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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410179291.5 (22)申请日 2014.04.30 CCTCC NO ： M 2014090 2014.03.14 C12N 1/14(2006.01) C12N 9/42(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道 1800 号江南大学食品科学与技术国家 重点实验室 (72)发明人 江波 张涛 周林芳 沐万孟 缪铭 (74)专利代理机构 无锡市大为专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32104 代理人 时旭丹 刘品超 CN 12823。
2、77 A,2001.01.31, WO 0214540 A1,2002.02.21, IT 1374382 B,2010.05.10, AU 2001294362 A8,2005.09.15, EP 1556500 A1,2005.07.27, CN 1248287 A,2000.03.22, (54) 发明名称 一株丝枝霉菌株及其生产 - 葡萄糖苷酶的 方法 (57) 摘要 一株丝枝霉菌株及其生产 - 葡萄糖苷酶 的方法， 属于食品生物技术领域。本发明提供一 株新的可产 - 葡萄糖苷酶的丝枝霉菌株， 该 丝枝霉菌株命名为丝枝霉 （Aphanocladiumsp.） SK34.001， 保藏号。
3、为 CCTCC NO ： M 2014090。本 发明对 - 葡萄糖苷酶产生菌丝枝霉进行斜面、 种子、 发酵三级培养 ； 从发酵液中分离纯化得到 - 葡萄糖苷酶酶粉。本发明提供的利用丝枝霉 （Aphanocladiumsp.） SK34.001 生产 - 葡萄糖 苷酶的方法， 其发酵工艺简单 ； 酶易于提取 ； 酶活 高， 酶性质稳定 ； 可直接利用麸皮等废弃资源作 为该菌株的培养基碳源， 节省能源消耗， 降低生产 成本， 具有广阔的市场应用前景。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 刘铮 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1。
4、页 说明书2页 序列表1页 CN 103937692 B 2016.03.23 CN 103937692 B 1/1 页 2 1.一株丝枝霉菌株， 其分类命名为丝枝霉 （Aphanocladium sp.） SK34.001， 其保藏号为 CCTCC NO ： M 2014090， 保藏单位为中国典型培养物保藏中心。 2.权利要求 1 所述丝枝霉菌株 CCTCC NO ： M 2014090 生产 - 葡萄糖苷酶的方法， 其 特征在于步骤如下 ： （1） 斜面培养 ： 取丝枝霉菌株 CCTCC NO ： M 2014090 进行斜面培养， 采用 PDA 培养基， 各 组分以 g/L 计 ： 马。
5、铃薯 200， 葡萄糖 20， 琼脂 1520 ； 自然 pH， 115下灭菌 30min ； 培养温度 为 2535， 培养时间 38 天 ； （2） 种子培养 ： 采用牛肉膏蛋白胨培养基， 各组分以 g/L 计 ： 牛肉膏 25， 胰蛋白胨 58， 氯化钠 25， 自然 pH， 121灭菌 20min ； 250mL 三角瓶装液 3050mL， 将步骤 （1） 所得的斜面 种子接种于种子培养基进行种子培养， 摇瓶转速 150200rpm， 培养温度 2535， 培养时间 1824h ； （3） 发酵培养 ： 发酵培养基组分以 g/L 计 ： 麸皮 2040， 硫酸铵 46， 磷酸二氢钾 2。
6、3， 硫 酸镁 0.30.5， 氯化钙 0.30.5， 自然 pH， 121灭菌 20min ； 步骤 （2） 所得的种子培养液按体 积百分数 2%5% 接种量接种于发酵培养基中， 摇瓶转速 150200rpm， 培养温度 2535， 培 养时间 38 天 ； （4） - 葡萄糖苷酶酶粉制备 ： 将步骤 （3）制得的发酵液在 500010000rpm 离心 1030min 或过滤去除菌体即得发酵上清液， 经超滤除去盐和杂蛋白， 再经硫酸铵沉淀、 透 析， 最后将透析液进行冷冻干燥即得 - 葡萄糖苷酶酶粉。 权 利 要 求 书 CN 103937692 B 2 1/2 页 3 一株丝枝霉菌株及其。
