植物发育相关蛋白GA20ox及其编码基因和应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102757486 B (45)授权公告日 2014.08.13 CN 102757486 B (21)申请号 201110106896.8 (22)申请日 2011.04.27 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/15(2006.01) C12N 1/19(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/11(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (73)专利权人 中国农业大学 地址 10。

2、0193 北京市海淀区圆明园西路 2 号 (72)发明人 王涛 梁本国 徐光远 马磊 董江丽 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 EP 0703983 A1,1996.04.03, 全文 . CN 101139604 A,2008.03.12, 全文 . 王月华.结缕草GA20氧化酶基因的克隆及遗 传转化研究 .中国博士学位论文全文数据库 农 业科技辑 .2007, 第 D048-7 页 . (54) 发明名称 植物发育相关蛋白 GA20ox 及其编码基因和 应用 (57) 摘要 本发明公开了一种植物发育相关蛋白GA20ox 及其编码基因和应用。 本。

3、发明提供的蛋白质， 是如 下 (a) 或 (b) ： (a) 由序列表中序列 1 所示的氨基 酸序列组成的蛋白质 ； (b)将序列1的氨基酸序列 经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或添加且与植物发育相关的由序列 1 衍生的蛋 白质。 本发明中将含GA20ox基因的重组质粒通过 农杆菌转化法导入烟草， 获得了转基因烟草， 该转 基因烟草的发育水平显著提高， 主要体现为叶面 积、 株高和节间距增大。本发明提供的 GA20ox 基 因具有促进植株生长发育的功能， 因此可用于培 育发育水平增加的转基因植物。本发明对于植物 育种具有重大价值。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 。

4、审查员 于菲 权利要求书 1 页 说明书 8 页 序列表 3 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 序列表3页 附图5页 (10)授权公告号 CN 102757486 B CN 102757486 B 1/1 页 2 1. 一种培育转基因植物的方法， 是将序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 的编码基因导入目的植物中， 得到植株发育水平高于所述目的植物的转基因植物 ； 所述植物为烟草 ； 所述发育水平高体现为叶面面积大和 / 或株高高和 / 或节间距大。 2. 根据权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述编码基因。

5、为如下 1） 或 2） 所示 ： 1） 序列表的序列 2 自 5 末端第 178 至 1278 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 2） 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子。 权 利 要 求 书 CN 102757486 B 2 1/8 页 3 植物发育相关蛋白 GA20ox 及其编码基因和应用 技术领域 0001 本发明涉及一种植物发育相关蛋白 GA20ox 及其编码基因和应用。 背景技术 0002 上世纪中期，“绿色革命” 通过遗传学手段改良作物， 使得全世界粮食总产在短时 间内大幅度提高。随着分子生物学的发展，“绿色革命” 基因被克隆出来， 它们均与赤霉素代 谢或信号转导相关。 000。

6、3 赤霉素 (GA) 是一类重要的植物激素， 具有生物活性的赤霉素在高等植物的整个 生命周期中都发挥着重要的作用， 它可以促进种子萌发、 茎和根的伸长、 叶片伸展、 表皮毛 发育、 花粉管伸长、 花和果实的发育等， 而且植物也可以通过调节内源赤霉素的生物合成来 介导自身对环境因子的应答。 0004 活性赤霉素是由从牻牛儿牻牛儿焦磷酸 (geranylggeranyl diphpsphate GGDP) 合成的， 有三种不同的酶参与活性赤霉素的合成， 它们分别是萜烯合成酶 (TPSs)， 细胞色素 P450单加氧酶(P450s)和2-氧化戊二酸依赖的双加氧酶(2ODDs)。 首先GGDP通过内根。

