第3版，A Reference for the Beverage，Fuel and Industrial Alcohol Industries，Jacques等人编辑，(1999)Nottingham University Press，UK中描述。
料浆可以在预处理和/或发酵步骤中与酶混合物和/或组合物保持接触5分钟至120小时的时间；以及5分钟至66小时、5分钟至24小时的时间。在一些实施方案中，该时间段为15分钟至12小时、15分钟至6小时、15分钟至4小时，还有15分钟至2小时。在某些实施方案中，如果有预处理步骤，则预处理和发酵组合进行5分钟至120小时的时间，包括任何上述范围。
在一些实施方案中，料浆用发酵微生物进行发酵。在一些实施方案中，该发酵生物为酵母。在发酵过程中，高粱中的可发酵糖(糊精，例如葡萄糖)在合适的发酵条件下被用于微生物发酵，以获得终产物，例如醇(例如乙醇)、有机酸(例如琥珀酸、乳酸)、糖醇(例如丙三醇)、抗坏血酸中间体(例如，葡糖酸、DKG、KLG)和氨基酸(例如赖氨酸)。
在一些实施方案中，在15至40℃、20至38℃和25至35℃的温度；在pH 3.0至6.5、pH 3.0至6.0；pH 3.0至5.5、pH 3.5至5.0和pH 3.5至4.5的pH，用酵母发酵可发酵糖5小时至120小时、优选12至120、更优选24至90小时的时间，以生产醇产物，优选乙醇。
酵母细胞通常以每ml发酵肉汤104至1012个、优选107至1010个存活酵母数的量供应。除发酵微生物(例如酵母)之外，发酵将包括营养物、任选地酸和酶。在一些实施方案中，除上述的原料之外，发酵培养基将包含补充剂，包括但不限于维生素(例如生物素、叶酸、烟酸、核黄素)、辅因子以及常量营养物与微量营养物和盐(例如(NH4)2SO4；K2HPO4；NaCl；MgSO4；H3BO3；ZnCl2；和CaCl2)。
在一些实施方案中，除上述的原料之外，发酵培养基将包括补充剂，包括但不限于维生素(例如生物素、叶酸、烟酸、核黄素)、辅因子以及常量营养物与微量营养物和盐(例如(NH4)2SO4；K2HPO4；NaCl；MgSO4；H3BO3；ZnCl2；和CaCl2)。G.醇、DDGS和其它终产物的回收
在一些实施方案中，本发明发酵工艺的终产物是醇产物(例如乙醇或丁醇)。在一些实施方案中，根据本发明的方法所生产的终产物可以从发酵培养基中分离和/或纯化。本领域已知用于分离和纯化的方法，包括方法例如对培养基进行提取、蒸馏和柱色谱。在一些实施方案中，通过将培养基进行高效液相色谱(HPLC)分析，直接鉴定终产物。
在另外的实施方案中，终产物例如醇和固体可以通过离心来回收。在一些实施方案中，醇通过方法例如蒸馏和分子筛脱水或超滤来回收。在一些实施方案中，乙醇用于燃料、便携(portable)或工业乙醇。
在另外的实施方案中，终产物可以包括发酵副产品，例如干酒糟(DDG)和干酒糟加可溶物(DDGS)，其可以用作动物饲料。在一些实施方案中，酶组合物可以减少发酵肉汤的植酸含量，稀酒糟的植酸盐含量和/或发酵副产品例如干酒糟(DDG)；含可溶物的干酒糟(DDGS)；湿酒糟(DWG)和含可溶物的湿酒糟(DWGS)的植酸含量。在一些实施方案中，与无植酸酶的基本上相同工艺相比，本发明的方法(包括但不限于例如孵育30至60分钟)可以使所得发酵滤液的植酸含量减少至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％和至少约90％以及更多。