技术领域
本发明涉及修饰的核酸结构或其药学上可接受的盐或溶剂合物，所述核酸结构的双螺旋、三螺旋和四螺旋高级结构、它们的制备方法及其用于制备抗病毒药物的用途。
发明背景
开发核酸药物用于抗肿瘤，抗病毒和心血管疾病治疗等是近年来的热点课题，包括反义核酸，核酶，小干扰RNA(siRNA)和适配子等。前三者是针对致病基因或调控相关序列表达而设计的基因治疗药物，而适配子类型的核酸则以其独特的高级结构与特定的靶蛋白发生特异性结合，达到抑制靶蛋白功能的目的。
在细胞内，核酸以多种高级结构类型存在，除了普遍存在的DNA双螺旋结构外，未知的RNA或DNA单链的高级结构还可能参与到细胞的很多生命过程中，发挥各种已知和未知的功能。例如，由富G片段形成的四螺旋结构具有重要的生物学意义，众所周知的端粒结构含有高度重复的富G序列，(GGGTTA)n，它与细胞的寿命是密切相关的。在其他基因序列中也发现了富G片段，如c-myc启动子，免疫球蛋白转化区，胰岛素调节序列等，参与多种功能的调节。已知在细胞内潜在的G-四螺旋结构达375000个，它们具体参与哪些生命过程还有待更深入的研究。
G-四螺旋结构是一类非常独特的高级结构，它由4段含连续的G的核苷酸片段所形成，G片段可以来自链内或链间。四条片段(链)上的四个碱基G可通过氢键作用构成一个四联体平面，这样的平面连续堆积形成四螺旋结构，阳离子，如Na+和K+，为这一结构提供进一步的稳定性，它们与鸟嘌呤的羰基之间产生静电相互作用。四螺旋整体构 象的形式多种多样，受到阳离子的种类，连接的环的长短，末端基团(引入的或碱基本身)等因素的影响。四螺旋结构在生理盐浓度条件下，其熔解温度在60℃以上，能在生理条件下稳定存在，这也可能是生物进化选择其发挥生物功能的结构基础。
具有生物学功能的非生物源性的G-四螺旋结构最早是从核酸序列库筛选得到的，通过特异性结合特定蛋白而发挥作用，如特异性结合凝血酶的适配子。通过组合化学方法，还发现了多个含G-四螺旋的结构具有抑制HIV-1的活性。Ojwang等人报道了一个17mer的G-四螺旋结构，具有抑制HIV-1整合酶的活性。Wyatt等人用组合化学方法筛选了另一类具有抗HIV活性的G-四螺旋结构，5320：5′-d(TTGGGGTT)-3′，它在K+存在下形成稳定的分子间四螺旋结构，通过结合HIV病毒表面蛋白gp120的V3 loop，抑制HIV-1从细胞到细胞和从病毒到细胞的感染。5′-d(TGGGAG)-3′是从一个15mer的G-四螺旋结构简化而来的，在它的5′-端的糖环的5′-羟基上引入一个大的脂溶性基团，这个脂溶性基团和四螺旋一起赋予该结构抑制HIV融合的活性。
目前，已有多种小分子药物以及肽类药物用于HIV-1治疗，对于控制艾滋病的危害发挥了巨大作用，不幸的是，这些药物在治疗过程中会出现不同程度的耐药性。因此，不断发展新结构、新机制的抗HIV-1药物仍是目前药物化学针对HIV-1感染的一个热点研究方向。
本发明基于核酸四螺旋抗HIV-1作用的结构要求，即核酸骨架的聚阴离子作用和核酸结构末端一定体积大小的脂溶性基团，提出新的修饰策略，通过化学修饰和全新的骨架设计来寻找活性更高、更适于作为药物的新结构，作为筛选抗HIV-1药物的有效途径之一。在5′-核苷单体的碱基上引入各种脂溶性基团修饰，和/或与5′-核糖上的修饰进行组合；开发双螺旋、三螺旋、和四螺旋骨架结构，发现具有抑制HIV-1融合活性的新结构，作为抗HIV-1感染的新的治疗候选药物。
发明内容
发明概述
本发明涉及一类具有抗HIV-1融合活性的修饰的核酸结构，其序列如通式(I)所示：
其中
R1连接在核苷酸序列的5′-端，独立地选自通式1-6的核苷单体结构，所述单体结构以3′-羟基或5′-羟基与所述核苷酸序列连接；
R2连接在核苷酸序列的3′-端，独立地选自：氢原子，甲基磷酰基，2-氯苯基磷酰基，甲基硫代磷酰基，甲基膦酰基，甲基硫代膦酰基，苯基膦酰基，2-羟乙基磷酰基，2-羟乙基硫代磷酰基，苯基磷酰基，4-氯苯基磷酰基，2-羟基-3-乙酰胺基-丙基；
R3为不存在，或者选自氢，C1-4烷基，C1-4烷氧基，卤素原子，被氨基或C1-4烷氧基或卤素原子取代的C1-4烷基，取代或未取代的 芳基和取代或未取代的芳烷基；
X选自氧原子，硫原子，NH2，NH和C1-6烷基链；其中当X为NH2时，R3不存在；
R4为不存在，或者选自氢原子，C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6烷氨基，卤素原子，被氨基或C1-6烷氧基或卤素原子取代的C1-6烷基，取代或未取代的芳基和取代或未取代的芳烷基；
Y选自氧原子，硫原子，NH2，NH，氢原子，氟原子和C1-6亚烷基，其中当Y为H，NH2或F时，R3不存在；
m1和m2表示含碱基B4和B1-B2-B3-B5的结构单元的个数，各自独立地为1-15；
B1，B2，B3，B4和B5为核苷酸序列上的碱基，各自独立地选自A，G，C，T，mC，mG和非天然碱基及其组合；
X1为不存在，或者选自C1-6烷基，C2-6烯基和C2-6炔基，其中所述C1-6亚烷基，C2-6烯基和C2-6炔基中的一个或多个亚甲基任选地被氧原子，硫原子，酰胺基或酯基替代；
X2为不存在，或者选自氧原子、CH2、NH和硫原子；
X3选自CH和氮原子；
Z选自碳原子或硅原子；
R5，R6和R7相同或不同，各自独立地选自C1-4烷基，芴基，占吨基，未取代或被R8单取代或多取代的C6-20芳基，和未取代或被R8单取代或多取代的蒽醌基；
R8为C1-4烷基，C1-4卤代烷基，卤素原子，硝基，氰基，氨基，C1-4烷氧基，C1-4烷硫基，取代或未取代的芳基，芳氧基，芳烷氧基；在核苷单体1-3中与5′-O或X2连接的R5，R6，R7和Z组成的基团 相同或不同，可以同时存在，或者单独存在，此时其中一个基团 为氢；当核苷单体1-3中5′位置不存在基团 时，核苷单体1-3以5′-羟基与所述核苷酸序列连接。
