技术领域
本发明属生物技术领域，具体而言，涉及协同抗肿瘤作用和蛋白稳定性的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域（trimerization domain，TD）的融合蛋白，和融合蛋白包含体的复性、纯化方法。
技术背景
肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体（TNF related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）是继TNF、FasL之后发现的第三个TNF家族的凋亡因子，为一种抗癌应用前景良好的生物药物。TRAIL由Wiley等从心肌cDNA文库中克隆出来的，因其氨基酸顺序具有TNF超家族的结构特征并能诱导Jurkat细胞和EB病毒转化的人类淋巴细胞凋亡而得名。许多临床前期研究表明TRAIL能有效诱导多种癌细胞系凋亡，并同时保护正常细胞免于细胞毒副反应。目前国外已进行关于TRAIL及其受体激动型抗体的Ⅰ、Ⅱ期临床试验，并取得初步疗效。另外，TRAIL对NF-κB仅有很微弱的激活作用，即使是全身用药，也不会像TNF-α和Fas-L那样产生严重的炎症反应，这些特性使得TRAIL有成为新一代抗肿瘤药物的潜质。
TRAIL又称凋亡素-2 配体（Apo-2L），属于TNF家族成员。TRAIL基因定位于染色体3q26，编码281个氨基酸，属于Ⅱ型跨膜蛋白，N端无信号肽序列，第15-40位氨基酸形成疏水跨膜结构，胞内区非常短，C端胞外区为保守性强的114-281位氨基酸，形成典型的β折叠，为其与受体结合的部位。TRAIL分子量为32.5kD，等电点7.63，广泛表达于包括脾、淋巴结、肺、前列腺以及外周淋巴细胞等在内的大多数正常组织，但不表达于脑组织及睾丸中。研究证实TRAIL与死亡受体结合后能诱导多种肿瘤细胞凋亡，而对绝大多数正常细胞无毒副作用，同时发现激活的T细胞、NK细胞、单核细胞以及树突状细胞表达TRAIL，提示它在宿主防御和维持免疫稳态方面起作用，参与免疫调节。
Sarah G.Hymowitz等研究发现TRAIL在形成三聚体时生物活性最强，同时受体激活时也成三聚体形式，三聚体顶部附近的锌结合位点对维持TRAIL的结构与稳定性起到重要作用，离体实验表明，全长或可溶形式的TRAIL形成的三聚体都可以快速诱导多种肿瘤细胞凋亡。TRAIL分子中还存在一些特殊位点，第109位的天冬氨酸（Asp）是一个潜在的N糖基化位点，可被金属蛋白酶从膜上切下而产生一相对分子质量为24000左右的可溶性活性肽段（114-281），该片段可形成分子量分别为48 000和66 000左右的二聚体和三聚体，TRAIL的药物应用多采用此肽段。TRAIL与TNF家族其它成员最独特的区别在于其第137-152位氨基酸序列可形成一个由12-16个氨基酸组成的凸出的环（AA loop）,此结构可插入受体的TRAIL结合位点，从而保证受体与TRAIL特异性结合，研究表明，此插入环与TRAIL细胞毒性作用有关。另外，TRAIL序列中Cys230残基在维持TRAIL的结构和生物活性中具有重要作用。若Cys230突变为Ala或Ser，TRAIL蛋白的稳定性下降，而且不能螯合锌原子形成三聚体，与受体结合能力也会下降200倍，严重影响TRAIL的诱导凋亡的活性。
然而有研究表明高度聚合的重组TRAIL（如His-TRAIL，交联的FLAG-TRAIL）对体外培养一天的原代人肝细胞（PHH）有毒。未标记的Apo2L.0/TRAIL.0对人星形胶质细胞无毒，而经标记的类型如LZ-TRAIL、交联FLAG-TRAIL和His-TRAIL能诱导分离的成熟星形胶质细胞和培养的成熟脑部切片组织凋亡。LZ-TRAIL和His-TRAIL对增殖的原代人角化细胞有明显毒性，而未标记TRAIL毒性较弱。因此，重组TRAIL的类型决定了高秩序复合物的形成，聚合程度则在提高TRAIL效用的同时导致了对其他正常细胞的毒性。研究者认为His 、FLAG、LZ和IZ等标签由于并非一个独立域（domain），在融合表达蛋白质（如TRAIL）时，会有可能由于融合蛋白整体氨基酸序列的改变导致融合蛋白三级结构的改变，进而引进未知的毒性。
Native TRAIL的三聚体对正常细胞毒性小，但它与标记型TRAIL相比抗癌效用更弱。交联的Flag-TRAIL和His-TRAIL能高效诱导肿瘤细胞凋亡，但同时也导致许多正常细胞凋亡。可供替代选择的是LZ-TRAIL和iz-TRAIL，它们的抗癌作用较理想同时对正常细胞毒性比M2/Flag-TRAIL或His-TRAIL小。可见重组TRAIL相对于hTRAIL的序列变化导致了融合蛋白功能的改变，增加了重组TRAIL抗肿瘤过程中对正常细胞的毒副作用，因此研究者在研究重组TRAIL的活性过程中，有必要关注因整体蛋白氨基酸序列的改变所引起的空间结构或折叠方式的改变，和进而引起的蛋白质功能变化。目前国内外的研究者们并未发现经标记的TRAIL对正常细胞产生毒性的确切原因。