在一些实施方案中，和来自与本发明工艺基本上相同、但是没有本发明的植酸酶预处理孵育的相应工艺的DDGS中的植酸含量相比，存在于DDGS中的植酸的量可以减少至少约50％、至少约70％、至少约80％和至少约90％。例如，尽管商品化DDGS样品中的植酸含量％可以变化，但一般的植酸％范围可以为约1％至约3％或更高。在一些实施方案中，获自本工艺的DDGS中的植酸％将少于约1.0％、少于约0.8％和少于约0.5％。在一些实施方案中，在制粒之前或之后DDGS可以加至动物饲料中。在一些实施方案中，DDGS可以包括活性植酸酶。在某些实施方案中，具有活性植酸酶的DDGS可以加至动物饲料中。
在某些工业乙醇工艺中，从滤液中蒸馏乙醇，产生适于再循环到发酵流中的稀酒糟部分。本发明自类似方法产生稀酒糟，但是与来自和本发明工艺基本上相同的相应工艺的稀酒糟的植酸含量相比，该稀酒糟具有较低的植酸含量。在一些实施方案中，植酸的减少是因为植酸酶预处理孵育步骤。在一些实施方案中，在糖化和/或糖化/发酵步骤中加入植酸酶。在一些实施方案中，与基本上相同但没有植酸酶的工艺相比，本发明的方法(包括但不限于例如，作为预处理或在SSF中孵育30至60分钟)可以使所得稀酒糟的植酸含量减少至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％和90％以及更多。在一些实施方案中，和来自与本发明工艺基本上相同、但是没有根据本发明的植酸酶预处理孵育的相应工艺的稀酒糟中的植酸含量相比，存在于本发明稀酒糟中的植酸量可以减少至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％和至少约90％。
在另外的实施方案中，通过使用本领域中已知的适宜的发酵微生物，发酵终产物可以包括但不限于乙醇、丙三醇、1，3-丙二醇、葡糖酸、2-酮基-D-葡糖酸、2，5-二酮基-D-葡糖酸、2-酮基-L-古洛糖酸、琥珀酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更尤其是当乳酸是所需终产物时，可使用乳杆菌属物种(Latobacillus sp.)(干酪乳杆菌(L.casei))；当丙三醇或1，3-丙二醇是所需终产物时，可使用大肠杆菌；且当2-酮基-D-葡糖酸、2，5-二酮基-D-葡糖酸和2-酮基-L-古洛糖酸是所需终产物时，可使用柠檬泛菌(Pantoea citrea)作为发酵微生物。以上列表仅是实例，本领域技术人员将知道可适用于获得所需终产物的许多发酵微生物。实验
在以下实施例中进一步详细描述了本发明，这些实施例不以任何方式意欲限制所要求保护的本发明的范围。附图意指被认为是说明书和本发明描述的一个部分。所引用的所有参考文献为了本文所描述的全部而明确并入本文作为参考。提供以下实施例来举例说明，但不限制所要求保护的发明。
在随后的公开内容和实验部分，使用了下面的缩写：％w/w(重量百分比)；℃(摄氏度)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；dIH2O(去离子水，Milli-Q过滤)；g或gm(克)；μg(微克)；mg(毫克)；kg(千克)；μl(微升)；mL和ml(毫升)；mm(毫米)；μm(微米)；M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；U(单位)；MW(分子量)；sec(秒)；min(s)(分钟)；hr(s)(小时)；DO(溶解氧)；W/V(重量与体积之比)；W/W(重量与重量之比)；V/V(体积与体积之比)；Genencor(Danisco US Inc，Genencor Division，Palo Alto，CA)；Ncm(牛顿厘米)、ETOH(乙醇)；Eq(当量)；N(标准)；ds或DS(干固体含量)MT(公吨)。