本发明基于四螺旋结构片段对抑制HIV-1进入活性的结构要求，提出了针对四螺旋结构的新的末端修饰途径。
本发明首次提出并证明了修饰的双螺旋、三螺旋核酸结构同样具有较好的抑制HIV进入的活性。
本发明涉及在末端结构单元的多个位置上引入各种脂溶性基团；并将这种修饰引入核酸序列中，在模拟生理条件下形成稳定的高级结构，如双螺旋、三螺旋、和四螺旋结构，表现出抑制HIV-1进入的活性，具有潜在的作为抗HIV-1进入候选药物的研发价值。
本发明所涉及的这类新结构核酸，与现有上市小分子或肽类抗HIV药物具有显著的结构差异，新结构有利于克服现有抗HIV药物的耐药性。
本发明提供修饰单体的设计与合成方法，包括各种脂溶性基团被引入核苷单体的碱基和核糖上，并转化为适于核酸固相合成的亚磷酰胺单体。
本发明涉及含修饰单体的核酸结构片段的制备和纯化方法。
本发明还涉及各种修饰在核酸高级结构上的组装，包括在5′-核苷单体的碱基上的各种修饰，5′-核糖上的修饰，和磷酸二酯键上的修饰进行组合，发现具有抑制HIV-1进入活性的新结构，作为抗HIV-1感染的新的治疗候选药物。
在通式(I)中，B1，B2，B3，B4，B5所产生的序列组成中，含一个至多个GGG或GGGG片段，则形成四螺旋结构；如果碱基组成为全嘌呤或全嘧啶，则形成三螺旋结构；如果是天然碱基的随机组合，则形成双螺旋结构。并且，在三螺旋和双螺旋结构中的互补核酸序列可以是天然的，也可以是本发明所定义的修饰序列。
非天然碱基包括针对A，G，C，T等四个碱基的修饰而产生的结构，以提高螺旋结构的热稳定性、化学稳定性和酶稳定性的修饰为主：针对A和G的五员环部分的修饰，如通式2和3中的碱基部分；在T的5位引入取代基，如通式1的碱基部分等；取代基还可包括氯，溴，碘等卤素原子；
核苷单体1-6用于核酸结构修饰时，是以亚磷酰胺单体的形式用于核酸结构的合成，它们分别以亚磷酰胺单体7-12用于固相合成通式(I)，如下所示。因此，本发明还提供亚磷酰胺单体结构7-12及其合成方法。
用于核酸结构合成的亚磷酰胺单体结构7-12
其中，
亚磷酰胺单体7-12中，X1，X2，X3，Z，R5，R6，R7的定义与通式(I)中相同；
R9为腺嘌呤及其类似物的6-位氨基的保护基，包括苯甲酰基，二正丁胺基甲基，二甲胺基甲基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，甲酰基，其中，优选苯甲酰基，二正丁胺基甲基，二甲胺基甲基，乙酰基；
R10为鸟嘌呤及其类似物的2-氨基的保护基，包括异丁酰基，二正丁胺基甲基，二甲胺基甲基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，苯甲酰基，甲酰基，其中，优选异丁酰基，二正丁胺基甲基，二甲胺基甲基，乙酰基。
本发明还涉及式(I)所示的核酸结构、其药学上可接受的盐、或其溶剂合物。
本发明涉及式(I)所示的核酸结构，采用其它核酸药物(如siRNA，反义核酸，适配子，核酶等)的转运策略：与各种阳离子聚合物如阳离子脂质体一起形成的复合物；与PEG、胆固醇、靶细胞表面受体的配体等结合，以改善这类核酸药物的转运效率。
本发明还涉及药物组合物，所述药物组合物包含通式(I)的核酸结构或其药学上可接受的盐或溶剂化物与药学上可接受的载体或赋形。在一个实施方案中，所述组合物还包括其他治疗病毒感染的药物。在一个实施方案中，所述病毒特别是HIV-1病毒。
本发明还涉及通式(I)的核酸结构或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备治疗病毒感染的药物中的用途。在一个实施方案中，所述病毒是HIV-1病毒。
本发明还涉及治疗病毒感染的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的通式(I)的核酸结构或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一个实施方案中，所述病毒是HIV-1病毒。
附图说明
图1包含通式(I)的四螺旋核酸结构的CD谱图，是确定本发明通式(I)核酸高级结构的圆二色谱谱图，其中01至07分别指表2中的LK-CW-01至LK-CW-07。LK-CW-01至LK-CW-07均显示出平行四螺旋结构的特征CD谱。
图2包含通式(I)的双螺旋核酸结构D01+D02的CD谱图，是确定本发明通式(I)核酸高级结构的圆二色谱谱图，其中结构D01+D02显示出双螺旋结构的特征CD峰。
发明详述
本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
本发明利用核苷单体1-6对核酸序列通式(I)进行结构修饰，获得具有抗病毒特别是抗HIV-1病毒的生物活性。
本发明的第一方面涉及通式(I)的寡聚核苷酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物，
其中
R1连接在核苷酸序列的5′-端，独立地选自通式1-6的核苷单体结构，所述单体结构以3′-羟基或5′-羟基与所述核苷酸序列连接；
R2连接在核苷酸序列的3′-端，独立地选自：氢原子，甲基磷酰基，2-氯苯基磷酰基，甲基硫代磷酰基，甲基膦酰基，甲基硫代膦酰基，苯基膦酰基，2-羟乙基磷酰基，2-羟乙基硫代磷酰基，苯基磷酰基，4-氯苯基磷酰基和2-羟基-3-乙酰胺基-丙基；优选氢原子，甲基磷酰基，2-氯苯基磷酰基，甲基硫代磷酰基，2-羟乙基磷酰基或2-羟 基-3-乙酰胺基-丙基；