胶原蛋白ⅩⅧ属于被称之为multiplexin（multiple triple-helix domains and interuptions）的特殊胶原亚族，含有其他胶原蛋白所没有的C末端非三螺旋区（non-triple-helical regions or non-collagenous regions,NC1），这一特殊结构使其与其他仅由三螺旋结构组成的胶原相比拥有更好的灵活性。NC1域由三聚域（trimerization domain）、铰链区（hinge region）和内皮抑素域（endostatin domain）组成，在人和大鼠的血清中以三聚体的形式存在，且可以通过内源性水解作用释放endostatin，endostatin是一种重要的内源性血管新生抑制因子，因其高效、低毒和不产生耐药性而被作为新型抗肿瘤药物。NC1在水相溶液中表现出很强的三聚特性，可以在皮摩尔（picomolar）浓度时形成三聚体。NC1的三聚特性对胶原蛋白ⅩⅧ的三螺旋结构形成起到重要作用。Victor J等利用大鼠胶原蛋白 ⅩⅧ的NC1域融合单链抗体（scFV）使之成功三聚化。研究者对NC1的晶体学结构研究表明，NC1在第162、264、294、302位存在Cys残基,且两两形成Cys162-Cys302和Cys264-Cys294单体内二硫键，Endostatin域中His1、His3、His11和Asp76螯合Zn2+维持NC1的三级结构，Zn2+可能影响NC1经水解释放endostatin并激活其活性。
因此，利用XVIII型胶原蛋白NC1域融合TRAIL，原理上可延长融合蛋白在实验动物体内半衰期，克服TRAIL半衰期仅几分钟的缺点；同时NC1或三聚域（TD）具有极强的三聚特性，融合TRAIL后能稳定其三聚体，从而保持诱导肿瘤细胞凋亡活性；此外，NC1域所含的内皮抑素域具有抑制新生血管生成的作用，此作用可与TRAIL的凋亡作用协同，增强融合蛋白的抗肿瘤效果。然而，原核表达系统（大肠杆菌）表达融合蛋白时，目的蛋白以包含体的形式存在于细胞内，需要进行复性后才可发挥其生物学功能。由于TRAIL和NC1都具有极强的疏水性，传统方法对它们的融合蛋白包含体进行复性时遇到了极大的困难，因此，工业上对该融合蛋白药物进行开发时希望相关技术人员能够提供简单、有效、低成本的复性方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体胞外部分与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域（trimerization domain，TD）的融合蛋白（TRAIL-Gn-NC1或TRAIL- Gn-TD），这种融合蛋白含有人肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体胞外部分（TRAIL114-281）、肽接头（以G表示）和人XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域TD（trimerization domain，TD），其中所述的肽接头长0-20个氨基酸，该肽接头存在与人TRAIL和人NC1或TD之间，且所述肽接头的氨基酸选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸，选用肽接头为[GlyGlyGlyGlySer] n ，n为0-4的整数。
所述的融合蛋白包含与人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体残基序列相同的第一区和与人XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。
本发明的肿瘤坏死因子（TNF）相关的凋亡诱导配体为天然的rTRAIL。
本发明的另一个目的是提供所述的肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体与XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域的融合蛋白的包含体制备及其复性方法,通过以下步骤实现：(1)构建重组融合蛋白基因；(2)表达步骤(1)中的融合蛋白基因，并进行复性。其中复性后的融合蛋白表现出较强的诱导肿瘤细胞凋亡活性。
所述步骤（1）中，本发明提供编码本发明融合蛋白的DNA序列的重组表达载体。本发明的重组表达载体包括 pET28a-TRAIL-(G)n-NC1 质粒、pET24c-TRAIL-(G)n-TD 质粒等。
所述步骤(2)中，大肠杆菌表达的融合蛋白形成包含体，经洗涤后得到较纯的融合蛋白包含体，然后结合稀释法和凝胶过滤法成功复性TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD融合蛋白，得率分别在50%和90%以上。