在下面实施例中，所使用的材料和方法为：
全谷粒的淀粉含量测定将谷粒与MOPS缓冲液(50mM，pH7.0)加氯化钙(5mM)混合，用乙酸溶液(2N)氢氧化钠(2N)调节pH；如下制备乙酸盐缓冲液(pH 4.2)：将200ml 2N乙酸加至500ml水。使用标准化的pH计，将2N氢氧化钠加至该混合物中直至缓冲液为4.2±0.05。加入FRED(Genencor International，来自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶)和L-400(Genencor International，来自黑曲霉的葡糖淀粉酶)，淀粉含量通过HPLC测定。
通过高效液相色谱(HPLC)分析碳水化合物和醇：寡糖反应产物的组成通过HPLC测量(Beckman System Gold 32Karat Fullerton，配有HPLC柱的CA(Rezex 8u8％H，Monosaccharides)，温度保持在50℃，配备折射率(RI)检测器(ERC-7515A RI Detector，Anspec Company Inc.)。糖根据分子量进行分离。将单糖命名为DP1，例如葡萄糖；将二糖命名为DP2，例如麦芽糖；将三糖命名为DP3，例如麦芽三糖，命名“DP4+”是聚合度(DP)为4或更大的寡糖。
α-淀粉酶活性(AAU)可以通过淀粉水解速率测定，反映为分光光度计测量的碘染色能力的下降速率。细菌α-淀粉酶活性的一个AAU是在标准条件下每分钟水解10mg淀粉所需的酶量。
α-淀粉酶活性也可以以可溶性淀粉单元(SSU)的形式确定，其基于等份的酶样品在pH 4.5、50℃水解可溶性马铃薯淀粉底物(4％DS)的程度。还原糖含量使用DNS方法测定，如Miller，G.L.(1959)Anal.Chem.31：426-428中所述。
葡糖淀粉酶活性单位(GAU)通过使用PNPG测定法测量葡糖淀粉酶活性而确定。GAU被定义为在pH 4.2和60℃每小时自可溶性淀粉底物生产1g还原糖(按葡萄糖计算)的酶量。
发酵效率是采用所述以下公式(Yeast to Ethanol，1993，5，第2版，241-287，Academic Press，Ltd.)，与来自产葡萄糖底物(即实际淀粉)的理论乙醇重量相比所生产的乙醇实际重量的百分比。考虑基于干重的总淀粉含量、发酵过程中淀粉通过酶促水解向可发酵糖的转化、以及由淀粉至葡萄糖的化学谷粒。
例如，1吨12％含水量的高粱含有880Kg干高粱。特定重量的高粱的淀粉含量为64.5％(干重)或567.6Kg淀粉。将567.6Kg干淀粉完全水解产生624.36Kg葡萄糖(由于水解导致11％化学谷粒)。自葡萄糖的理论醇产量为52.1％，因此得到318.42Kg乙醇或404.66升。已报导，使用常规非蒸煮工艺，高粱发酵效率通常为86％至88％.()。
植酸酶活性(FTU)通过无机磷酸盐的释放来测定。无机磷酸盐与酸性钼酸盐/钒酸盐试剂形成黄色络合物，该黄色络合物在415nm波长用分光光度计测量，通过磷酸盐标准曲线定量释放的无机磷酸盐。1单位植酸酶(FTU)是在按照欧洲标准(CEN/TC 327，2005-TC327WI 003270XX)给出的反应条件下，每分钟由植酸盐释放1微摩尔无机磷酸盐所用的酶量。