7、-柯 巴焦磷酸合成酶 (ent-copalyl diphosphate synthase， CPS) 环化成内根 - 柯巴焦磷酸 (ent-copalyl diphosphate， CDP)， CDP被内根-贝壳杉烯合成酶(ent-kaurene synthase， KS)进一步环化成内根-贝壳杉烯(ent-kaurene)。 然后内根-贝壳杉烯通过两个细胞色素 P450 单加氧酶 ) 内根 - 贝壳杉烯氧化酶 (ent-kaurene oxidase， KO) 和内根 - 贝壳杉烯酸 氧化酶 (ent-kuarenoic acid oxidase， KAO) 转化为 GA12- 醛。最后一步。

8、由两个可溶性的 氧化酶参与完成。GA12- 醛和它的 13- 羟基化产物 GA53 通过 GA20- 氧化酶 (gibberellin 20-oxidase， GA20ox) 在 GA12 和 GA53 的 C-20 部位上进行三次连续氧化， 生成 GA9 和 GA20。 GA3- 氧化酶 (gibberellin 3-oxidase， GA3ox) 介导一个 3- 羟基基团到 GA9 和 GA20 上， 生成有生物活性的赤霉素， GA1 和 GA4。由于 GA20ox 在赤霉素合成途径中的最下游， 它的 活性直接影响到活性赤霉素的合成。因此近年来基因 GA20ox 在不同的物种中得到了克隆 。

9、及功能验证， 这些研究都表明 GA20ox 可以促进活性赤霉素的合成， 进而促进植物的生长发 育。 0005 高羊茅又叫苇状羊茅、 苇状狐茅， 为冷地型草坪草， 属禾本科羊茅属多年生草本植 物。高羊茅具有营养丰富、 耐践踏、 抗寒、 抗病、 抗旱等优点， 在我国许多北方城市的草坪种 植中广泛应用。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种植物发育相关蛋白 GA20ox 及其编码基因和应用。 0007 本 发 明 提 供 的 蛋 白 质，名 称 为 GA20ox 蛋 白，来 源 于 高 羊 茅 (Festuca arundinacea)， 是如下 (a) 或 (b) ： 0008 (a) 由序。

10、列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成的蛋白质 ； 0009 (b) 将序列 1 的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和 / 或缺失和 / 或 说 明 书 CN 102757486 B 3 2/8 页 4 添加且与植物发育相关的由序列 1 衍生的蛋白质。 0010 为了使 (a) 中的蛋白质便于纯化， 可在由序列表中序列 1 所示的氨基酸序列组成 的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表 1 所示的标签。 0011 表 1 标签的序列 0012 标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6( 通常为 5 个 ) RRRRR Poly-His 2-10( 通常为 6 个 ) HHHHHH FLA。

11、G 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL 0013 上述 (b) 中的蛋白质可人工合成， 也可先合成其编码基因， 再进行生物表达得到。 上述 (b) 中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列 2 所示的 DNA 序列中缺失一个或几 个氨基酸残基的密码子， 和 / 或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和 / 或在其 5端和 / 或 3端连上表 1 所示的标签的编码序列得到。 0014 编码所述蛋白的基因 (GA20ox 基因 ) 也属于本发明的保护范围。 0015 所述基因可为如下 1) 至 4) 中任一所述的 DNA 分子。

12、 ： 0016 1) 序列表的序列 2 自 5 末端第 178 至 1278 位核苷酸所示的 DNA 分子 ； 0017 2) 序列表中序列 2 所示的 DNA 分子 ； 0018 3) 在严格条件下与 1) 或 2) 限定的 DNA 序列杂交且编码植物发育相关蛋白的 DNA 分子 ； 0019 4) 与 1) 或 2) 限定的 DNA 序列具有 90以上同源性且编码植物发育相关蛋白的 DNA 分子。 0020 上述严格条件可为在 0.1SSPE( 或 0.1SSC)， 0.1 SDS 的溶液中， 在 65条件 下杂交并洗膜。 0021 含有所述基因的重组表达载体、 表达盒、 转基因细胞系或重。