具体通过以下步骤实现：
1. TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD融合基因的构建。编码TRAIL 的多聚核苷酸和编码NC1 的多聚核苷酸可以用本领域周知的方法，如PCR ( Saiki 等Science.239:487-491 , 1988）、RT-PCR 方法、人工合成的方法和构建筛选cDNA 文库的方法等获得，用作PCR 模板和用于构建cDNA 文库的mRNA 或cDNA 可以来源于任何含有相应mRNA 或cDNA 的组织、细胞、及文库等，如从人肝胎cDNA 文库获得。也可以用人工合成的方法获得，人工合成时可选用宿主偏爱的密码子，这样往往可以提高产物的表达。若需要可用本领域公知的方法对多聚核苷酸进行突变、缺失、插入、和与其它多聚核苷酸连接等。编码TRAIL和编码NC1或TD 的多聚核苷酸的融合，在保持各自阅读框架不变的前提下，可以用本领域周知的各种方法，如通过PCR 的方法，在编码序列的两侧引入限制性内切酶识别位点，通过酶切产生粘性末端，编码TRAIL 和编码NC1或TD的多聚核苷酸的粘性末端用DNA 连接酶连接，从而获得编码融合蛋白的基因。如果需要可在本发明的编码融合蛋白基因的两侧引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性内切酶识别位点。可用本领域公知的方法将含编码融合蛋白序列的核酸克隆到各种表达载体中去。所用标准的分子克隆过程见（J ．萨姆布鲁克等，《分子克隆实验指南》 第二版，科学出版社，1995.) 的叙述。原核载体选用Novagen公司的pET系列，未带标签的质粒如pET28a、pET24c等皆可用于表达载体构建。
2. TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD融合蛋白的复性。
（1）大肠杆菌表达融合蛋白属于公知技术，故从略描述。菌体破碎采用机械法，离心得到包含体粗品。洗涤步骤采用包含1M-6M 尿素的PBS（pH 7-9）溶液洗涤多次，得到较为纯净的融合蛋白包含体（含量占总蛋白80%以上）。溶解包含体采用含有8-10M 尿素、30-300mM DTT的PBS溶液（pH 8-10）。
（2）复性过程中，首先将8-10M 尿素溶解的融合蛋白包含体用含有一定量助溶剂、去垢剂等（甘油，L-精氨酸等）的稀释缓冲液稀释至尿素终浓度为1-4M，在4度条件下将溶液暴露于空气中（空气氧化，形成二硫键）6-12个小时。其次，将上一步骤中的蛋白中间体溶液12000g离心10min除去沉淀后，上脱盐柱（凝胶过滤）除去变性剂，流速根据流动相的粘度和柱床限压可调整为2-5 mL/min。其中脱盐过程中所用的流动相采用了能稳定复性后蛋白质结构的甘油（10-30%）。融合蛋白的纯化采用Ni-NTA亲和纯化的方法实现，具体步骤可参考填料或柱子产品说明书。
本发明的构思如下：TRAIL在水溶液中的稳定性弱，同时在动物体内半衰期短，制约了其作为潜力蛋白新药的后续开发。近些年国内外的研究者们构建了诸多带有His、FLAG、LZ等标签的TRAIL以方便纯化或增强其三聚体稳定性，却发现改造后的TRAIL对人普通肝细胞产生了毒性，且其毒性产生的原因仍然未知，最可能的原因为体外氨基酸来源的标签使TRAIL改变了空间结构，导致其活性三聚体识别错误位点引起细胞凋亡。
因此，为解决TRAIL潜在的问题，本发明构思了人体内另一具有极强三聚特性的蛋白片段——XVIII型胶原蛋白NC1域或三聚域（TD）与TRAIL的融合蛋白，并进行原核表达。由于融合蛋白含有二硫键且疏水性强，因此全部以包含体的形式存在于大肠杆菌细胞内。为了在高浓度蛋白（4 mg/mL以上）的前提下高效率复性融合蛋白，本发明同时构思了一种基于凝胶过滤柱的两步复性法用于复性此融合蛋白。该法包括稀释和凝胶过滤步骤，原理为：蛋白质复性过程中，会经历一个或多个的中间体步骤，在此中间体状态下，蛋白质已进行了初步折叠或已形成二硫键，但是蛋白质中间体溶解性差且疏水区域暴露在外易于沉淀，需要用凝胶过滤法在合适时间后快速除去变性剂，促进蛋白质中间体向具有完整结构的活性蛋白质转变，完成复性过程。本发明利用稀释法完成融合蛋白从变性状态到中间体的过程，同时在去垢剂、助溶剂等添加剂的帮助下促进蛋白初步折叠、正确形成二硫键、增加中间体溶解性，接着利用脱盐柱以包含蛋白稳定剂的复性液为流动相快速除去前一步骤余留的变性剂、去垢剂等，完成融合蛋白的复性过程。
本专利的有益之处在于：（1）利用XVIII型胶原蛋白NC1域融合TRAIL这一融合基因的设计，原理上可延长相应融合蛋白在实验动物体内半衰期，克服TRAIL半衰期仅几分钟的缺点；（2）NC1或三聚域（TD）具有极强的三聚特性，融合TRAIL后能稳定其三聚体，从而保持诱导肿瘤细胞凋亡活性；（3）NC1域所含的内皮抑素域具有抑制新生血管生成的作用，此作用可与TRAIL的凋亡作用协同，增强融合蛋白的抗肿瘤效果。（4）本专利针对上述融合蛋白所提供的原核表达及其复性方法，有效地降低了实验室或工业上生产融合蛋白的成本。