测定植酸含量的硝酸钍方法-该方法利用以下事实，即植酸和钍离子以1∶2的比率在pH＝1.6～3.5溶液中螯合。用标准硝酸钍滴定植酸，过量钍离子通过在加入指示剂二甲酚橙之后的变色(粉红)而测定。所用试剂为0.02mol/L标准硝酸钍溶液(硝酸钍：AR，来自北京镧创新公司(Beijing lanthanum innovation company))、0.02mol/L标准EDTA-2Na溶液和0.1％二甲酚橙指示剂。操作如下：1.该溶液在0.02mol/L标准EDTA-2Na溶液中用硝酸钍标定。然后将0.100g样品(如果样品中的植酸含量低，则使用更高的量)溶解于30～50ml纯化水中，用0.2mol/L HNO3调节pH至pH＝1.9～2.2。将含有样品的溶液加热至60℃，加入2～3滴0.1％二甲酚橙。用硝酸钍快速滴定溶液，通过颜色由黄色变为粉红色且粉红色在30秒内不消失来确定终点。如下确定植酸含量：M：标准硝酸钍溶液浓度，mol/LV：标准硝酸钍溶液的滴定体积，mlm：样品重量，g660：植酸摩尔质量，g/mol1/2：植酸与硝酸钍的螯合比率材料-
因此，在一些实施方案中，本发明公开了由植酸酶和其它酶例如上面所述的那些酶组成的制剂，所述制剂可以用于提高在非蒸煮工艺中高粱发酵的乙醇产量并且减少由该工艺所生产的DDGS中的植酸的量。
材料-酶——在实施例中使用下述酶：布丘氏菌属植酸酶(BP-17)、STARGEN 004、STARGEN 001，所有酶均得自Danisco US，Inc.Genencor Division。
实验-如实施例1中所述，用不同DS、粒径进行发酵。在一个典型的实验中，使有壳或无壳的高粱通过30目筛而对其进行100％选择。
使用SARTORIUS AG GOTTINGEN MA 30-000V3天平(Germany)测量这些谷粒的水分含量。在每个烧瓶中，取55-60克(基于水分含量)原料和145或140克自来水，然后加入400ppm尿素(基于DS)。使用26％硫酸将料浆的pH调节至pH 4.2。基于ds，以0.7GAU/g.ds加入STARGEN 001(Genencor，Danisco，USA)。然后用0.4％(基于DS)干Angel酵母(Hubei Angel Yeast Co.，Ltd)对烧瓶进行接种。在低速搅拌下、在30℃水浴中连续混合发酵培养基。于66～67小时时终止发酵，用HPLC分析2ml发酵肉汤上清液，用100ml全肉汤进行蒸馏，使用来自约66至～67小时的发酵罐肉汤样品测定残留淀粉含量。
发酵肉汤分析的HPLC方法-Agilent 1100，柱规格：BIO-RADAminex HPX-87H或Rezex RoA-有机酸。分析方法：ESTD。分析细节：流动相：0.005mol/L H2SO4。取出样品，稀释10倍，使用0.45μm滤膜过滤。HPLC的其它细节：注射体积：20μL；泵流量：0.6ml/min；柱恒温器温度：60℃；RID，光学元件温度：35℃。分析方法：ESTD。
使用上面的硝酸钍测定法来确定植酸量。实施例1植酸酶对无壳红高粱的作用
