一种微生物生产三羟基苯酸的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201610464887.9	申请日：	20160624
公开号：	CN106119304A	公开日：	20161116
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12P7/42,C12R1/80	主分类号：	C12P7/42,C12R1/80
申请人：	青岛科技大学
发明人：	史崇丽,张媛媛,刘均洪
地址：	266061 山东省青岛市崂山区松岭路99号
优先权：	CN201610464887A
专利代理机构：		代理人：
PDF下载：	PDF下载

内容摘要

一种微生物生产三羟基苯酸的方法，具体是一种青霉生物催化制备医药中间体2，3，5‑3羟基‑苯酸的方法，微生物发酵液中加入底物，进行生物催化反应，产品收率高，反应条件温和，常温、常压操作，解决了现有方法生产条件苛刻的困难。

权利要求书

1.一种青霉生物催化制备2，3，5-3羟基-苯酸的方法，其特征在于青霉发酵液中加入底物1，2，3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温8015-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至36-37℃时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V•分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，用乙酸乙酯萃取反应液，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物2，3，5-3羟基-苯酸，反应转化率97.8-99.4％，产品收率95.7-96.9％；所述发酵液由培养液发酵微生物得。 2.权利要求1所述的方法，其特征在于青霉发酵液制备过程如下：青霉经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟冷却至29-31℃，将青霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为8-9％，通气比为1-1.2V/V•分钟，29-31℃培养36-40小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为90-95g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂；发酵罐中培养液成份为：玉米浆(以干物质计)含量为36-40g/L，酵母浸膏7-8g/L，葡萄糖19-21g/L，麦芽浸膏21-23g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.1。

说明书

技术领域

本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到青霉生物催化制备医药中间体2，3，5-3羟基-苯酸的技术。

背景技术

生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸引力的应用领域之一,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。

芳烃的羧化反应是一类重要的反应，其产物为芳烃羟基羧酸，是重要的药物合成起始原料。但是，现在的生产采用传统的化学合成，用芳烃与CO2反应，反应压力高达10MPa，温度高达140-380℃，反应选择性差，副产物多。采用微生物催化，则可能改变这种状况。采用微生物催化，可以在常温、常压下反应生产芳烃羟基羧酸，条件温和，选择性高，副反应少，产率高。

本发明将采用微生物催化反应，生产芳烃羟基羧酸：2，3，5-3羟基-苯酸。

发明内容

本发明采用青霉催化制备2，3，5-3羟基-苯酸，反应式如下：

底物1，2，3-3羟基苯（1）经青霉催化反应，得到产物2，3，5-3羟基-苯酸（2）。有多种微生物可以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用青霉作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，副产物极少，反应收率高。

许多霉菌都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用青霉菌株为IFO 9501 ，其催化反应效果最佳。

由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。尽管表面活性剂增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，属于液-液2相反应，底物、产物的相间传质为反应的限制环节，所以，还需采取措施，以提高反应速度。增加非均相反应的反应界面，是提高非均相反应的有效措施之一。加入表面活性剂后，在强烈搅拌下，反应液成为乳液，使得催化反应界面大幅度增加，从而大幅度提高反应速度。特别是，加入的表面活性剂，必须生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性剂种类和浓度的选择，是非常重要的。大量实验表明，对于本反应，加入吐温80 15-16g/L是最佳的。

反应结束后，用有机溶剂萃取产物。需要破乳，有多种方法可以破乳，包括盐析法：加入氯化钠、硫酸铵或氯化钙、氯化镁、硫酸钙、硫酸镁；凝聚法：加入聚合氯化铝、明矾等；或者将上述2类混合加入；加热等。不同产物，所用的方法不同，实验表明，对于本反应，加入1.7%的硫酸铵+0.036%的聚合氯化铝是最佳的。

羧化反应中，采用NaHCO3提供CO2,实际上，有多种物质可以提供CO2,但是，通过大量实验，结果表明，对于本发明，使用NaHCO3是最佳的。由于加入NaHCO3会使反应液的pH升高，而适宜的pH，对微生物催化反应致关重要，所以，不能一次加入，必须采用流加方式加入NaHCO3。然而，即使流加NaHCO3，反应液的pH仍然升高，所以，还必须采取措施，维持反应液处于适宜的pH，使微生物能够正常发挥生物催化作用。通过大量实验表明，流加盐酸水溶液是适宜的方法，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH处于最佳范围，使生物催化反应正常进行。

可以明显看出，本发明所涉及的微生物菌株选择、表面活性剂选择、破乳剂选择、CO2供体选择，还有反应温度，反应时间，反应pH，底物浓度，生物催化反应液成分确定等，众多因素均需考虑，并且，它们相互影响。特别是，需要从实验室小试、中试，直到工业规模反应，更是大幅度增加了工作难度、工作量。所以，实验设计至管重要，如此多的因素，生物催化反应动力学理论分析和实验工作量巨大。