R3为不存在，或者选自氢，C1-4烷基，C1-4烷氧基，卤素原子，被氨基或C1-4烷氧基或卤素原子取代的C1-4烷基，优选为甲基，乙基，2-氨基乙基，2-甲氧基乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基或叔丁基，其中更优选甲基，乙基，2-氨基甲基，2-甲氧基乙基或丙基；或者R3为取代或未取代的芳基，其中芳基是指含6-20个碳原子，优选6-16个碳原子，更优选6-10个碳原子的芳环结构，此芳基无取代基或具有至少一个取代基；包括苯基，C1-4烷基苯基(如2-甲基苯基，或3-乙基苯基)，卤代苯基(如2-氟苯基，2-氯苯基，4-氯苯基，2-溴苯基或2-碘苯基)，硝基苯基(如2-硝基苯基或4-硝基苯基)，C1-4烷氧基苯基(如4-甲氧基苯基，或4-乙氧基苯基)，C1-4烷硫基苯基(如4-甲硫基苯基，或4-乙硫基苯基)，萘基，菲基，蒽基和芘基，其中，优选无取代的苯基，甲氧基苯基，卤代苯基，和硝基苯基；或者R3为取代或未取代的芳烷基，其中芳烷基是含1-4个碳原子的烷基，其至少被一个(1-3个，优选1个)上述芳基所取代，包括苄基，甲基苄基，乙基苄基，甲氧基苄基，乙氧基苄基，氟代苄基，氯代苄基，溴代苄基，氯代萘甲基，茚甲基，菲甲基，蒽甲基，二苯基甲基，三苯基甲基，1-苯乙基，2-苯乙基，2，2-二苯基乙基，2，2，2-三苯基乙基，3，3，3-三苯基丙基，1-萘乙基，2-萘乙基，1-苯基丙基，2-苯基丙基，3-苯基丙基，1-萘基丙基；
X选自氧原子，硫原子，NH2，NH和C1-6亚烷基链，如亚甲基，亚乙基，亚丙基，亚丁基，亚戊基；其中当X为NH2时，R3不存在；优选氧原子，硫原子或亚甲基；
R4为不存在，或者选自氢原子，C1-6烷基，C1-6烷氧基，C1-6烷氨基，卤素原子，被氨基或C1-6烷氧基或卤素原子取代的C1-6烷基，优选甲基，乙基，2-氨基乙基，甲氧基亚甲基，2-甲氧基亚乙基，3-甲氧基亚丙基，2-乙氧基亚甲基，2-乙氧基亚乙基，2-丙氧基亚乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基或叔丁基，其中更优选甲基，乙基，2-氨基乙基，2-甲氧基乙基，甲氧基亚甲基，2-乙氧基亚 甲基或丙基；或者R4为取代或未取代的芳基，其中芳基是指含6-20个碳原子，优选6-16个碳原子，更优选6-10个碳原子的芳环结构，此芳基无取代基或具有至少一个取代基，包括苯基，C1-4烷基苯基(如2-甲基苯基，或3-乙基苯基)，卤代苯基(如2-氟苯基，2-氯苯基，4-氯苯基，2-溴苯基或2-碘苯基)，硝基苯基(如2-硝基苯基或4-硝基苯基)，C1-4烷氧基苯基(如4-甲氧基苯基，或4-乙氧基苯基)，C1-4烷硫基苯基(如4-甲硫基苯基，或4-乙硫基苯基)，萘基，菲基，蒽基和芘基，其中，优选无取代的苯基，甲氧基苯基，卤代苯基，和硝基苯基；
或者R4为取代或未取代的芳烷基，其中芳烷基是含1-4个碳原子的烷基，其至少被一个(1-3个，优选1个)上述芳基所取代，包括苄基，甲基苄基，乙基苄基，甲氧基苄基，乙氧基苄基，氟代苄基，氯代苄基，溴代苄基，氯代萘甲基，茚甲基，菲甲基，蒽甲基，二苯基甲基，三苯基甲基，1-苯乙基，2-苯乙基，2，2-二苯基乙基，2，2，2-三苯基乙基，3，3，3-三苯基丙基；1-萘乙基，其中，优选苄基和苯乙基；
Y选自氧原子，硫原子，NH2，NH，氢原子，氟原子和C1-6亚烷基，如亚甲基，亚乙基，亚丙基，四亚甲基，或戊亚甲基；其中当Y为H，NH2或F时，R3不存在；优选亚甲基，氢原子或氟原子；
m1和m2表示含碱基B4和B1-B2-B3-B5的结构单元的个数，各自独立地为1-15，m1优选1-10，更优选1-6，最优选1-4，甚至最优选1或2；m2优选1-10。
B1，B2，B3，B4和B5为核苷酸序列上的碱基，各自独立地选自A，G，C，T，mC，mG和非天然碱基及其组合；
X1为不存在，或者选自C1-6亚烷基，如亚甲基，亚乙基，亚丙基，亚丁基，亚戊基，其中，优选亚甲基，亚乙基，亚丙基；C2-6亚烯基，如(E)-乙烯基，(Z)-乙烯基，(E)-丙烯基，(Z)-丙烯基，(E)-丁烯基，(Z)丁烯基，(E)-戊烯基，(Z)-戊烯基，(E)-己烯基，(Z)-己烯基，其中，优选(E)-丙烯基，(Z)-丙烯基；和C2-6亚炔基，如丙炔基，丁炔 基，戊炔基，己炔基，其中优选丙炔基或丁炔基；其中所述C1-6亚烷基，C2-6亚烯基和C2-6亚炔基中的一个或多个亚甲基任选地被氧原子，硫原子，酰胺基或酯基替代；
X2为不存在，或者选自氧原子、CH2、NH和硫原子；
或者优选X1和X2可以一起形成亚甲氧基，亚乙氧基，亚丙氧基，1-丙炔氧基，3-亚丙氧基或1-丙烯氧基；
X3选自CH和氮原子；
Z选自碳原子或硅原子；
R5，R6和R7相同或不同，各自独立地选自C1-4烷基，例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，其中优选叔丁基；和未取代或被R8单取代或多取代的C6-20芳基，优选C6-16芳基，进一步优选C6-10芳基；此芳基无取代基或具有至少一个取代基；无取代基的芳基如苯基，1-萘基，2-萘基，4-菲基，9-蒽基，2-蒽基，芘基，其中优选的芳基为苯基和萘基，更优选苯基；芳基上有1-5个取代基R8，优选1-3个，更优选1个或2个；
R8定义如下：C1-4烷基，C1-4卤代烷基，卤素原子，硝基，氰基，氨基，C1-4烷氧基，C1-4烷硫基，芳基，芳氧基，芳烷基或芳烷氧基；其中芳基是指含6-20个碳原子的芳环结构；芳烷基是含1-4个碳原子的烷基，其至少被一个上述芳基所取代；芳氧基是指芳基-O-，其中芳基定义如上；芳烷氧基是指芳烷基-O-，其中芳烷基定义如上；
其中对于R8定义举例说明如下：
C1-4烷基，如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，和叔丁基，优选甲基和叔丁基；