7、生产 - 葡萄糖苷酶的方法 技术领域 0001 本发明涉及一株丝枝霉菌株及其生产 - 葡萄糖苷酶的方法， 属于食品生物技术 领域。 背景技术 0002 - 葡萄糖苷酶 (EC 3.2.1.21)， 也称 -D- 葡萄糖苷酶， 它能够水解结合于底物 末端非还原性的-D-葡萄糖苷键， 同时释放出葡萄糖和相应的配基。 -葡萄糖苷酶存在 于自然界许多植物、 昆虫、 酵母、 霉菌及细菌体内， 它参与生物体的糖代谢， 对维持生物体正 常生理功能起着重要作用。 0003 - 葡萄糖苷酶在自然界广泛分布， 几乎在所有的生物体中都有存在， 但来源不 同， 其性质各异。该酶对糖苷非糖部分的专一性不强， 能水解许多。
8、 型的糖苷键。 0004 - 葡萄糖苷酶除主要用于降解纤维素以外， 还可应用于乳品工业来分解乳糖 ； 催化葡萄糖发生转移反应和缩合反应合成功能性低聚糖， 如低聚龙胆糖 ； 作为风味酶应用 于 ( 果 ) 酒、 茶叶、 果汁中起到增香或脱苦作用 ； 另外， - 葡萄糖苷酶还可用来水解大豆异 黄酮， 制备高活性的大豆异黄酮苷元产品。 0005 目 前， 国 内 外 用 于 研 究 和 制 备 - 葡 萄 糖 苷 酶 的 微 生 物 主 要 有 木 霉 属 (Trichoderma) 和曲霉属 (Aspergillus)。研究表明， 许多曲霉属是生产高活力 - 葡萄糖 苷酶的优良菌株， 且被认为是不。
9、会产生毒素的纤维素酶产生菌， 因而研究比较深入。 迄今为 止， 还没有丝枝霉 (Aphanocladium) 作为 - 葡萄糖苷酶产生菌的相关研究报道。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种丝枝霉菌株及其生产 - 葡萄糖苷酶的方法。 0007 本发明的技术方案， 一株丝枝霉菌株， 是本发明人等先前从腐殖土壤样品 中分离筛选得到的一株可以高产 - 葡萄糖苷酶的丝枝霉菌株， 分类命名为丝枝霉 （Aphanocladium sp.） SK34.001， 其保藏号为CCTCC NO ： M 2014090， 保藏单位为中国典型培 养物保藏中心。 0008 所述菌株的核糖体 DNA ITS 序列如。
10、 SEQ ID NO ： 1 所示。 0009 所述丝枝霉菌株 CCTCC NO ： M 2014090 生产 - 葡萄糖苷酶的方法， 步骤如下 ： 0010 （1） 斜面培养 ： 取丝枝霉菌株 CCTCC NO ： M 2014090 进行斜面培养， 采用 PDA 培养 基， 各组分以g/L计 ： 马铃薯200， 葡萄糖20， 琼脂1520 ； 自然pH， 115下灭菌30min ； 培养 温度为 2535， 培养时间 38 天 ； 0011 （2） 种子培养 ： 采用牛肉膏蛋白胨培养基， 各组分以 g/L 计 ： 牛肉膏 25， 胰蛋白胨 58， 氯化钠 25， 自然 pH， 121灭菌 。
11、20min ； 在 250mL 三角瓶装液 3050mL， 将步骤 （1） 所得 的斜面培养液进行种子培养， 摇瓶转速 150200rpm， 培养温度 2535， 培养时间 1824h ； 0012 （3）发酵培养 ： 发酵培养基组分以 g/L 计 ： 麸皮 2040， 硫酸铵 46， 磷酸二氢钾 23， 硫酸镁 0.30.5， 氯化钙 0.30.5， 自然 pH， 121灭菌 20min ； 步骤 （2） 所得的种子培 说 明 书 CN 103937692 B 3 2/2 页 4 养液按体积百分数 2%5% 接种量接种于发酵培养基中， 摇瓶转速 150200rpm， 培养温度 2535， 培。
12、养时间 38 天 ； 0013 （4） - 葡萄糖苷酶酶粉制备 ： 将步骤 （3） 制得的发酵液在 500010000rpm 离心 1030min 或过滤去除菌体即得发酵上清液， 经超滤除去盐和杂蛋白， 再经硫酸铵沉淀、 透 析， 最后将透析液进行冷冻干燥即得 - 葡萄糖苷酶酶粉。 0014 本发明中的 - 葡萄糖苷酶活性， 是通过使酶作用于对硝基苯 -D- 葡萄糖苷 (pNPG)， 分解所生成的对硝基苯酚的量而测定。该酶的单位定义为每分钟生成 1mol 对硝 基苯酚的酶量。 0015 本发明的有益效果 ： 本发明为首次采用丝枝霉 (Aphanocladium) 作为 - 葡萄糖 苷酶的产生菌。
