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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510778613.2 (22)申请日 2015.11.13 C07K 14/59(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/22(2006.01) (71)申请人 山东众山生物科技有限公司 地址 276800 山东省日照市岚山区食品工业 园仁家村北侧 342 省道以南 (72)发明人 张富源 殷小崴 赵梦喆 张秀娟 潘涛 邢仕杰 (54) 发明名称 一种尿促性素的提纯方法 (57) 摘要 本发明公开了一种尿促性素的提纯方法， 其 特征在于使用 “甲醇 - 乙酸铵 /。
2、 甲醇 - 乙酸钠” 复 合抽提体系， 工艺步骤包括抽提液配制、 一次溶解 抽提、 甲醇沉淀、 二次溶解抽提、 二次甲醇沉淀、 产 品收集。 本发明具有工艺操作简单， 产品生物效价 15IU/mg， 收率 95， 生产成本低。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书5页 CN 105330734 A 2016.02.17 CN 105330734 A 1/1 页 2 1.一种尿促性素的提纯方法， 其特征在于， 步骤包括 ： (1) 抽提液配制 ： 取乙酸铵、 甲醇、 纯化水， 搅拌得抽提液 A ； 取乙酸钠、 甲醇、 纯化水，。
3、 搅 拌得抽提液 B ； (2)一次溶解抽提 ： 按每公斤尿促性素粗品加入抽提液A 5080L、 吸附剂0.52Kg， 搅拌 150 210min 后， 过滤， 收集滤液 ； (3) 甲醇沉淀 ： 步骤 (2) 所得滤液， 加入醋酸并搅拌， 然后加入混合液 1 1.5 倍体积 的甲醇， 继续搅拌2030min， 静置1418h后， 过滤， 吹干滤饼、 粉碎， 烘干， 得尿促性素初 品 ； (4) 二次溶解抽提 ： 步骤 (3) 所得的尿促性素初品， 按每公斤尿促性素初品加入 80 100L 抽提液 B、 吸附剂 0.5 2Kg， 搅拌 150 210min， 过滤， 收集滤液 ； (5)二次甲。
4、醇沉淀 ： 步骤(4)所得的滤液中加入0.780.82倍体积的甲醇， 搅拌20 30min， 静置 14 18h， 过滤 ； (6) 产品收集 ： 步骤 (5) 所得的滤饼吹干后收集沉淀物， 粉碎， 烘干， 得提纯尿促性素。 2.根据权利要求1所述的一种尿促性素的提纯方法， 其特征在于， 所述的抽提液A中乙 酸铵的质量百分浓度为 4 10、 甲醇体积百分浓度为 40 70； 所述的抽提液 B 中乙酸 钠的质量百分浓度为 1、 甲醇体积百分浓度为 40。 3.根据权利要求 1 所述的一种尿促性素的提纯方法， 其特征在于 ： 所述的吸附剂为硅 藻土、 膨润土， 或活性炭。 4.根据权利要求 1 所。
5、述的一种尿促性素的提纯方法， 其特征在于 ： 所述步骤 (2)、 (3)、 (4)、 (5) 中的过滤为板框式压滤机过滤。 权 利 要 求 书 CN 105330734 A 2 1/5 页 3 一种尿促性素的提纯方法 技术领域 0001 本发明涉及生物提纯领域， 特别是一种尿促性素的提纯方法。 背景技术 0002 绝经期促性腺激素 ( 简称尿促性素， HMG) 含有促卵泡激素 (FSH) 和促黄体生产素 (LH) 两种活性成分， 他们是由垂体前叶嗜碱性细胞合成的糖蛋白激素， 由 、 两个亚基 组成， 临床上主要用于治疗不育症， 由垂体或绝经期妇女尿提取得到， 也可以通过 DNA 重组 技术制备。