C1-4卤代烷基：氟代甲基，三氟甲基，三氯甲基，2，2，2-三氟乙基，2，2，2-三氯乙基，2-氟乙基，2-氯乙基，2-碘乙基，3-氯丙基，4-氟丁基等，优选三氟甲基和2，2，2-三氯乙基；
卤素原子：如氟，氯，溴，碘原子，优选氟和氯原子；
硝基，氰基和氨基；
C1-4烷氧基：如甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基， 异丁氧基，仲丁氧基，和叔丁氧基，优选甲氧基和叔丁氧基；
C1-4烷硫基：甲硫基，乙硫基，丙硫基，异丙硫基，丁硫基，异丁硫基，仲丁硫基，和叔丁硫基，优选甲硫基和叔丁硫基；
芳基：如苯基或萘基；
芳氧基：如苯氧基或萘氧基；
芳烷基：如苄基或苯乙基；
芳烷氧基：如苄氧基或苯乙氧基；
或者R5，R6和R7相同或不同，各自独立地选自蒽醌基，无取代基或含取代基，取代基同R8；取代基的数量为1-5个，优选1-3个，更进一步优选1个；如9，10-蒽醌-1-，9，10-蒽醌-2-，4-甲基-9，10-蒽醌-1-，5-甲氧基-9，10-蒽醌-1-，7-氯-9，10-蒽醌-1-，8-氟-9，10-蒽醌-2-，6-乙基-9，10-蒽醌-2-，8-乙氧基-9，10-蒽醌-2-，9，10-蒽醌-1-，6-羟基-9，10-蒽醌-1-，其中，优选无取代的蒽醌基；
或者R5，R6和R7和Z一起选自芴基，占吨基，优选9-芴基，9-占吨基；
在核苷单体1-3中与5′-O或X2连接的R5，R6，R7和Z组成的基团 相同或不同，可以同时存在，或者单独存在，此时其中一个基团 为氢；当核苷单体1-3中5′位置不存在基团 时，核苷单体1-3以5′-羟基与所述核苷酸序列连接。
在通式(I)中，B1，B2，B3，B4，B5所产生的序列组成中，含一个至多个GGG或GGGG片段，则形成四螺旋结构；如果序列的碱基组成为全嘌呤或全嘧啶组成，则形成三螺旋结构；如果是天然碱基的随机组合，则形成双螺旋结构。并且，在三螺旋和双螺旋结构中的互补核酸序列可以是未修饰的，也可以是本发明所定义的修饰序列。
非天然碱基包括针对A，G，C，T等四个碱基的修饰而产生的结构，以提高螺旋结构的热稳定性、化学稳定性和酶稳定性的修饰为主：针对A和G的五员环部分的修饰，如通式2和3中的碱基部分；在T的 5位引入取代基，如通式1的碱基部分等；这些修饰碱基上的取代基还可包括氯，溴，碘等卤素原子；
在通式(I)中，B1，B2，B3，B4，B5中含有连续的3个G，如d(TGGGAG)4，d(GGGTG)4，d(TGGGA)4，d(TGGGA)4，d(TGGGA)4，d(TGGGA)4，d(TGGGA)4，d(TGGGA)4等，在钾离子的存在下都形成稳定的四螺旋结构；当B1至B5为随机分布的碱基组成时，如d(TCTGCATG)和d(CATGCAGA)，则形成双螺旋结构；在这两类结构中引入本发明的修饰策略，将5′-端以修饰单体1-6代替，获得具有抑制HIV-1进入的活性。
在本发明通式(I)的一个实施方案中，m1和m2各自独立地为1-10，优选1-6，更优选1-4。m1优选1-4，m2优选1-10。
在本发明通式(I)的一个实施方案中，R1连接在5′-端，独立地选自单体结构1-6；R2连接在3′-端，独立地选自：氢原子，甲基磷酰基，2-氯苯基磷酰基，甲基硫代磷酰基，2-羟乙基磷酰基和2-羟基-3-乙酰胺基-丙基。
在本发明通式(I)的一个实施方案中，X1为C1-6亚烷基，C1-6亚烯基或C1-6亚炔基，其中所述C1-6亚烷基中的一个或多个亚甲基任选地被氧原子替代；X2为氧原子，CH2，NH或硫原子；X1和X2一起形成亚甲氧基，亚乙氧基，亚丙氧基，亚-1-丙炔氧基，或亚-1-丙烯氧基；X3为CH或氮原子。
在本发明通式(I)的一个实施方案中，X和R3一起形成OH，SH，甲氧基，乙氧基，丙氧基或苄氧基。
在本发明通式(I)的一个实施方案中，Y和R4一起形成羟基，氟原子，氢原子，甲氧基，乙氧基，丙氧基，甲氧基亚甲氧基，甲氧基亚乙氧基，乙氧基亚甲氧基，甲氨基或乙氨基。
本发明的第二方面涉及衍生自单体1-6的用于通式(I)合成的亚磷酰胺单体7-12及其合成方法。
亚磷酰胺单体7-12中，X1，X2，X3，Z，R5，R6，R7的定义与通式(I)中相同；
R9为腺嘌呤及其类似物的6-位氨基的保护基，包括苯甲酰基，二正丁胺基甲基，二甲胺基甲基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，甲酰基，其中，优选苯甲酰基，二正丁胺基甲基，二甲胺基甲基，乙酰基；
R10为鸟嘌呤及其类似物的2-氨基的保护基，包括异丁酰基，二正丁胺基甲基，二甲胺基甲基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，苯甲酰基，甲酰基，其中，优选异丁酰基，二正丁胺基甲基，二甲胺基甲基，甲酰基，乙酰基。
本发明的第三方面涉及核苷单体1-6的合成，以2′-位为氢原子取代的结构为例。
化合物1的合成路线如反应路线4和反应路线5所示，当X1为亚甲基，亚乙基，亚丙基，X2为氧原子时，按反应路线4所示的合成路线。化合物1a的5位和5′-位的羟基与含芳香基团的卤化物反应，如三苯甲基氯(Trt-C1)，4，4′-二甲氧基-三苯甲基氯(DMT-C1)，叔丁基 二苯基氯硅烷(TBDPS-C1)，得到重要中间体1，1在5位和5′-位的R5R6R7Z基团相同；如果R5R6R7Z基团在5位和5′-位不同，则以化合物1b为原料，在它的5位上已经引入R5R6R7Z基团，经糖苷化反应和糖环的脱保护基(Tol，对甲基苯甲酰基)，得到重要中间体1c，在它的5′-位引入所需R5R6R7Z基团，得到5位和5′-位含不同脂溶性取代基的单体1。核苷单体1进一步转化为亚磷酰胺单体7，用于DNA固相合成。
反应路线4化合物1及其亚磷酰胺单体7的合成路线