13、组菌均属于本发明的 保护范围。 0022 可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载 体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外 源基因的 3 端非翻译区域， 即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与 mRNA 加工或基因表达的 DNA 片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到 mRNA 前体的 3 端。使用所述基因构 建重组植物表达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启 动子， 它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用 ； 此外， 使用本发明的基因构建植物 表达载体时， 还可使用增强子， 包括翻译增强子或转录。

14、增强子， 这些增强子区域可以是 ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等， 但必需与编码序列的阅读框相同， 以保证整个序列 说 明 书 CN 102757486 B 4 3/8 页 5 的正确翻译。 所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的， 可以是天然的， 也可以是合 成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植 物进行鉴定及筛选， 可对所用植物表达载体进行加工， 如加入可在植物中表达的编码可产 生颜色变化的酶或发光化合物的基因、 具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因 等。从转基因植物的安全性考虑， 可不加任何选择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植。

15、株。 0023 所述重组表达载体具体可为将所述基因插入载体 pCAMBIA1302 的多克隆位点得 到的重组质粒。 0024 扩增所述基因的全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 0025 本发明还保护一种培育转基因植物的方法， 是将所述基因导入目的植物中， 得到 植株发育水平高于所述目的植物的转基因植物。所述基因具体可通过所述重组表达载体 导入所述目的植物中。携带有所述基因的表达载体可通过使用 Ti 质粒、 Bi 质粒、 植物病毒 载体、 直接 DNA 转化、 显微注射、 电导、 农杆菌介导、 基因枪等常规生物学方法转化植物细胞 或组织， 并将转化的植物组织培育成植株。所述植株发育。

16、水平高具体体现为叶面积大和 / 或株高高和 / 或节间距大。所述节间距具体可为植株从下往上数第二节间的长度。所述 目的植物既可以是单子叶植物也可以是双子叶植物。所述双子叶植物具体可为烟草 ( 如 Nicotiana tabacum)。 0026 本发明中， 将含有 GA20ox 基因的重组质粒通过农杆菌转化法导入烟草， 获得了转 基因烟草， 该转基因烟草的发育水平显著提高， 主要体现为叶面积、 株高和节间距增大。本 发明提供的 GA20ox 基因具有促进植株生长发育的功能， 因此可用于培育发育水平增加的 转基因植物。 另一方面， 通过抑制GA20ox基因的表达， 可能培育得到矮化的转基因植物。。

17、 本 发明对于植物育种具有重大价值。 附图说明 0027 图 1 为重组质粒 pCAMBIA1302-GA20ox 的构建流程图。 0028 图 2 为 PCR 扩增获得全长 GA20ox 基因的电泳图。 0029 图 3 为 T0代转基因烟草的 PCR 鉴定电泳图 ； 1 为 1kb DNA ladder， 由下 到 上 分 别 为 250bp， 500bp， 750bp， 1000bp， 1500bp， 2000bp ； 2 为 阳 性 对 照 ( 重 组 质 粒 pCAMBIA1302-GA20ox) ； 3 为阴性对照 ( 野生型烟草 ) ； 4-14 依次为 T0代转基因烟草 L1 。

18、至 L11。 0030 图4为T0代转基因烟草的RT-PCR鉴定电泳图 ； WT为阴性对照(野生型烟草) ； L3、 L6 和 L7 依次为转基因烟草 L3、 L6 和 L7。 0031 图 5 为 T0代转基因烟草的荧光显微镜观察照片 ； A 为野生型烟草在自然光下的照 片 ； B 为野生型烟草在绿色荧光下的照片 ； C 为转基因烟草 L3 在自然光下的照片 ； D 为转基 因烟草 L3 在绿色荧光下的照片。 0032 图 6 为 T0代转基因烟草的表型照片 ； (a) 为叶片照片， (b) 为植株照片 ； WT 为阴性 对照 ( 野生型烟草 ) ； L3、 L6 和 L7 依次为转基因烟草。