使用FOSS 1093研磨机将购自中国无锡当地超市(Wuxi Darunfa，China)的去壳红高粱(也称为白高粱)磨碎，然后使其通过网筛进行100％筛选以产生30目粉末。将142.8g水加至57.2g高粱粉末产生料浆。以0.4％干重加入酵母。也以400ppm加入尿素至约5.0或更低的pH。以2.2FTU/g DS、8.8FTU/g DS或22FTU/g DS加入BP-17植酸酶。如表3所示加入三种剂量的植酸酶。对照不含植酸酶。也以2000SSU AA和400GAU GA加入STARGEN 001(α淀粉酶(AA)和葡糖淀粉酶(GA))。在500ml埃伦迈厄(Erlenmeyer)烧瓶中进行发酵，以150rpm的搅拌速度在30℃浴器中孵育。于66小时时终止发酵，采集发酵肉汤的样品用于HPLC分析。对发酵全肉汤进行蒸馏以计算每公吨高粱的乙醇产量。发酵的结果示于表3。在表中，给出就1MT高粱到95.5％乙醇(L)(在20℃)而言的乙醇产量。当使用常规方法来蒸馏乙醇时，95.5％是可以在20℃实现的最大量。表中使用的缩写如下：Gluc(葡萄糖)；Fruc(果糖)；Suc acid(琥珀酸)；Lac acid(乳酸)；Glyc(丙三醇)；EtOH(乙醇)。表3：植酸酶对中国无锡去壳红高粱的作用：表3的数据是针对实验1的。然而，进行了许多不同的实验，均显示就去壳红高粱而言，在植酸酶的存在下产量从约4.5％增至约8.7％。实施例2植酸酶对有壳红高粱的作用
使用FOSS 1093研磨机将来自澳大利亚的有壳红高粱磨碎，然后使其通过30目或60目筛进行筛选以获得30目或60目粉末。高粱的水分为12.42％且淀粉含量为64.8％。将27.4克高粱与92.6克水混合，制得料浆。将植酸酶(Danisco US，Inc，Genencor Division)与用于实施例1的AA和GA组合加至发酵液中。对照不含植酸酶。如实施例1所述进行发酵。结果示于表4。在表中，给出就1MT高粱到95.5％乙醇(L)(在20℃)而言的乙醇产量。当使用常规方法蒸馏乙醇时，95.5％是可以在20℃实现的最大量。表中使用的缩写如下：Gluc(葡萄糖)；Fruc(果糖)；Suc acid(琥珀酸)；Lac acid(乳酸)；Glyc(丙三醇)；Acet acid(乙酸)；EtOH(乙醇)。样品1、2、5、6、9和10使用60目高粱进行。样品3、4、7、8、11和12使用30目高粱进行。表4植酸酶对澳大利亚红高粱的作用：
表4的数据是针对单一实验的。然而，多个实验的结果均显示，就带壳红高粱而言，产量的增加是不同的，但是通常在约2.0％至约7.8％的范围内。上面实验仅测试了单剂植酸酶。实施例3植酸酶剂量
为了确定最佳的植酸酶剂量，使用一系列植酸酶剂量(从4.4FTU/g DS植酸酶至44FTU/g DS植酸酶)对实施例1的高粱进行测试。如实施例1所述进行发酵。表5提供了数据，显示所有剂量均导致乙醇产量增加，但44FTU/g植酸酶给出最高产量。不限于特定理论，通过植酸酶去除植酸的磷酸基团而产生肌醇，已经显示肌醇在酵母生理学中、特别是在细胞膜结构组分的合成中起主要作用。例如，肌醇对酵母菌属物种(Saccharomyces sp.)的磷脂、细胞生长、乙醇生产和乙醇耐受性的影响是非常有益的(参见例如，Chi等人1999，J.Industrial Micro.and Biotechnol.，22：58-63)。这是因为肌醇有助于合成，其导致磷脂酰肌醇含量增加。第二，高磷脂酰肌醇含量使酵母更快速地生产乙醇并且耐受更高浓度的乙醇。因此，植酸的降解具有很多有益作用，其导致发酵效率增加和乙醇产量增加。表5实施例4第二酶的作用：BLEND F