13、， 该菌株培养方便， 发酵工艺简单。其所产酶为胞外酶， 易于提取， 酶活高， 酶 性质稳定， 可直接利用麸皮等废弃资源作为丝枝霉 (Aphanocladium) 的培养基碳源， 节省 能源消耗， 降低生产成本， 具有广阔的市场应用前景。 0016 生物材料样品保藏 ： 一株丝枝霉菌株， 分类命名为丝枝霉 (Aphanocladium sp.) SK34.001， 该菌株已于 2014 年 3 月 14 日保藏于中国典型培养物保藏中心， 简称 CCTCC， 地 址 ： 中国武汉， 武汉大学， 保藏编号为 CCTCC NO ： M 2014090。 具体实施方式 0017 实施例 1 0018 将。
14、丝枝霉菌株 (Aphanocladium sp.)SK34.001 在下述条件下进行发酵 ： 0019 斜面培养 ： 采用 PDA 培养基， 各组分以 g/L 计 ： 马铃薯 200， 葡萄糖 20， 琼脂 20， 自 然 pH， 115灭菌 30min。培养条件为 ： 培养温度 30， 培养时间 5 天 ； 0020 种子培养 ： 采用牛肉膏蛋白胨培养基， 各组分以 g/L 计 ： 牛肉膏 2.5， 胰蛋白胨 5.0， 氯化钠 2.5， 自然 pH， 121灭菌 20min。培养条件为 ： 250mL 三角瓶装液 30mL， 摇瓶转 速 200rpm， 培养温度 30， 培养时间 24h ；。
15、 0021 发酵培养 ： 发酵培养基组分以 g/L 计 ： 麸皮 35， 硫酸铵 4.0， 磷酸二氢钾 2.0， 硫酸 镁 0.3， 氯化钙 0.3， 自然 pH， 121灭菌 20min。培养条件为 ： 种子培养液按体积百分数 2% 接种量接种于发酵培养基中， 摇瓶转速 150rpm， 培养温度 30， 培养时间 7 天， 得到发酵液 的酶活为 5U/mL。 0022 实施例 2 0023 - 葡萄糖苷酶酶粉制备 ： 0024 将实施例 1 制得的发酵液在 8000rpm 的转速下离心 30min 去除菌体即得发酵上 清液， 经超滤除去盐和杂蛋白， 再经硫酸铵沉淀、 透析， 最后将透析液进行。
16、冷冻干燥即得 - 葡萄糖苷酶酶粉。 说 明 书 CN 103937692 B 4 1/1 页 5 SEQ ID NO ： 1 596 DNA 丝枝霉 （Aphanocladiumsp.） SK34.001 1 tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta cagagtttac aactcccaaa ccctcatgtg 60 aacataccac gatgttgctt cggcggactc gccccggcgt ccggacggcc tagcgccgcc 120 cgcggcccgg atccaggcgg ccgccggaga ccaccaaaac tattttgtat c。
17、agcagtttt 180 ttctgaatcc gccgcaaggc aaaacaaatg aatcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg 240 ttctggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag 300 tgaatcatcg aatctttgaa cgcacattgc gcccgccagc attctggcgg gcatgcctgt 360 tcgagcgtca tttcaaccct cgacttccct ttggggaaat cggcgttggg gactggcagc 420 ataccgccgg ccccgaaatg gagtggcggc ccgtccgcgg cgacctctgc gtagtaatcc 480 aacctcgcac cggaaccccg acgtggccac gccgtaaaac accccacttt ctgaacgttg 540 acctcggatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg gaggaa 596 序 列 表 CN 103937692 B 5 。