附图说明
图 1：TRAIL114-281的PCR结果。
图 2：XVIII型胶原蛋白NC1域的PCR结果。
图 3：TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD示意图。
图 4：两步法复性融合蛋白过程中最适助溶剂的选择。
图 5：两步法复性TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD的凝胶过滤色谱图。
图 6：TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD的诱导肿瘤细胞凋亡活性。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步阐明本发明的内容，但这些实施例并不限制本发明的保护范围。
实施例 1：扩增TRAIL114-281与NC1片段
⑴ 扩增TRAIL114-281
提取人前列腺总mRNA：液氮研磨冻存的人前列腺组织小块（100mg左右）成粉末状，加TRIZOL试剂1ml继续反复研磨，转移至1.5ml无RNA酶EP管中，室温放置5min，加0.2ml氯仿剧烈振荡15seconds，室温放置3min。4℃12000g离心15min，转移上层水相至另一无RNA酶的EP管中。加入异丙醇0.5ml，室温放置10min，沉淀RNA。4℃12000g离心10min去上清，75%乙醇洗涤沉淀。4℃12000g离心5min去上清，干燥后用50μl DEPC水溶解，-70℃保存。以oligodT为引物，人前列腺总RNA为模板，加AMV逆转录酶Reverse-PCR得到cDNA。以5’-ATGGCTATGATGGAGGTCCAGG-3’和 5’-TTAGCCAACTAAAAAGGCCCCG-3’分别为上下游引物扩增全长TRAIL。再用全长TRAIL为模板，5’-GCccatggTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG-3’和5’-GggatccACCACCACCGCCAACTAAAAAG-3’为上下游引物扩增TRAIL114-281片段。参见图1，图中M：核酸marker；1-5：各温度梯度的PCR样品。
⑵ 扩增NC1片段
提取人肝组织总RNA：方法同提取前列腺RNA。以oligodT为引物，人肝组织总RNA为模板，加AMV逆转录酶Reverse-PCR得到人肝组织cDNA。以人肝组织cDNA为模板，5’-TAggatccTCAGGGGTGAGGCTCTGGG-3’和5’-GCctcgagCTACTTGGAGGCAGTCATGA-3’扩增NC1片段。参见图2，图中M：核酸marker；1：NC1的PCR结果（900bp）。
实施例 2：TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD融合蛋白表达载体的构建及其原核表达
⑴ 合蛋白表达载体构建：
pET28a载体含NcoI，BamHI和XhoI，将TRAIL114-281用NcoI和BamHI双酶切后与同样酶切后的pET28a连接构建pET28a-TRAIL114-281。在将NC1用BamHI和XhoI双酶切后的片段与pET28a-TRAIL114-281连接构建为pET28a-TRAIL(114-281)-linker-NC1表达载体。参见图3：(a): TRAIL-(G)n-NC1融合蛋白的单体构成：TRAIL114-281、肽接头和NC1域。其中NC1域由三部分构成：三聚域（TD）、铰链区和内皮抑素（endostatin）；(b)：TRAIL-(G)n-NC1融合蛋白三聚体示意图；(c)：TRAIL-(G)n-NC1 三聚体的理想三维结构图；(d)：TRAIL-(G)n-NC1在人或动物体内发挥生物学活性的理想示意图。
⑵融合蛋白的原核表达：
将构建好的表达质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）。从LB平板上挑取阳性单克隆至200ml LB培养基（kanamycin终浓度：15μg/ml）中，37℃ 160rpm 摇床培养至菌液OD600=0.8左右。加入终浓度为1mM的IPTG诱导BL21(DE3)表达融合蛋白，诱导时间为12小时，7200g离心10分钟得到BL21菌体。
实施例 3：TRAIL-(G)n-NC1和TRAIL-(G)n-TD融合蛋白包含体的获取与初步纯化