19、 L3、 L6 和 L7。 0033 图 7 为 T0代转基因烟草的叶面积统计结果 ； WT 为 15 株野生型烟草叶面积的平均 值 ； GA20ox 为 15 株 T0代植株 ( 转基因烟草 ) 叶面积的平均值。 0034 图 8 为 T0代转基因烟草的节间距统计结果 ； WT 为 15 株野生型烟草节间距的平均 说 明 书 CN 102757486 B 5 4/8 页 6 值 ； GA20ox 为 15 株 T0代植株 ( 转基因烟草 ) 节间距的平均值。 具体实施方式 0035 以下的实施例便于更好地理解本发明， 但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。

20、。 下述实施例中所用的试验材料， 如无特殊说明， 均为自 常规生化试剂商店购买得到的。 以下实施例中的定量试验， 均设置三次重复实验， 结果取平 均值。 高羊茅(Festuca arundinacea) ： 中文名称为追寻者， 英文名称为Quest， 购于东方草 业公司。烟草 (Nicotiana tabacum) ： 购于东方草业公司， 用作实施例的出发植物和野生型 烟草对照。农杆菌 LBA4404 ： 购于天根生化科技有限公司。 0036 实施例 1、 GA20ox 蛋白及其编码基因的发现 0037 1、 利用 SDS 法提取高羊茅的 RNA。 0038 2、 以完整性好、 无污染的 RN。

21、A 为模板， 用 M-MLV 酶 ( 购自 Promage 公司 ) 反转录 RNA 为 cDNA。 0039 3、 中间片段的克隆 0040 根据GA20ox的同源保守序列设计引物(F1和R1 ； (SG/C)， 以高羊茅的cDNA为 模板进行 PCR 扩增， 产物经回收测序， 获得 506bp 的中间片段。 0041 F1(5 引物 ) ： 5 -CTG TCG CTG GAG ATT ATG GAG GTG-3 ； 0042 R1(3 引物 ) ： 5 -GTC TTC ATG TCG GCS CGG TAG TG-3 。 0043 4、 3 - 末端的克隆 0044 根据中间片段的测序。

22、结果设计引物 3 GSP I(gene-specific primer)， 引物序列 是 5 -GAC ACC TTC ATG GCG CTC TCC AAC G-3 ， 为了提高产物特异性， 在 GSPI 下游再设 计一个巣式引物 3 GSPII， 引物序列是 5 -GTT CTT CCT GTG CCC GGA GATGGA C-3 。 0045 利用的通用引物序列如下 ： 0046 AP(adapter primer) ： 5 -ATT CTA GAG GCC GAG GCG GCC GAC ATG TTT TTT TTTTTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT V-3 (。

23、V A/G/C)。 0047 AUAP(abridged universal amplification primer) ： 5 -ATT CTA GAG GCC GAGGCG GCC G-3 。 0048 第 一 轮 PCR 反 应 体 系 (50l) ： 10PCR buffer 5l， dNTP Mix(2.5mM each)4l， 3 GSP I(10M)1l， AP(10M)1l， cDNA 2l， Ex taq DNA聚合酶0.25l， ddH2O 36.75l。 0049 第 二 轮 PCR 反 应 体 系 (50l) ： 10PCR buffer 5l， dNTP Mix(2.。

24、5mM each)4l， 3 GSP II(10M)1l， AUAP(10M)1l， PCR 产物稀释 10 倍 2l， Extaq DNA 聚合酶 0.25l， ddH2O 36.75l。 0050 将第二轮的 PCR 产物电泳检测， 胶回收， 测序分析， 获得 326bp 的 3 末端片段。 0051 5、 5 - 末端的克隆 0052 对 cDNA3末端进行加尾， 反应体系 (50l ； NEB 公司提供 ) ： 末端转移酶 TdT0.5l， 10buffer 5l， dCTP(10mM)1l， CoCl25l，反 转 录 产 物 20l， ddH2O 18.5l。 0053 利用的通用。