6、。 0003 临床上应用的主要是高比活的尿促性素， 而从绝经期妇女尿中直接提取的尿促性 素为粗品， 需要进过多个步骤的纯化才能达到要求， 高比活的尿促性素主要通过色谱分离 技术来实现， 由于从绝经期妇女尿中提取的尿促性素粗品含有大量的杂蛋白及其他有机物 质， 会降低色谱柱柱效， 降低色谱分离纯化能力， 达不到预期效果， 而不能够直接进行色谱 分离提纯促卵泡激素。 0004 因此， 在进行尿促卵泡素色谱纯化之前， 需要进行中间体生产， 即抽提。目前为 止， 关于尿促性素提纯通常都是用 70乙醇 -10乙酸铵进行抽提， 然后再进行后续色谱 分离纯化， 如 乙酸铵提纯尿促性素的方法 ( 申请号 ： 。
7、201210598002.6) 中所公开 ： 采用 5-20乙酸铵70乙醇提纯体系10下搅拌提取2h过滤， 滤渣用5-20乙酸铵 70乙醇继续提取 1 次， 两次上清液加入 95乙醇 10下搅拌静置过夜 ； 过滤、 洗涤、 干燥 得产品。实际操作中， 该抽提方法所得产品活性回收率在 70 80之间， 并且最大的缺 陷在于总活性损失大， 产品的免疫及生物效价低， 不能够有效保护产品的生物学活性。 发明内容 0005 本发明的技术任务是针对以上现有技术的不足， 提供一种生物效价高， 活性回收 率高， 操作简单的尿促性素提纯方法。 0006 本发明解决其技术问题的技术方案是 ： 一种尿促性素的提纯方。
8、法， 其特征在于， 步 骤包括 ： 0007 (1) 抽提液配制 ： 取乙酸铵、 甲醇、 纯化水， 搅拌得抽提液 A ； 取乙酸钠、 甲醇、 纯化 水， 搅拌得抽提液 B ； 0008 (2)一次溶解抽提 ： 按每公斤尿促性素粗品加入抽提液A 5080L、 吸附剂0.5 2Kg， 搅拌 150 210min 后， 过滤， 收集滤液 ； 0009 (3) 甲醇沉淀 ： 步骤 (2) 所得滤液， 加入醋酸并搅拌， 然后加入混合液 1 1.5 倍 体积的甲醇， 继续搅拌2030min， 静置1418h后， 过滤， 吹干滤饼、 粉碎， 烘干， 得尿促性 素初品 ； 0010 (4) 二次溶解抽提 ： 。
9、步骤 (3) 所得的尿促性素初品， 按每公斤尿促性素初品加入 80 100L 抽提液 B、 吸附剂 0.5 2Kg， 搅拌 150 210min， 过滤， 收集滤液 ； 0011 (5) 二次甲醇沉淀 ： 步骤 (4) 所得的滤液中加入 0.78 0.82 倍体积的甲醇， 搅拌 说 明 书 CN 105330734 A 3 2/5 页 4 20 30min， 静置 14 18h， 过滤 ； 0012 (6) 产品收集 ： 步骤 (5) 所得的滤饼吹干后收集沉淀物， 粉碎， 烘干， 得提纯尿促性 素。 0013 上述的抽提液A中乙酸铵的质量百分浓度为410、 甲醇体积百分浓度为40 70 ； 所。