用50mM PBS（pH 7.4），20mM EDTA，0.5-3%（v/v）Triton X-100重悬菌体，vortex 5min，法式压力机械破碎BL21，离心去上清，得到粗制包涵体。50mM PBS（pH 7.4），1M NaCl，1-6 M Urea，0.5-3%（v/v）Triton X-100洗涤，离心。重复三次。灭菌水洗涤三次。再用50mM PBS（pH 7.4）洗涤一次，离心去上清，所得即为初步纯化的融合蛋白包涵体。用8-10M Urea或5-8M GdmCl+50mM NaH2PO4+30-300 mM DTT（pH 8-10）溶解包涵体，室温静置5小时，离心取上清，即为溶解的包涵体。
实施例 4：融合蛋白的两步法复性过程
两步法复性融合蛋白：
第一步：稀释（dilution）：在4度条件下，将8-10M 尿素溶解的包含体用含有可以抑制聚集体产生的助溶剂或去垢剂（甘油、CHAPS、甘氨酸、精氨酸等）的缓冲液稀释至尿素终浓度为1-4M，放置6-12小时使其二硫键充分被空气氧化且蛋白质初级结构部分折叠。参见图4：(a):100ul 10M尿素溶解的TRAIL-(G)n-NC1用PBS稀释不同倍数，以找到最易产生沉淀的稀释倍数。(b):用含有不同助溶剂的PBS稀释100ul 10M尿素溶解的TRAIL-(G)n-NC1至最易产生沉淀的尿素终浓度。浊度用OD600表示。
第二步：凝胶过滤（gel filtration chromatography）或者脱盐（desalting）
将上一步骤的终溶液12000g离心10min除去沉淀后上凝胶过滤（脱盐）柱，流动相为含有助溶剂或蛋白稳定剂（甘油、精氨酸等）的复性缓冲液（50mM 磷酸盐缓冲液，300mM NaCl，pH 6-8），流速根据流动相的粘度和柱床的限制压力设定为2-5mL/min。收集第一个紫外吸收峰，其组分为复性后的融合蛋白，参见图5，图中第一个峰为复性后的融合蛋白，实心方块表示的第二个小峰为沉淀在填料上的融合蛋白经柱上随后的尿素重新溶解后产生，实心圆表示的第三个峰为尿素和DTT等具有紫外吸收的小分子。灰色线表示凝胶过滤（脱盐）过程中电导的变化。
实施例 5：融合蛋白诱导肿瘤细胞凋亡的活性
① 细胞NCI-H460消化成为单个细胞后，调整密度 为2×105/ml，铺96孔板（每孔100μl），正常条件下继续培养24小时。
② 以梯度浓度的标准品TRAIL（114-281）作为阳性对照液；将融合蛋白用培养基按20，40，80，160，320，640，1280倍（另外一种稀释度为20，60，180，540，1620，4860）稀释,作为实验组。阴性为溶解融合蛋白的缓冲液同样方式稀释。空白为不加任何溶液的培养基。
③ 将融合蛋白样品溶液和阴性、阳性对照液加入NCI-H460细胞体系中继续培养48hr，观察实验组和对照组对目的细胞的杀伤能力。实验中对照组和实验组皆做三个副孔。
④ 培养结束后，每孔加入 10ul CCK-8 显色液，置于培养箱中孵育，直至颜色合适时显色（约1hr）。取出以450nm、630nm双波长检测。
④ 结果计算：以待测孔的OD值高于同等稀释度的阴性对照的样品为阳性（t检验P<0.01）。参见图6。
<110> 浙江大学
<120> 肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体融合蛋白及其制备方法
<160> 8
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 从人前列腺cDNA文库中扩增全长TRAIL序列所用的上游引物
<400> 1
atg gct atg atg gag gtc cag g
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 从人前列腺cDNA文库中扩增全长TRAIL序列所用的下游引物
<400> 2
tta gcc aac taa aaa ggc ccc g
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 从全长TRAIL基因序列中扩增TRAIL(114-281)基因序列所用的上游引物
<440> 3
gcc cat ggt gag aga aag agg tcc tca g
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 从全长TRAIL基因序列中扩增TRAIL(114-281)基因序列所用的下游引物
<400> 4
ggg atc cac cac cac cgc caa cta aaa ag
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 从人肝cDNA文库中扩增NC1基因序列所用的上游引物
<440> 5
tag gat cct cag ggg tga ggc tct ggg
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 从人肝cDNA文库中扩增NC1基因序列所用的下游引物
<400> 6