25、引物序列如下 ： 说 明 书 CN 102757486 B 6 5/8 页 7 0054 AAP(abridged anchor primer) ： 5 -CTC TCC CCG AGC ACC TCC ATG ATC TCC-3 。 0055 AUAP(abridged universal amplification primer) ： 5 -GGC CAC GCG TCG ACTAGT AC-3 。 0056 根据中间片段的测序结果设计引物 5 GSP I(gene-specific primer)， 引物序列 为 ： 5 GAC GAC GAA GGC GTC GGC CCT GGG C。

26、CG-3 ， 为了提高产物特异性， 在 GSP 0057 I 上游再设计一个巣式引物 GSP II， 引物序列为 ： 5 -GTC GTT GCC CTC GAA GAA GCGCCG-3 。 0058 第 一 轮 PCR 反 应 体 系 (50l) ： 10PCR buffer 5l， dNTP Mix(2.5mM each)4l， 5 GSP I(10M)1l， AAP(10M)1l， cDNA 加尾产物 2l， Ex taq DNA 聚合 酶 0.25l， ddH2O 36.75l。 0059 第 二 轮 PCR 反 应 体 系 (50l) ： 10PCR buffer 5l， dNTP。

27、 Mix(2.5mM each)4l， 5 GSP II(10M)1l， AUAP(10M)1l， PCR 产物稀释 10 倍 2l， EXtaq DNA 聚合酶 0.25l， ddH2O 36.75l。 0060 将第二轮的 PCR 产物电泳检测， 胶回收， 测序分析， 获得 780bp 的 5 末端片段。 0061 6、 全长序列的获得 0062 以高羊茅的 cDNA 为模板， 利用引物 F2 和 R2 进行 PCR 扩增。将 PCR 扩增产物进行 测序， 测序结果表明， PCR 扩增产物的核苷酸序列如序列表的序列 2 所示。 0063 F2(5 引物 ) ： 5 -AGA GCT AAG。

28、 TCA CCA CCT TCC TCC ACT GC-3 ； 0064 R2(3 引物 ) ： 5 -GAC AAC CGA TCG CTC GTA TCT CAG CCT CAG-3 。 0065 将序列表的序列1所示的蛋白质命名为GA20ox蛋白(由366个氨基酸残基组成)。 将 GA20ox 蛋白的编码基因命名为 GA20ox 基因， 其全长序列如序列表的序列 2 所示， 开放阅 读框为序列表的序列 2 自 5 末端第 178 至 1278 位核苷酸。 0066 实施例 2、 转基因植物的获得和鉴定 0067 一、 重组质粒 pCAMBIA1302-GA20ox 的构建 0068 构建。

29、流程图见图 1。 0069 1、 提取高羊茅的总 RNA， 反转录为 cDNA。 0070 2、 以步骤 1 的 cDNA 为模板， 用 GA20ox_5 和 GA20ox_3 组成的引物对进行 PCR 扩 增， 得到 PCR 扩增产物 ( 靶序列为去除起始密码子和终止密码子的 GA20ox 基因开放阅读 框 )。 0071 GA20ox_5 ： 5 -CCA TGG CAG TGC AGC CTG TCT TCG AC-3 ； 0072 GA20ox_3 ： 5 -ACT AGT TGT CGT CGT CGT GGC GGC-3 。 0073 PCR 扩增产物的 1.0琼脂糖凝胶电泳图见图。

30、 2。 0074 3、 将步骤 2 的 PCR 扩增产物插入 pMD18-T simple 载体 ( 购自 TaKaRa 生物工程公 司 )， 得到重组质粒 pMD18-Tsimple-GA20ox。 0075 4、 将重组质粒 pMD18-Tsimple-GA20ox 进行测序， 测序结果表明， PCR 扩增产物的 两端分别为 Nco I 和 Spe I 酶切识别序列， 酶切识别序列之间为序列表的序列 2 自 5 末端 第 181 至 1275 位核苷酸所示的 DNA。 0076 5、 用限制性内切酶 Nco I 和 Spe I 双单酶切重组质粒 pMD18-Tsimple-GA20ox， 。