10、述的抽提液 B 中乙酸钠的质量百分浓度为 1、 甲醇体积百分浓度为 40。 0014 上述的吸附剂为硅藻土、 膨润土， 或活性炭。 0015 上述步骤 (2)、 (3)、 (4)、 (5) 中的过滤为板框式压滤机过滤。 0016 与现有技术相比较， 本发明具有以下突出的有益效果 ： 0017 1、 取用全新的抽提液体系， 抽提体系中采用 “甲醇 - 乙酸铵 / 甲醇 - 乙酸钠” 复合 抽提体系， 其目的在于保证产品回收率的同时， 适度增加整个溶液体系的极性， 使之更利于 FSH 空间结构的稳定， 有效降低尿促性素粗品中极性差的杂质成分在抽提系中溶解度， 而尿 促性素在该抽提体系中能够完全溶解。
11、， 这样保证杂质有效去除的同时保证了产品回收率 ； 0018 2、“甲醇 - 乙酸铵 / 甲醇 - 乙酸钠” 复合抽提体系中的比例对于抽提效果也具有决 定性意义 ： 通过适当降低抽提体系乙酸铵浓度， 溶液体系的离子强度降低， 蛋白等杂质成份 溶解度降低， 而尿促性素在此乙酸铵浓度下能够完全溶解， 保证了产品回收率 ； 本发明方案 中甲醇 - 乙酸铵的比例关系确保了产品回收率和纯度的良好平衡 ； 0019 3、 本发明方案通过两次抽提 ： 即 7乙酸铵 60甲醇一次抽提， 将产品单位效 价提高 10 以上后， 采取 1乙酸钠 40甲醇二次抽提， 复合抽提体系两次抽提的目的在 于将抽提溶液环境变得。
12、更温和， 更利于 FSH 空间结构的稳定， 蛋白质分子处在强酸、 强碱、 高盐等条件下， 空间结构极易发生变化， 从而导致蛋白质生物活性降低甚至丧失， 在蛋白质 提纯时， 在保证回收率的同时， 需尽可能提供一个温和的反应条件。 在保证产品回收率的同 时， 将一次抽提所得产品单位效价提高1.52倍， 通过两次抽提将FSH单位效价提高13 16 倍， 利用两次抽提所得产品进行后续色谱纯化， 在保证产品回收率的前提下， 有效提高色 谱柱的柱效， 延长色谱柱的使用寿命， 提高生产效率， 降低成本 ； 0020 4、 使用本发明方法制得的FSH生物效价在15IU/mg以上， 活性回收率在95以上， 对原。
13、料生物活性无破坏。 具体实施方式 0021 下面结合具体实施方式对本发明进一步说明。 0022 对比例 ： 0023 (1) 抽提液配制 ： 称取 100g 乙酸铵溶解于 1000ml 70的乙醇溶液中即得 10乙 酸铵 70乙醇溶液 ； 0024 (2) 称取 20g 尿促性素粗品溶于步骤 (1) 制得的溶液中， 常温搅拌 8h， 离心取上清 液 ； 0025 (3) 向步骤 (2) 得到的上清液内加入 2.5L 95乙醇， 搅拌 1h， 静置过夜， 离心， 收 集沉淀物， 用适量丙酮脱水后于真空干燥箱干燥得尿促性素提纯物。 0026 实施例 1 0027 (1) 抽提液配制 ： 取乙酸铵 。
14、7kg、 甲醇 60L， 加入纯化水定容为 100L， 搅拌 10min， 得 7乙酸铵 60甲醇的抽提液 A ； 取乙酸钠 1kg、 甲醇 40L， 加入纯化水定容为 100L， 搅拌 说 明 书 CN 105330734 A 4 3/5 页 5 10min， 得 1乙酸钠 40甲醇的抽提液 B ； 其中所述的乙酸铵、 乙酸钠为质量百分浓度， 甲醇为体积百分浓度 ； 0028 (2) 一次溶解抽提 ： 称取 1Kg 尿促性素粗品， 以及抽提液 A 50L， 投入加工罐内， 同 时加入 0.5Kg 硅藻土， 搅拌 210min 后， 板框式压滤机过滤， 收集滤液 ； 由于甲醇比乙醇极性 强， 。