使用来自澳大利亚当地超市的白高粱(去壳红高粱)来鉴定第二酶对高粱的影响。使用FOSS 1093研磨机将高粱磨碎，然后使其通过30目筛。如实施例1中所述对所得30目粉末进行发酵。对发酵全肉汤进行蒸馏以计算每公吨高粱的乙醇产量。结果示于表6。在表中，给出了就1MT高粱到95.5％乙醇(L)(在20℃)而言的乙醇产量。当使用常规方法来蒸馏乙醇时，95.5％是可以在20℃实现的最大量。表中使用的缩写如下：Gluc(葡萄糖)；Fruc(果糖)；Suc acid(琥珀酸)；Lac acid(乳酸)；Glyc(丙三醇)；Acet acid(乙酸)；EtOH(乙醇)。表6：有和无FERMGEN的BLEND F的作用
对照STARGEN 001是AA和GA的混合物。BLEND F是GSHEα淀粉酶(SSU2000)、β-葡糖苷酶(BLGU 160)、GSHE葡糖淀粉酶(GAU 400)和来自布丘氏菌属物种的BP-17植酸酶(FTU 2500)的混合物。在加入和未加入3ppm酸性真菌蛋白酶(FERMGEN)的情况下对BLEND F进行测试。表6中的结果显示，当将第二酶加至AA和GA时，所生产的乙醇量增加。当将AFP加至混合物中时，与不含AFP的混合物相比，乙醇量增加。因此，与单独AA和GA相比，加入β葡糖苷酶和植酸酶，增加了乙醇产量。在所有情况下，％DP-3％w/v为0。实施例5DDGS和稀酒糟中的植酸含量
为了鉴定DDGS和稀酒糟中的植酸的减少，收集来自实施例2(有壳红高粱)的DDGS和稀酒糟，植酸含量通过硝酸钍测定法来测定(参见上文的方法部分)。结果示于表7。发酵“前”柱是针对红高粱原料的。“有植酸酶”表示在发酵过程中包括植酸酶。“无植酸酶”表示在发酵过程中不包括植酸酶。％是指植酸w/w干基的量(经水分校正后)。饼对应于DDGS。表7：DDGS中的植酸
表7中的数据显示饼中植酸的量大幅下降(约50％)。稀酒糟中的下降较少，但是仍有效减少了待重新加回料浆中的稀酒糟中的植酸。实施例6高粱和玉米混合谷粒的发酵
使用FOSS 1093研磨机将来自澳大利亚的红高粱(Enzyme Solutions，Australia)和来自BBCA的玉米(BBCA，China)磨碎，然后分别过30或40目筛。如表8所示，制得玉米和高粱的不同比率的混合物。制备28％和32％DS料浆，用26％稀硫酸调节pH。将实施例4中的酶制剂和0.4％干重的酵母一起加至料浆中。就28％DS而言，于67小时时终止发酵。就32％DS料浆而言，于93小时时终止发酵。蒸馏后，在60℃烘箱中对全肉汤釜馏物进行烘焙以得到干饼，其用于干法RS分析。在发酵结束时，取样并通过HPLC分析(表9)和蒸馏分析(表10)两种方法来检查。
对发酵全肉汤进行蒸馏以计算每公吨高粱的乙醇产量。结果示于表10。在表中，给出就1MT高粱到95.5％乙醇(L)(在20℃)而言的乙醇产量。当使用常规方法来蒸馏乙醇时，95.5％是可以在20℃实现的最大量。表中使用的缩写如下：Gluc(葡萄糖)；Fruc(果糖)；Suc acid(琥珀酸)；Lac acid(乳酸)；Glyc(丙三醇)；Acet acid(乙酸)；EtOH(乙醇)。表8：表10：蒸馏和采用权重法计算
表9和表10的结果显示，对于高粱和玉米的混合物，发酵工艺非常有效。实施例7比较使用高粱的热蒸煮工艺和非蒸煮工艺
将本发明乙醇发酵中高粱的发酵效率与使用STARGEN 001由高粱生产乙醇的常规热蒸煮工艺相比较。将该工艺与使用STARGEN001的非蒸煮工艺相比较。该新非蒸煮工艺使用实施例4的混合物BLENDF。下面进一步阐述每种工艺。