gcc tcg agc tac ttg gag gca gtc atg a
<210> 7
<211> 1458
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAIL-linker-NC1融合基因序列
<440> 7
atg gtg aga gaa aga ggt cct cag aga gta gca gct cac ata act ggg acc aga gga aga 60
Met Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg
1 5 10 15 20
agc aac aca ttg tct tct cca aac tcc aag aat gaa aag gct ctg ggc cgc aaa ata aac 120
Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn
21 25 30 35 40
tcc tgg gaa tca tca agg agt ggg cat tca ttc ctg agc aac ttg cac ttg agg aat ggt 180
Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly
41 45 50 55 60
gaa ctg gtc atc cat gaa aaa ggg ttt tac tac atc tat tcc caa aca tac ttt cga ttt 240
Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
61 65 70 75 80
cag gag gaa ata aaa gaa aac aca aag aac gac aaa caa atg gtc caa tat att tac aaa 300
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys
81 85 90 95 100
tac aca agt tat cct gac cct ata ttg ttg atg aaa agt gct aga aat agt tgt tgg tct 360
Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser
101 105 110 115 120
aaa gat gca gaa tat gga ctc tat tcc atc tat caa ggg gga ata ttt gag ctt aag gaa 420
Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu
121 125 130 135 140
aat gac aga att ttt gtt tct gta aca aat gag cac ttg ata gac atg gac cat gaa gcc 480
Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
141 145 150 155 160
agt ttt ttc ggg gcc ttt tta gtt ggc ggt ggt ggt gga tcc tca ggg gtg agg ctc tgg 540
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Val Arg Leu Trp
161 165 170 175 180
gct aca cgc cag gcc atg ctg ggc cag gtg cac gag gtt ccc gag ggc tgg ctc atc ttc 600
Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe
181 185 190 195 200
gtg gcc gag cag gag gag ctc tac gtc cgc gtg cag aac ggg ttc cgg aag gtc cag ctg 660
Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu
201 205 210 215 220
gag gcc cgg aca cca ctc cca cga ggg acg gac aat gaa gtg gcc gcc ttg cag ccc ccc 720
Glu Ala Arg Thr Pro Leu Pro Arg Gly Thr Asp Asn Glu Val Ala Ala Leu Gln Pro Pro
221 225 230 235 240
gtg gtg cag ctg cac gac agc aac ccc tac ccg cgg cgg gag cac ccc cac ccc acc gcg 780