当X1为其它基团，X2为氧或碳原子，以5-碘脱氧尿苷为起始物，以偶联反应引入烯键或炔键连接臂，而且这两种连接臂可以氢化为亚烷基连接臂，然后在5′-位引入所需基团，如反应路线5所示。
反应路线5化合物1及其重要中间体1b的合成路线
化合物2及其亚磷酰胺单体8的合成路线如反应路线6所示。
以化合物2a为起始物，一般以偶联反应引入7位的取代基R5R6R7Z基团，X1以烯基，炔基引入，并且可以将烯基和炔基经氢化反应转化为亚烷基，得到关键中间体2b，在2b的5′位引入相同或不同的R5R6R7Z基团，得到化合物2，在2的6-氨基引入保护基R9，如苯甲酰基，乙酰基，二正丁胺基甲基，或二甲胺基甲基，得到关键中间体2c，进一步转化为它的亚磷酰胺单体8。
反应路线6化合物2及其亚磷酰胺单体8的合成路线
化合物3及其亚磷酰胺单体9的合成路线如反应路线7所示。
以化合物3a为起始物，一般以偶联反应引入7位的取代基R5R6R7Z基团，X1是含烯基，炔基的基团，并且可以氢化反应将烯基和炔基转化为亚烷基，得到关键中间体3b，在3b的5′位引入相同或不同的R5R6R7Z基团，得到化合物3，在3的2-氨基引入保护基R10，如异丁酰基，乙酰基，二正丁胺基甲基，二甲胺基甲基，甲酰基，得到关键中间体3c，进一步转化为它的亚磷酰胺单体9。
反应路线7化合物3及其亚磷酰胺单体9的合成路线
化合物4及其亚磷酰胺单体10的合成路线如反应路线8所示。在脱氧胸苷的5′-位引入R5R6R7Z基团得到化合物4，进一步转化为亚磷酰胺单体10。
反应路线8化合物4及其亚磷酰胺10的合成路线
化合物5的合成如反应路线9所示，以脱氧腺苷为起始物，在它的5′-位引入R5R6R7Z基团而得到，随后保护其6-氨基，得到关键中间体5a，或者，先保护脱氧腺苷的6-氨基，得到中间体5b，再引入5′- 位的R5R6R7Z基团，得到关键中间体5a，5a进一步转化为亚磷酰胺单体11。
反应路线9化合物5及其亚磷酰胺单体11的合成路线
化合物6的合成如反应路线10所示，以脱氧鸟苷为起始物，在它的5′-位引入R5R6R7Z基团而得到，随后保护其2-氨基，得到关键中间体6a，或者，先保护脱氧鸟苷的2-氨基，得到中间体6b，再引入5′-位的R5R6R7Z基团，得到关键中间体6a，6a进一步转化为亚磷酰胺单体12。
反应路线10化合物6及其亚磷酰胺氮单体12的合成路线
本发明的第四方面涉及含单体1-6的核酸序列的合成，利用DNA固相合成的亚磷酰胺法合成，将以下核苷单体引入核苷酸序列的5′-端或其它位置，部分序列如表1所示，所含的核苷单体结构如下所示。
例如，采用通用型CPG树脂固相合成，使用亚磷酰胺单体14e，脱保护条件为浓氨水55℃，2h。最终得到结构为14f。
用于修饰核酸结构的核苷单体结构
表1修饰的脱氧核苷酸序列
编号 序列(5′-3′) 编号 序列(5′-3′) LK-CW-G01 d(13GGGAG) LK-CW-G07 d(17aGGGAG) LK-CW-G02 d(14eGGGAG) LK-CW-G13 d(14cGGGAG) LK-CW-G03 d(14aGGGAG) LK-CW-G14 d(15cGGGAG) LK-CW-G04 d(15eGGGAG) LK-CW-G15 d(16cGGGAG) LK-CW-G05 d(15aGGGAG) LK-CW-G16 d(17GGGAG) LK-CW-G06 d(16eGGGAG) LK-CW-G17 d(13G18GAG) LK-CW-G00 d(TGGGAG) D-01 d(14eCTGCATG) D-02 d(CATGCAG14f) D-03 d(TCTGCATG) D-04 d(CATGCAGA) D-05 d(13CTGCATG)
本发明的第五个方面涉及修饰核酸的高级结构的光谱分析，将各个修饰核酸序列溶于缓冲液中，利用圆二色谱仪测定它们的特征峰形，确定四螺旋和双螺旋结构的形成。
本发明的第六个方面涉及修饰核酸的抗HIV-1融合的活性，利用细胞融合模型检测抑制活性。
本发明第七个方面涉及式(I)所示的化合物，采用其它核酸药物(如siRNA，反义核酸，适配子，核酶等)的转运策略：与各种阳离子聚合物如阳离子脂质体一起形成的复合物；与PEG、胆固醇、靶细胞表面受体的配体等结合，以改善这类核酸药物的转运效率。
本发明第八个方面涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含通式(I)的核酸或其药学上可接受的盐或溶剂化物与药学上可接受的载体或赋形。在一个实施方案中，所述组合物还包括其他治疗病毒感染的药物。在一个实施方案中，所述病毒特别是HIV-1病毒。
本发明的核酸结构既可以其本身也可以其可药用盐的形式使用。通式(I)核酸结构的可药用盐包括与药学上可接受的无机碱或有机碱形成的常规盐。合适的碱加成盐的例子包括与钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、 三甲胺、三乙胺、三丙胺、三丁胺、N，N′-二苄基乙二胺、氯代普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因等形成的盐。本文中涉及到本发明的核酸结构时，包括通式(I)核酸结构及其可药用盐。
通式(I)的核酸结构还可以形成溶剂合物，例如水合物、醇合物等的形式。一般来说，对于本发明的目的，与药学上可接受的溶剂如水、乙醇等的溶剂合物形式与非溶剂合物形式相当。