15、与水的极性更加接近能够完全互溶， 在保证产品回收率的同时， 整个溶液体系的极性更 强， 更利于 FSH 空间结构的稳定， 降低乙酸铵的浓度使抽提液离子强度降低， 尿促卵泡素粗 品中极性差的杂质成分在 该抽提液中溶解度降低， 而尿促卵泡素在 60甲醇 7乙酸 铵溶液中能够完全溶解， 这样既保证了产品回收率， 又能有效去除杂质 ； 0029 (3) 甲醇沉淀 ： 步骤 (2) 所得滤液测定 pH， 按照体积比醋酸 ： 滤液 1 ： 200， 加入 浓度为 99的醋酸并搅拌， 然后加入混合液 1.5 倍体积 99的甲醇， 继续搅拌 30min， 静置 18h 后， 板框式压滤机过滤， 压缩空气吹干滤。
16、饼、 粉碎过 30 目筛， 真空烘干， 得尿促性素初 品 ； 0030 (4) 二次溶解抽提 ： 步骤 (3) 所得的尿促性素初品， 按每公斤尿促性素初品加入 90L 抽提液 B， 及 0.5Kg 硅藻土与加工罐内， 搅拌 150min， 板框压滤机过滤， 收集滤液 ； 二次 抽提采用的是 “甲醇 - 乙酸钠” 体系， 并且该体系的浓度较一次抽提有明显降低， 其原因在 于经由一次抽提的尿促性素初品更容易造成生物活性降低， 因此在保留甲醇极性增强的基 础上， 通过乙酸钠将一次抽提中依旧存在的杂质进行促沉淀， 并且不影响尿促卵泡素在该 体系中的溶解度 ； 0031 (5) 二次甲醇沉淀 ： 步骤 。
17、(4) 所得的滤液中加入 0.82 倍体积的 99甲醇， 搅拌 30min， 静置 18h， 板框压滤机过滤 ； 0032 (6)产品收集 ： 步骤(5)所得的滤饼压缩空气吹干后收集板框内沉淀物， 粉碎过30 目筛， 收集板框内沉淀物于 22、 真空度 -100 -90kPa 真空箱内烘干 8h， 得提纯尿促性 素。 0033 本发明抽提体系中采用 “甲醇 - 乙酸铵 / 甲醇 - 乙酸钠” 复合抽提体系， 其目的在 于保证产品回收率的同时， 适度增加整个溶液体系的极性， 使之更利于 FSH 空间结构的稳 定， 有效降低尿促性素粗品中极性差的杂质成分在抽提系中溶解度， 而尿促性素在该抽提 体系。
18、中能够完全溶解， 这样保证杂质有效去除的同时保证了产品回收率。 “甲醇 - 乙酸铵 / 甲醇 - 乙酸钠” 复合抽提体系两次梯度抽提 ： 目的在于将抽提溶液环境变得更温和， 更利 于 FSH 空间结构的稳定， 蛋白质分子处在强酸、 强碱、 高盐等条件下， 空间结构极易发生变 化， 从而导致蛋白质生物活性降低甚至丧失， 在蛋白质提纯时， 在保证回收率的同时， 需尽 可能提供一个温和的反应条件。 0034 通过浓度配比和极性干扰， 达成增加产品回收率， 且不会影响纯度， 并且能最大程 度的保护产品的生物学活性。 0035 其中， 上述步骤中所述的 99醋酸和 99甲醇均指的是质量百分比浓度。 00。
19、36 实施例 2 0037 (1) 抽提液配制 ： 取乙酸铵 7kg、 甲醇、 纯化水定容为 100L， 搅拌 10min， 得抽提液 A， 抽提液 A 中乙酸铵质量浓度为 7、 甲醇体积浓度为 60 ； 取乙酸钠 1kg、 甲醇、 纯化水 定容为 100L， 搅拌 10min， 得抽提液 B， 抽提液 B 中乙酸钠质量浓度为 1、 甲醇体积浓度为 40 ； 说 明 书 CN 105330734 A 5 4/5 页 6 0038 (2) 一次溶解抽提 ： 称取 1Kg 尿促性素粗品， 以及抽提液 A 60L， 投入加工罐内， 同 时加入 2Kg 膨润土， 搅拌 180min 后， 压滤机过滤，。