常规热蒸煮工艺包括：首先将高粱碾碎成特定的粒径(＜1.0mm)，然后在不进一步分离谷粒的各组分的情况下加工。碾碎的高粱可以与新鲜水和/或稀酒糟(10-50％(作为料浆)补水)和/或冷凝水混合，以产生含有25％至45％干固体(ds)含量的醪液。可以使用稀氢氧化钠或氨水将pH调节至pH 5.8～6.0，并且进一步接受下列高温液化工艺之一：1)没有喷射蒸煮的单剂酶添加，2)喷射蒸煮加分剂量酶添加。在单剂酶添加工艺中，加入耐热性α淀粉酶，将料浆在高温85-90℃蒸煮120至180时间。然后将温度降至32℃，接着在发酵之前用稀硫酸将pH降至低于5.0。但是在分剂量酶添加和喷射蒸煮液化工艺中，将耐热性α淀粉酶加至料浆中，在85℃孵育20-45分钟，然后使其通过温度维持在200-225°F的喷射蒸煮器，保持3至5分钟，以完成颗粒淀粉的糊化。然后将糊化的淀粉料浆快速转到大气压，温度保持在约85℃。接着加入第二剂耐热性α淀粉酶，保持另外的90～120分钟，从而完成淀粉的液化。高温还降低醪液的微生物污染高风险。细菌来源的耐热性α淀粉酶可以来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)。例如，使用SPEZYMETM FRED、SPEZYME Xtra(来自Danisco US，Inc，Genencor Division)、TermamylTM SC或TermamylTM SUPRA(来自Novozymes)首先将淀粉在＞95℃的高温和pH 5.4-6.5液化成低DE(葡萄糖当量)可溶性淀粉水解物。液化后，使用稀硫酸将醪液的pH降至4.2～4.5，然后在发酵前冷却至32℃。
对于热蒸煮工艺与非蒸煮工艺的比较，使用FOSS 1093研磨机将来自澳大利亚的整粒红高粱(12.42％水分，64.8ds)碾碎，然后使其通过30目筛进行筛分以获得小于30目的面粉，等分碾碎的高粱面粉(27.4克)。将磨碎的高粱与92.6克水混合，制得含有24％ds高粱的料浆。使用STARGENTM001和本发明的酶混合物即实施例4的Blend F进行非蒸煮酵母发酵实验。在常规热蒸煮工艺中，将SPEZYMETM XTRA(α淀粉酶，来自Danisco US，Inc，Genencor division)以0.4kg/T的剂量加至料浆中，用20％硫酸将pH调至5.6，加热混合物直至110℃，保持10分钟，然后冷却至95℃。加入另外剂量的SPEZYMETM Xtra，继续液化另外的90分钟，从而完成水解。将液化物冷却至32℃，转移至500ml埃伦迈厄烧瓶中，以1.0kg/T加入葡糖淀粉酶(GA-L NEW-Danisco US，Inc，Genencor Division)，并以0.4％干物质的剂量加入活干酵母(Angel，China)，为调节pH以400ppm加入尿素(Mingfeng，China)。在温和搅拌下于32℃进行发酵。使用HPLC对72℃的发酵肉汤进行乙醇产量的分析，并在真空蒸发器中蒸馏以计算每公吨高粱的乙醇产量。表11本发明的高粱发酵效率与常规热蒸煮及STARGENTM 001工艺的比较整粒高粱-淀粉含量：-64.8％ds；水分含量-11.4％。
表11中的数据显示，使用含有非淀粉水解酶、植酸酶和蛋白酶以及葡糖淀粉酶(GSHE)和α淀粉酶的酶组合物，本发明的发酵效率显著增加。与仅使用AA和GA的非蒸煮工艺相比，当使用BLEND F时乙醇产量和发酵效率均增加。与使用AA和GA的常规工艺相比，当使用BLENDF时乙醇产量和发酵效率也均增加。
在上文说明书中提及的所有出版物和专利并入本文作为参考。对于本领域技术人员来说，在不背离本发明的范围和精神下、对本发明的描述方法和系统的各种修改和变化将是显而易见的。尽管结合特定的优选实施方案对本发明进行描述，但是应理解，本发明不应当不恰当地限于这些特定的实施方案。