本文所用的药学上可接受的载体或赋形剂包括作为期望的具体剂型适合的任意和所有溶剂、稀释剂或其他液体媒介物、分散或助悬助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、固体粘合剂、润滑剂等。Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，E.W.Martin(Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1980)中公开了用于配制药学上可接受组合物的各种载体或赋形剂及其制备的公知技术，其全文引入本申请作为参考。除与本发明化合物不相容的任意常用载体介质外，例如通过产生任意不期望生物效应、否则就是以有害方式与药学上可接受组合物的任意其他成分发生相互作用，本发明范围内关注其应用。
可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘油、山梨酸或山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质例如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、蜡类、聚乙烯-聚丙烯-嵌段共聚物、羊毛脂、糖类例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂例如可可脂和栓剂蜡；油例如花生油、棉籽油；红花油；芝麻油；橄榄油；玉米油和大豆油；二醇类例如丙二醇或聚乙二醇；酯类例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液；和其他无毒性相容性润滑剂例如十二烷基硫 钠和硬脂酸镁；根据制剂者的判断，组合物中还可以存在着色剂、释放剂、包衣衣料、甜味剂、矫味剂和香料、防腐剂和抗氧化剂。
本发明第九个方面涉及通式(I)的核酸结构或其药学上可接受的盐或溶剂化物在制备治疗病毒感染的药物中的用途。在一个实施方案中，所述病毒是HIV-1病毒。
本发明第十个方面涉及治疗病毒感染的方法，所述方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的通式(I)的核酸结构或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一个实施方案中，所述病毒是HIV-1病毒。
实施例
实施例1.合成核苷单体16c和它的亚磷酰胺单体16c-p
反应路线12核苷单体16c和它的亚磷酰胺单体16c-p的合成路线
1-[(2-去氧-β-D-呋喃核糖-5-(叔丁基二苯基硅基)]-5-(叔丁基二苯基硅氧基-丙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(16c)
按文献24中的方法合成5(3-羟丙基)-脱氧尿苷。向5(3-羟丙基)-脱氧尿苷(0.75g)的DMF(10ml)溶液中，加入咪唑(0.625g，9.2mmol)，然后分批加入TBDPS-C1(2.07g，7.53mmol)，搅拌5h，加甲醇终止反应。柱层析分离，得白色泡沫状固体0.1g，产率37.6％。 Rf＝0.3(DCM/MeOH＝30∶1)。1H NMR(DMSO-d6)：δ0.93，0.98(2s，18H，2tBu)，1.54(m，2H，CH2CH2CH2)，2.02，2.11(2m，4H，C2′-2H，CH2CH2CH2)，3.43(m，2H，CH2CH2CH2O)，3.74(m，1H，C4′-H)，3.85(m，2H，C 5′-H)，4.31(m，1H，C3′-H)，5.36(d，J＝4.4，C3′-OH)，6.20(t，J＝6.8，C1′-H)，7.37，7.59(2m，21H，arom.H，C4-H)，11.38(s，1H，NH)。13C NMR(DMSO-d6)：δ18.79，23.23，26.63，31.08，39.49，63.10，64.07，70.25，83.77，86.52，113.634，127.90，129.90，135.09，150.28，163.21。元素分析：C44H54N2O6Si2(M763.08)，C69.25，H7.13，N3.67；测定值，C68.97，H7.15，N3.39。
1-[(2-去氧-β-D-呋喃核糖-5-(叔丁基二苯基硅基)]-5-(3-叔丁基二苯基硅氧基-丙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3′-[(2-氰乙基)-N，N-二异丙基亚酰胺](16c-p)
将16c(0.8g，1.52mmol溶于DCM(15ml)中，加入二异丙胺-四氮唑盐(0.13g，0.76mmol)，和磷酰化试剂(0.5g，1.67mmol)。此溶液先后用NaHCO3和水洗涤，有机相用无水Na2SO4干燥。柱层析分离，得白色泡沫0.7g，产率55.6％。Rf＝0.5(DCM/丙酮＝15.1)。
1H NMR(DMSO-d6)：δ1.00，1.06(2s，18H，2tBu)，1.18[m，12H，2CH(CH3)2]，1.62，2.13{2m，6H，N[CH(CH3)2]2，OCH2CH2CN，5-CH2CH2CH2}，2.45，2.63(2m，2H，C2′H)，3.46-3.94(m，8H，5-CH2CH2CH2，OCH2CH2CN，C5′-H)，4.09(m，1H，4′H)，4.63(t，J＝4.0，C3′-H)，6.35(t，J＝8.0，C1′-H)，7.26-7.66(m，21H，arom.H，C4-H)，8.09(s，1H，NH)。31P NMR(CDCl3)：149.08，149.11。
实施例2合成核苷单体15c和它的亚磷酰胺单体15c-p
反应路线13核苷单体15c和它的亚磷酰胺单体15c-p的合成路线
1-[(2-去氧-β-D-呋喃核糖-5-(叔丁基二苯基硅基)]-5-(2-叔丁基二苯基硅氧基-乙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(15c)