20、 收集滤液 ； 0039 (3) 甲醇沉淀 ： 步骤 (2) 所得滤液， 按照体积比醋酸 ： 滤液 1 ： 180， 加入浓度为 99的醋酸并搅拌， 然后加入混合液 1 倍体积 99的甲醇， 继续搅拌 20min， 静置 14h 后， 压 滤机过滤， 压缩空气吹干滤饼、 粉碎过 50 目筛， 真空烘干， 得尿促性素初品 ； 0040 (4) 二次溶解抽提 ： 步骤 (3) 所得的尿促性素初品， 按每公斤尿促性素初品加入 100L 抽提液 B， 及 2Kg 膨润土于加工罐内， 搅拌 210min， 压滤机过滤， 收集滤液 ； 0041 (5) 二次甲醇沉淀 ： 步骤 (4) 所得的滤液中加入 0。
21、.78 倍体积的 99甲醇， 搅拌 20min， 静置 14h， 压滤机过滤 ； 0042 (6) 产品收集 ： 步骤 (5) 所得的滤饼压缩空气吹干后收集沉淀物， 粉碎过 30 目筛， 收集沉淀物于 22、 真空度 -100 -90kPa 真空箱内烘干 9h， 得提纯尿促性素。 0043 实施例 3 0044 (1) 抽提液配制 ： 取乙酸铵 4kg、 甲醇 70L， 加入纯化水定容为 100L， 搅拌 10min， 得 4乙酸铵 70甲醇的抽提液 A ； 取乙酸钠 1kg、 甲醇 40L， 加入纯化水定容为 100L， 搅拌 10min， 得 1乙酸钠 40甲醇的抽提液 B ； 0045 。
22、(2) 一次溶解抽提 ： 称取 1Kg 尿促性素粗品， 以及抽提液 A 80L， 投入加工罐内， 同 时加入 1Kg 活性炭， 搅拌 180min 后， 板框式压滤机过滤， 收集滤液 ； 0046 (3)甲醇沉淀 ： 步骤(2)所得滤液测定pH， 按照体积比醋酸 ： 滤液1 ： 200， 加入浓 度为 99的醋酸并搅拌， 然后加入混合液 1 倍体积 99的甲醇， 继续搅拌 30min， 静置 16h 后， 板框式压滤机过滤， 压缩空气吹干滤饼、 粉碎过 50 目筛， 真空烘干， 得尿促性素初品 ； 0047 (4) 二次溶解抽提 ： 步骤 (3) 所得的尿促性素初品， 按每公斤尿促性素初品加入。
23、 80L 抽提液 B， 及 1Kg 活性炭于加工罐内， 搅拌 210min， 板框压滤机过滤， 收集滤液 ； 0048 (5) 二次甲醇沉淀 ： 步骤 (4) 所得的滤液中加入 0.82 倍体积的 99甲醇， 搅拌 30min， 静置 16h， 板框压滤机过滤 ； 0049 (6)产品收集 ： 步骤(5)所得的滤饼压缩空气吹干后收集板框内沉淀物， 粉碎过30 目筛， 收集板框内沉淀物于 25、 真空度 -100 -90kPa 真空箱内烘干 8h， 得提纯尿促性 素。 0050 实施例 4 0051 (1) 抽提液配制 ： 取乙酸铵 10kg、 甲醇、 纯化水定容为 100L， 搅拌 10min。
24、， 得抽提液 A， 抽提液 A 中乙酸铵质量浓度为 10、 甲醇体积浓度为 40 ； 取乙酸钠 1kg、 甲醇、 纯化水 定容为 100L， 搅拌 10min， 得抽提液 B， 抽提液 B 中乙酸钠质量浓度为 1、 甲醇体积浓度为 40 ； 0052 (2) 一次溶解抽提 ： 称取 1Kg 尿促性素粗品、 1.5L 复合稳定剂溶液， 以及抽提液 A 50L， 投入加工罐内， 10min 后加入 1Kg 活性炭， 搅拌 180min 后， 板框式压滤机过滤， 收集 滤液 ； 其中复合稳定剂溶液的配制方法为 ： 称取 300g 桉树叶剪碎， 加入 5L 蒸馏水中， 80 恒温水浴 1.5h， 超滤。