Val Val Gln Leu His Asp Ser Asn Pro Tyr Pro Arg Arg Glu His Pro His Pro Thr Ala
241 245 250 255 260
cgg ccc tgg cgg gca gat gac atc ctg gcc agc ccc cct cgc ctg ccc gag ccc cag ccc 840
Arg Pro Trp Arg Ala Asp Asp Ile Leu Ala Ser Pro Pro Arg Leu Pro Glu Pro Gln Pro
261 265 270 275 280
tac ccc gga gcc ccg cac cac agc tcc tac gtg cac ctg cgg ccg gcg cga ccc aca agc 900
Tyr Pro Gly Ala Pro His His Ser Ser Tyr Val His Leu Arg Pro Ala Arg Pro Thr Ser
281 285 290 295 300
cca ccc gcc cac agc cac cgc gac ttc cag ccg gtg ctc cac ctg gtt gcg ctc aac agc 960
Pro Pro Ala His Ser His Arg Asp Phe Gln Pro Val Leu His Leu Val Ala Leu Asn Ser
301 305 310 315 320
ccc ctg tca ggc ggc atg cgg ggc atc cgc ggg gcc gac ttc cag tgc ttc cag cag gcg 1020
Pro Leu Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Arg Gly Ala Asp Phe Gln Cys Phe Gln Gln Ala
321 325 330 335 340
cgg gcc gtg ggg ctg gcg ggc acc ttc cgc gcc ttc ctg tcc tcg cgc ctg cag gac ctg 1080
Arg Ala Val Gly Leu Ala Gly Thr Phe Arg Ala Phe Leu Ser Ser Arg Leu Gln Asp Leu
341 345 350 355 360
tac agc atc gtg cgc cgt gcc gac cgc gca gcc gtg ccc atc gtc aac ctc aag gac gag 1140
Tyr Ser Ile Val Arg Arg Ala Asp Arg Ala Ala Val Pro Ile Val Asn Leu Lys Asp Glu
361 365 370 375 380
ctg ctg ttt ccc agc tgg gag gct ctg ttc tca ggc tct gag ggt ccg ctg aag ccc ggg 1200
Leu Leu Phe Pro Ser Trp Glu Ala Leu Phe Ser Gly Ser Glu Gly Pro Leu Lys Pro Gly
381 385 390 395 400
gca cgc atc ttc tcc ttt gac ggc aag gac gtc ctg agg cac ccc acc tgg ccc cag aag 1260
Ala Arg Ile Phe Ser Phe Asp Gly Lys Asp Val Leu Arg His Pro Thr Trp Pro Gln Lys
402 405 410 415 420
agc gtg tgg cat ggc tcg gac ccc aac ggg cgc agg ctg acc gag agc tac tgt gag acg 1320
Ser Val Trp His Gly Ser Asp Pro Asn Gly Arg Arg Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Glu Thr
421 425 430 435 440
tgg cgg acg gag gct ccc tcg gcc acg ggc cag gcc tcc tcg ctg ctg ggg ggc agg ctc 1380
Trp Arg Thr Glu Ala Pro Ser Ala Thr Gly Gln Ala Ser Ser Leu Leu Gly Gly Arg Leu
441 445 450 455 460
ctg ggg cag agt gcc gcg agc tgc cat cac gcc tac atc gtg ctc tgc att gag aac agc 1440