按文献24中的方法合成5-(叔丁基二苯基硅氧-乙基)-脱氧尿苷。将5-(叔丁基二苯基硅氧-乙基)-脱氧尿苷(0.9g，1.76mmol)溶于DCM(30ml)中，向此溶液中加入咪唑(0.24g，3.53mmol)，然后分批加入TBDPS-C1(0.53g，1.94mmol)。反应结束后，浓缩溶液，柱层析分离得白色泡沫状固体0.85g，产率64.4％。
Rf＝0.3(DCM/MeOH＝30∶1)。1H NMR(DMSO-d6)：δ0.91，1.0(2s，18H，2tBu)，2.08(m，2H，C5-CH2CH2)，2.34(m，2H，C2′-H)，3.63(m，1H，C5-CH2CH2O)，3.74(m，1H，C4′-H)，3.86(m，2H，C5′-H)，4.28(m，1H，C3′-H)，5.32(d，J＝4.4，C3′-OH)，6.19(t，J＝6.4，C1′-H)，7.34-7.64(m，21H，arom.H，C4-H)，11.33(s，1H，NH)。 13C NMR(DMSO-d6)：δ18.66，26.53，30.06，39.50，54.89，61.72，64.04，70.20，83.74，86.45，110.44，127.71，129.91，133.51，134.94，136.87，150.25，162.80。元素分析：C43H52N2O6Si2(M749.05)，C68.95，H7.00，N3.74；测定值，C68.73，H6.89，N3.45。
1-[(2-去氧-β-D-呋喃核糖-5-(叔丁基二苯基硅基)]-5-(叔丁基 二苯基硅氧基-乙基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3′-[(2-氰乙基)-N，N-二异丙基亚酰胺](15c-p)
将化合物15c(0.8g，1.52mmol)溶于DCM(15ml)中，加入二异丙胺-四氮唑盐0.13g(0.76mmol)，磷酰化试剂(0.5g，1.67mmol)。搅拌2h。将此溶液用先后用NaHCO3溶液和盐水洗涤，有机相用无水Na2SO4干燥。柱层析分离，得无色泡沫状固体0.7g，产率55.6％。
Rf＝0.5(DCM/丙酮＝15.1)。1H NMR(CDCl3-d6)：δ1.0-1.59{m，30H，2tBu，N[CH(CH3)2]2}，2.06(m，1H，C2′-Hα)，2.36-2.63(m，5H，C5-CH2，OCH2CH2CN，C2′-Hβ)，3.55-3.94(m，8H，C5-CH2CH2O，N[CH(CH3)2]2，OCH2CH2CN，C5′-H)，4.11(m，1H，C4′-H)，4.58(m，1H，C3′-H)，6.30(m，1H，C1′-H)，7.26-7.68(m，arom.H，C4-H)。 31P NMR(CDCl3)：148.98，149.49。
实施例3合成核苷单体14c和它的亚磷酰胺单体14c-p
反应路线14核苷单体14c和它的亚磷酰胺结构14c-p的合成路线
1-[(2-去氧-β-D-呋喃核糖-5-(叔丁基二苯基硅基)]-5-(叔丁基二苯基硅氧基-甲基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮(14c)
按文献24中的方法合成5-(叔丁基二苯基硅氧甲基)-脱氧尿苷。将5-(叔丁基二苯基硅氧甲基)-脱氧尿苷(0.8g，1.62mmol)溶于DCM(20ml)中，向此溶液中加入咪唑(0.22g，3.24mmol)，并分批加入TBDPS-C1(0.49g，1.78mmol)。反应结束后，柱层析分离，得白色泡沫状固体0.8g，产率67.2％。Rf＝0.3(DCM/MeOH＝30∶1)。1H NMR(DMSO-d6)：δ0.88，0.95(2s，19H，2tBu)，2.04-2.33(m，2H，C2′-H)，3.68-3.89(m，3H，C4′-H，C5′-H)，4.16-4.32(m，3H，C5-CH2O，C3′-H)，5.38(d，J＝4.4，C3′-OH)，6.16(t，J＝6.8，C1′-H)，7.34-7.69(m，21H，arom.H，C4-H)，11.43(s，1H，NH)。13C NMR(DMSO-d6)：δ25.48，26.91，41.29，65.20，66.67，71.65，73.36，77.12，109.76，174.16。元素分析：C42H50N2O6Si2(M735.03)，C68.63，H6.86，N3.81；测定值，C68.66，H6.64，N3.59。
1-[(2-去氧-β-D-呋喃核糖-5-(叔丁基二苯基硅基)]-5-(叔丁基二苯基硅氧基-甲基)-1H，3H-嘧啶-2，4-二酮3′-[(2-氰乙基)-N，N-二异丙基亚酰胺](14c-p)
将化合物14c(0.5g，0.98mmol)，溶于DCM(15ml)中，并加入二异丙胺-四氮唑盐(0.1g，0.5mmol)和磷酰化试剂(0.5g，1.67mmol)。TLC检测反应完全，先后用NaHCO3溶液和盐水洗涤，有机相用无水Na2SO4干燥。柱层析分离，得白色泡沫状固体0.5g，产率56.1％。Rf＝0.7(DCM/丙酮＝15.1)。1H NMR(CDCl3-d6)：δ0.96-1.19{m，30H，2tBu，N[CH(CH3)2]2}，2.04(m，1H，C2′-Hα)，2.47(m，2H，OCH2CH2CN)，2.61(m，1H，C2′-Hβ)，3.56-3.83(m，6H，N[CH(CH3)2]2，OCH2CH2CN，C5′-H)，4.13(m，1H，C4′-H)，4.40(s，2H，C5-CH2)，4.51(m，1H，C3′-H)，6.21(m，1H，C1′-H)，7.26-7.64(m，21H，arom.H，C4-H)，8.08(s，1H，NH)。31P NMR(CDCl3)：149.36，149.79。