25、膜超滤， 得桉树叶提取液， 1L 桉树叶提取液加入 1mmol/L 的吐温 -80， 2mmol/L EDTA 复配得复合稳定剂溶液， 该复合稳定剂溶液具有消耗溶液中的超氧化自由基 的作用， 稳定和保护溶液中 FSH 分子， 同时不影响免疫反应， 保护尿促性素的生物活性不被 自由基破坏， 由于加入了复合稳定剂， 因此首次抽提体系可以提升乙酸铵浓度， 而不会造成 说 明 书 CN 105330734 A 6 5/5 页 7 该浓度下的原料生物活性破坏， 并且配合甲醇极性干扰， 更好的获得活性回收率， 并且复合 稳定剂电荷吸附后的大团块有机物容易被活性炭过滤清除 ； 0053 (3)甲醇沉淀 ： 。
26、步骤(2)所得滤液测定pH， 按照体积比醋酸 ： 滤液1 ： 200， 加入浓 度为 99的醋酸并搅拌， 然后加入混合液 1 倍体积 99的甲醇， 继续搅拌 30min， 静置 16h 后， 板框式压滤机过滤， 压缩空气吹干滤饼、 粉碎过 50 目筛， 真空烘干， 得尿促性素初品 ； 0054 (4) 二次溶解抽提 ： 步骤 (3) 所得的尿促性素初品， 按每公斤尿促性素初品加入 80L 抽提液 B， 及 1Kg 活性炭于加工罐内， 搅拌 210min， 板框压滤机 过滤， 收集滤液 ； 0055 (5) 二次甲醇沉淀 ： 步骤 (4) 所得的滤液中加入 0.82 倍体积的 99甲醇， 搅拌 。
27、30min， 静置 16h 板框压滤机过滤 ； 0056 (6)产品收集 ： 步骤(5)所得的滤饼压缩空气吹干后收集板框内沉淀物， 粉碎过30 目筛， 收集板框内沉淀物于 28、 真空度 -100 -90kPa 真空箱内烘干 7h， 得提纯尿促性 素。 0057 对比例、 实施例 1、 2、 3、 4 所得产物测试结果如表 1 所示， 其中 FSH 效价和总收率检 测方法为免疫组化法。 0058 表 1 ： 对比例、 实施例 1、 2、 3、 4 检测结果 0059 0060 对比例、 实施例1、 2、 3、 4测试结果表明， 采用本发明方案提取的尿促性素中FSH的 效价和生物效价均 15IU。
28、/mg 远远高于对比例。且， 五组间回收率上并未有明显差异， 相同 乙酸铵初次抽提浓度下， 实施例 4 的收率明显高于对比例， 说明 “甲醇 - 乙酸铵 / 甲醇 - 乙 酸钠” 复合抽提体系不会影响总体收率， 而， 从生物活性回收率上可以看出， 4 个实施例的收 率均 95， 明显高于采用 10乙酸铵 70乙醇提取液对比例的 86， 藉此可以表明， 其生物意义上的收率更 高， 价值更大。 0061 综上， 由此通过本发明方法提纯得到 FSH 效价， 生物效价均 15IU/mg， 生物活性 回收率 95。 0062 需要说明的是， 本发明的特定实施方案已经对本发明进行了详细描述， 对于本领 域的技术人员来说， 在不背离本发明的精神和范围的情况下对它进行的各种显而易见的改 变都在本发明的保护范围之内。 说 明 书 CN 105330734 A 7 。