31、回 收小片段 ( 约 1109bp)。 说 明 书 CN 102757486 B 7 6/8 页 8 0077 6、 用限制性内切酶 Nco I 和 Spe I 双酶切载体 pCAMBIA1302(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriclture， www.cambia.org)， 回收载体骨架 ( 约 10535bp)。 0078 7、将 步 骤 5 的 小 片 段 和 步 骤 6 的 载 体 骨 架 连 接，得 到 重 组 质 粒 pCAMBIA1302-GA20ox(GA20ox 组成型。

32、高效表达载体 )。 0079 根据测序结果， 对重组质粒 pCAMBIA1302-GA20ox 进行结构描述如下 ： 在载体 pCAMBIA1302 的 Nco I 和 Spe I 酶切位点间插入了序列表的序列 2 自 5 末端第 181 至 1275 位核苷酸所示的 DNA( 去除起始密码子和终止密码子的 GA20ox 基因和载体上的 GFP 基因形 成融合基因 )。 0080 二、 重组质粒 pCAMBIA1302-GA20ox 转化农杆菌 0081 1、 农杆菌感受态细胞的制备 0082 (1) 挑取农杆菌 LBA4404 单菌落接种于 100ml YEB 液体培养基中， 振荡培养 (2。

33、20rpm、 28 ) 至 OD600 0.6 ； 0083 (2) 将步骤 (1) 的菌液转入无菌离心管， 5000rpm 离心 5min， 去上清， 将沉淀加入 10ml 预冷的 0.15M CaCl2水溶液， 轻轻悬浮细胞， 冰上放置 20min ； 0084 (3) 将步骤 (2) 的悬浮液离心 (4、 5000rpm)5min， 去上清， 将沉淀加入 4ml 预冷 的含 10 ( 体积百分含量 ) 甘油的 0.15M CaCl2水溶液， 轻轻悬浮 ； 0085 (4) 将步骤 (3) 的悬浮液分装于无菌 eppendorf 管中， 每管 200l， 于液氮中速冻 1min， 冻存于 。

34、-70。 0086 2、 重组质粒转化农杆菌 0087 取 1g 重组质粒 pCAMBIA1302-GA20ox 加入到 200l 农杆菌 LBA4404 感受态细 胞中， 混匀， 静止 5min ； 液氮中速冻 1min， 37水浴 5min， 冰浴 5min， 加入 1ml YEB 液体培 养基， 振荡培养 (28、 150rpm)4h ； 5000rpm 离心 3min， 弃上清， 沉淀加入 0.1mlYEB 液体培 养基， 重新悬浮细胞 ； 涂布于含 50g/ml 卡那霉素和 75g/ml 利福平的 YEB 固体平板上， 28倒置培养约 48h。 0088 3、 PCR 鉴定阳性克隆 。

35、0089 鉴定所用的引物如下 ( 引物是针对骨架载体设计的， 目标片段为 1109bp) ： 0090 5 引物 ： 5 -CCA TGG CAG TGC AGC CTG TCT TCG AC-3 ； 0091 3 引物 ： 5 -ACT AGT TGT CGT CGT CGT GGC GGC-3 。 0092 鉴定结果表明 ： 重组质粒 pCAMBIA1302-GA20ox 已经成功转入农杆菌 LBA4404 中， 得到了重组农杆菌。 0093 三、 转化烟草 0094 1、 将步骤二得到的重组农杆菌接种于 YEB 液体培养液 ( 含有 100g/ml 卡那霉 素、 100g/ml 链霉素和。