Leu Gly Gln Ser Ala Ala Ser Cys His His Ala Tyr Ile Val Leu Cys Ile Glu Asn Ser
461 465 470 475 480
ttc atg act gcc tcc aag 1458
Phe Met Thr Ala Ser Lys
481 485
<210> 8
<211> 672
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAIL-linker-TD融合基因序列
<400> 8
atg gtg aga gaa aga ggt cct cag aga gta gca gct cac ata act ggg acc aga gga aga 60
Met Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg
1 5 10 15 20
agc aac aca ttg tct tct cca aac tcc aag aat gaa aag gct ctg ggc cgc aaa ata aac 120
Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn
21 25 30 35 40
tcc tgg gaa tca tca agg agt ggg cat tca ttc ctg agc aac ttg cac ttg agg aat ggt 180
Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly
41 45 50 55 60
gaa ctg gtc atc cat gaa aaa ggg ttt tac tac atc tat tcc caa aca tac ttt cga ttt 240
Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe
61 65 70 75 80
cag gag gaa ata aaa gaa aac aca aag aac gac aaa caa atg gtc caa tat att tac aaa 300
Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys
81 85 90 95 100
tac aca agt tat cct gac cct ata ttg ttg atg aaa agt gct aga aat agt tgt tgg tct 360
Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser
101 105 110 115 120
aaa gat gca gaa tat gga ctc tat tcc atc tat caa ggg gga ata ttt gag ctt aag gaa 420
Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu
121 125 130 135 140
aat gac aga att ttt gtt tct gta aca aat gag cac ttg ata gac atg gac cat gaa gcc 480
Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala
141 145 150 155 160
agt ttt ttc ggg gcc ttt tta gtt ggc ggt ggt ggt gga tcc tca ggg gtg agg ctc tgg 540
Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Val Arg Leu Trp
161 165 170 175 180
gct aca cgc cag gcc atg ctg ggc cag gtg cac gag gtt ccc gag ggc tgg ctc atc ttc 600
Ala Thr Arg Gln Ala Met Leu Gly Gln Val His Glu Val Pro Glu Gly Trp Leu Ile Phe
181 185 190 195 200
gtg gcc gag cag gag gag ctc tac gtc cgc gtg cag aac ggg ttc cgg aag gtc cag ctg 660
Val Ala Glu Gln Glu Glu Leu Tyr Val Arg Val Gln Asn Gly Phe Arg Lys Val Gln Leu
201 205 210 215 220
Gag gcc cgg aca 672
Glu Ala Arg Thr
221