实施例4核酸结构的合成与性质研究
1.序列的合成、纯化与鉴定
所有序列均是采用固相亚磷酰胺三酯法，应用ABI公司392RNA/DNA合成仪，按照常规程序进行合成。合成的序列用高效液相色谱进行纯化。最后使用固相萃取柱进行脱盐处理，用MALDI-TOF鉴定，其中带DMT基团的序列用ESI-MS鉴定。
固相亚磷酰胺三酯法主要包括以下步骤：(1)脱保护：用三氟乙酸脱去树脂珠(CPG)末端核苷酸的5′-羟基上的DMT基团，使羟基游离出来；(2)缩合：亚磷酰胺单体用四氮唑活化，形成亚磷酰胺四氮唑活性中间体，并与树脂珠末端核苷酸的5′-羟基发生亲核反应；(3)封闭：为了避免副反应的发生，将偶联反应中未反应的羟基基团用乙酰基封闭；(4)氧化：使亚磷酰胺单体转化为稳定的磷酰胺单体，进入下一个循环过程。
合成好的序列在55℃下，浓氨水中处理2.5h使之从CPG上脱除，同时脱除天然单体的保护基，经检测含有TBDPS保护基的序列(LK-CW-G02至LK-CW-G15)。减压蒸去氨水，用少量水溶解得到无色透明的水溶液。所有的序列均是通过HPLC(色谱柱：Diamonsil，C18，5μ，250×4.6mm)纯化，在0.1M的醋酸铵缓冲溶液中，梯度为30min内CH3CN从20％到100％。表2为部分序列的保留时间。
表2HPLC纯化核酸结构的保留时间。
编号 序列(5′-3′) tR(min) LK-CW-G01 d(13GGGAG) 13.6和16.0 LK-CW-G02 d(14eGGGAG) 15.7和19.3 LK-CW-G03 d(14aGGGAG) 11.2和13.2 LK-CW-G04 d(15eGGGAG) 14.7和18.7 LK-CW-G05 d(15aGGGAG) 11.2 LK-CW-G06 d(16eGGGAG) 15.7和19.3 LK-CW-G07 d(16aGGGAG) 11.67 LK-CW-G13 d(14cGGGAG) 16.8
[0172] 编号 序列(5′-3′) tR(min) LK-CW-G14 d(15cGGGAG) 17.2 LK-CW-G15 d(16cGGGAG) 18.5 LK-CW-G16 d(17GGGAG) 17.6和19.8
其中大部分序列有明显的两个峰，经分别质谱鉴定二者为同一化合物，推测前者是单链寡脱氧核苷酸，后者为G-四螺旋结构。纯化后的序列用HPLC(色谱柱：MACHEREY-NAGEL，C18，5μ，150×4.6mm)脱盐处理。所有序列经过质谱鉴定。表3为部分序列的质谱鉴定结果。
表3核酸结构的MALDI-TOF测定结果
编号 序列(5′-3′) 分子量(计算值) 分子量(测定值) LK-CW-G01 d(13GGGAG) 2173.5 2172.6 LK-CW-G03 d(14aGGGAG) 2125.5 2126.5 LK-CW-G04 d(15eGGGAG) 2441.6 2442.0 LK-CW-G05 d(15aGGGAG) 2139.5 2140.6 LK-CW-G07 d(16aGGGAG) 2153.5 2155.2 LK-CW-G13 d(14cGGGAG) 2365.1 2366.1 LK-CW-G14 d(15cGGGAG) 2379.1 2380.9 LK-CW-G15 d(16cGGGAG) 2393.1 2393.1 D-01 d(14eCTGCATG) 2669.2 2669.5 D-02 d(CATGCAG14f) 2873.2， 2873.6
实施例5利用圆二色谱确定修饰核酸的高级结构
将2μM的核苷酸序列溶于缓冲液中，在室温下测定高级结构的形成和特征峰。如图1可见，LK-CW-01至LK-CW-07均显示出平行四螺旋结构的特征CD谱。峰的位移是因为修饰结构而引起的，但不影响整体的四螺旋结构的形成。图2为双螺旋结构D01+D02的CD谱，具有双螺旋结构的特征峰。
实施例6修饰核酸的抗HIV-1融合活性评价研究
荧光素酶细胞细胞融合实验用来检测由HIV-1介导的细胞融合。首先将TZM-b1细胞铺在96孔板上，50μl/孔的细胞悬浮液，浓度50万/ml，在37℃条件下培养24小时。然后将HL2/3细胞铺在已铺有TZM-b1细胞的96孔板上，50μl/孔的细胞悬浮液，浓度170万/ml，96孔板的第12列作为最低信号的空白对照不加入HL2/3细胞，以50μl/孔的培养基代替。之后加入待测样品(样品以一定浓度在圆底96孔板上逐4倍稀释，稀释至第十孔，十一、十二孔只含有培养基作为对照，样品在加入HL2/3细胞之前配制)。两种细胞在37℃下融合6-8h，之后将细胞裂解，取25μl/孔的细胞裂解液至磷光板(costar，Whitepolystyrene；Corning incorporated，USA)上对应孔，再加入40μl/孔荧光试剂在酶标仪中进行检测。部分核酸结构的活性数据如表4所示。
表4修饰的脱氧核苷酸序列的抑制HIV-1融合的活性
编号 序列(5′-3′) IC50 LK-CW-G01 d(13GGGAG)4 1.38 LK-CW-G02 d(14eGGGAG)4 0.49(0.63) LK-CW-G03 d(14aGGGAG)4 0.37(0.33) LK-CW-G04 d(15eGGGAG)4 3.96 LK-CW-G05 d(15aGGGAG)4 1.44 LK-CW-G06 d(16eGGGAG)4 0.89 LK-CW-G07 d(16aGGGAG)4 0.62 LK-CW-G13 d(14cGGGAG)4 4.97 LK-CW-G14 d(15cGGGAG)4 1.42 LK-CW-G16 d(17GGGAG)4 2.02 D01+D02 2.28
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