36、 75g/m 利福平 ； 卡那霉素抗性基因来自载体 pCAMBIA1302， 链霉 素抗性基因来自农杆菌 LBA4404 自带的辅助质粒 pBA4404， 利福平抗性基因来自农杆菌 LBA4404)， 振荡培养 (28、 220rpm) 至 OD600为 0.6-0.8， 4000rpm 离心 15 分钟， 去上清， 沉 淀用 5-10 倍体积的 MS 液体培养基 (pH5.8) 悬浮， 得到重组农杆菌菌液。 0095 2、 将无菌的烟草叶片切去边缘和主要叶脉， 切成 0.40.6cm2大小的外植体。 0096 3、 将步骤 2 的外植体在步骤 1 的重组农杆菌菌液中浸泡 5 分钟。 说 明 。

37、书 CN 102757486 B 8 7/8 页 9 0097 4、 用无菌滤纸吸干植物材料表面的菌液， 转入上铺一层滤纸的 MS 基本培养基， 25暗培养。 0098 5、 三天后， 将植物材料转到含有抗生素的分化培养基 (MS 基本培养基 +3mg/L 6- 苄氨基嘌呤 +0.2mg/L a- 萘乙酸 +10mg/L 潮霉素 +500mg/L 羧苄青霉素 ) 中进行培养。 0099 6、 待抗性芽生长至 2-3cm 高时， 切下小芽转入生根培养基 (MS 基本培养基 +10mg/ L 潮霉素 +200mg/L 羧苄青霉素 ) 中诱导生根。 0100 7、 待根长至 10-20cm 长 ( 。

38、约 4 周 )， 且具有一定数量即可去掉封口膜， 在组培室中 锻炼2-3天， 然后移栽在花盆中在室温下锻炼2-3周， 最后移栽至大田栽种， 即为T0代植株。 0101 将载体 pCAMBIA1302 导入农杆菌 LBA4404， 得到对照农杆菌 ； 用对照农杆菌代替重 组农杆菌进行步骤 1 至 7， 得到对照植株。 0102 四、 植株的鉴定 0103 1、 PCR 鉴定 0104 分别以T0代植株和对照植株的基因组DNA为模板(重组质粒pCAMBIA1302-GA20ox 作为阳性对照、 野生型烟草作为阴性对照 )， 用 F3( 对应 GA20ox 基因 ) 和 R3( 对应 GFP 基 因。

39、 ) 组成的引物对进行 PCR 鉴定。 0105 F3(5 引物 ) ： 5 -CGG AGA TGG ACA AGG TGG TG-3 ； 0106 R3(3 引物 ) ： 5 -TCA CAC GTG GTG GTG GTG-3 。 0107 PCR 反应体系 (50l) ： ddH2O 37l， 10PCR Buffer 5l， dNTP(25mM)4l， 5 引物 (5pmol/l)1l， 3 引物 (5pmol/l)1l， rTaq 酶 (5U/l)1l， 模板 (1g/ l)1l。 0108 PCR 反应程序 ： 第一轮 ： 94变性 5min ； 第二轮 ： 94变性 50sec。

40、， 66.8复性 50sec， 72延伸 1min10s， 30 个循环 ； 第三轮 ： 72延伸 10min。 0109 反应结束后， PCR扩增产物进行1.0琼脂糖凝胶电泳， 目标条带为959bp左右。 T0 代植株中共有 20 株鉴定为阳性。部分 PCR 阳性植株 (L1 至 L11) 的鉴定结果见图 3。 0110 2、 RT-PCR 鉴定 0111 将 PCR 鉴定为阳性的 20 株植株中的三株 (L3、 L6 和 L7) 和野生型烟草分别进行步 骤 2 的 RT-PCR 检测。 0112 (1)Trizol 法分别提取植株 L3、 L6 和 L7 和野生型烟草的总 RNA。 011。

41、3 (2) 以完整性好、 无污染的总 RNA 为模板， 用 M-MLV 酶 ( 购自 Promage 公司 ) 反转 录 RNA 为 cDNA。 0114 反 转 录 反 应 体 系 (15.0l) ： RNA(1.0g/l)2.0l， Oligd T 2.0l， RNfreeH2O 11.0l。将上述混合物混匀后， 短暂离心将之收集于管底， 72温育 5min， 再立即置于冰上 5min， 再加入以下成分 ( 总体积 25.0l) ： 5M-MLV Buffer 5.0l， dNTP(25mM)1.5l， RTase M-MLV(200U/l)1.0l， HPR(40U/l)0.65l， R。

42、NfreeH2O 1.85l。将上述混合物混匀， 短暂离心将之收集于管底， 在 42温育 60min， 70反应 15min， 取出置于冰上， 离心后储存于 -20。 0115 (3) 以 0.5l 步骤 (2) 的反转录产物 (cDNA) 为模板进行 PCR 扩增， 用 F3 和 R3 组 成的引物对进行 PCR 鉴定。 0116 PCR 反应体系和 PCR 反应程序同步骤 1。 说 明 书 CN 102757486 B 9 8/8 页 10 0117 将 NtActin 作为内参基因， PCR 鉴定内参基因的引物对如下 ： 0118 F4 ： 5 -GGA ATA GTA AGC AAC 。

43、TGG GAC GT-3 ； 0119 R4 ： 5 -CTG AGC CAA TGG TAA TGA CCT G-3 。 0120 结果见图 4。L3、 L6 和 L7 均获得了预期约 959bp 的片段， 表明 GA20ox 基因在烟草 中进行了 RNA 水平的表达。 0121 3、 荧光显微镜下观察 GFP 0122 去除起始密码子和终止密码子的GA20ox基因和载体上的GFP基因形成融合基因， 因此可以通过荧光显微镜下观察转基因烟草根中绿色荧光蛋白， 来进行 GA20ox 基因的鉴 定。 0123 PCR鉴定为阳性的20株T0代植株在荧光显微镜下均显示绿色荧光， 野生型烟草不 能观察到。

44、绿色荧光。L3 和野生型烟草在荧光显微镜下的照片见图 5。 0124 4、 表型观察和性状统计分析 0125 将 PCR 鉴定为阳性的 15 株 T0代植株、 转空载体植株 (15 株 ) 和野生型烟草 (15 株 ) 在成熟期拍照并测量完全展开的叶片的叶面积 ( 用叶片纵径 * 横径来表示叶面积 ) 以 及从下往上数第二节间的长度 ( 节间距 )。结果均取 15 株的平均值。 0126 PCR 鉴定为阳性的 15 株 T0代植株的叶面积和节间距显著大于野生型植株。转空 载体植株的叶面积和节间距与野生型植株没有显著差异。部分植株照片见图 6。叶面积结 果见表 2 和图 7。节间距结果见表 3 。

45、和图 8。 0127 叶面积的结果见表 2 和图 7。节间长度测量结果见表 3 和图 8。 0128 表 2 植株的叶面积 0129 叶面积 (cm2) WT 14.960.773 转基因植株 19.101.762 0130 表 3 植株的节间长度 0131 节间距 (cm) WT 0.690.0446 转基因植株 0.970.1010 0132 结果表明， 转基因烟草的叶片面积和节间长度明显变大， 即即 GA20ox 基因促进了 植株发育。 说 明 书 CN 102757486 B 10 1/3 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102757486 B 11 2/3 页 12 0003 序 列 表 CN 102757486 B 12 3/3 页 13 序 列 表 CN 102757486 B 13 1/5 页 14 图 1 说 明 书 附 图 CN 102757486 B 14 2/5 页 15 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102757486 B 15 3/5 页 16 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102757486 B 16 4/5 页 17 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102757486 B 17 5/5 页 18 图 8 说 明 书 附 图 CN 102757486 B 18 。