培养介质：

1、种子培养基成份为: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，麦芽浸膏25-30 g，硫酸铵0.5-0.7g/L;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。

2、培养液成份：玉米浆( 以干物质计)含量为36-40g/L，酵母浸膏7-8 g/L，葡萄糖19-21 g/L，麦芽浸膏21-23g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙 0.7 g/L,硫酸亚铁 0.18 g/L,硫酸锰 0.025 g/L;pH 6.1。

2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。

微生物发酵液制备。青霉IFO 9501经斜面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7，121℃高压灭菌30分钟冷却至29-31℃，将青霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为8-9％，通气比为1-1.2V/V•分钟，29-31℃培养36-40小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为90-95g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。

用HPLC测产品收率及纯度，C18柱，紫外检测器，波长254nm，流动相为pH3的磷酸缓冲液：甲醇=90:10。

生物催化反应：发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物1，2，3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22 g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至36-37℃时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V•分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸乙酯萃取反应液萃取3次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物2，3，5-3羟基-苯酸，反应转化率97.8-99.4％，产品收率95.7-96.9％。

实施例1

培养液成份：玉米浆( 以干物质计)含量为36-40g/L，酵母浸膏7-8 g/L，葡萄糖19-21 g/L，麦芽浸膏21-23g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙 0.7 g/L,硫酸亚铁 0.18 g/L,硫酸锰 0.025 g/L;pH 6.1。

生物催化反应：15L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物 1，2，3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22 g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至36-37℃时，搅拌乳化，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V•分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸乙酯萃取反应液萃取3次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物2，3，5-3羟基-苯酸，反应转化率97.8-99.4％，产品收率95.7-96.9％。

实施例2

培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。

生物催化反应：150L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物1，2，3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22 g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至36-37℃时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V•分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，分别用0.2倍、0.15倍、0.1倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液各萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物2，3，5-3羟基-苯酸，反应转化率98.4％，产品收率96.1％。

实施例 3

培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。

生物催化反应：1000L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物1，2，3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22 g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至36-37℃时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V•分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，分别用0.2倍、0.15倍、0.1倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液各萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物2，3，5-3羟基-苯酸，反应转化率97.8％，产品收率95.7％。

实施例 4

培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。

生物催化反应：15000L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物1，2，3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温80 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22 g/L，121℃高压灭菌30分钟；冷却至36-37℃时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5％的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1％的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V•分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，用逆流萃取机萃取，萃取液为乙酸乙酯，蒸出有机相的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物2，3，5-3羟基-苯酸，反应转化率99.4％，产品收率96.9％。

资源描述

《一种微生物生产三羟基苯酸的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种微生物生产三羟基苯酸的方法.pdf（6页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610464887.9 (22)申请日 2016.06.24 (71)申请人青岛科技大学地址 266061 山东省青岛市崂山区松岭路 99号 (72)发明人史崇丽张媛媛刘均洪 (51)Int.Cl. C12P 7/42(2006.01) C12R 1/80(2006.01) (54)发明名称一种微生物生产三羟基苯酸的方法 (57)摘要一种微生物生产三羟基苯酸的方法，具体是一种青霉生物催化制备医药中间体2， 3， 5-3羟基-苯酸的方法，微生物发酵液中加入底。

2、物，进行生物催化反应，产品收率高，反应条件温和，常温、常压操作，解决了现有方法生产条件苛刻的困难。权利要求书1页说明书4页 CN 106119304 A 2016.11.16 CN 106119304 A 1.一种青霉生物催化制备2， 3， 5-3羟基-苯酸的方法，其特征在于青霉发酵液中加入底物1， 2， 3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温8015-16g/L，木糖 20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22g/L， 121高压灭菌30分钟；冷却至36-37时，搅拌乳化，进。

3、行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，用乙酸乙酯萃取反应液，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物2， 3， 5-3羟基-苯酸，反应转化率97.8-99.4，产品收率95.7- 96.9；所述发酵液由培养液发酵微生物得。 2.权利要求1所述的方法，其特征在于青霉发酵液制备过程如下：青霉经斜面、。

4、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7， 121高压灭菌30分钟冷却至29-31，将青霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为8-9，通气比为1-1.2V/V分钟， 29-31培养36-40小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为90-95g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂；发酵罐中培养液成份为：玉米浆(以干物质计)含量为36-40g/L，酵母浸膏7-8 g/L，葡萄糖19-21g/L，麦芽浸膏21-23g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18。

5、g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.1。权利要求书 1/1 页 2 CN 106119304 A 2 一种微生物生产三羟基苯酸的方法技术领域 0001 本发明属于制药工程技术领域，特别涉及到青霉生物催化制备医药中间体2， 3， 5- 3羟基-苯酸的技术。背景技术 0002 生物催化具有催化效率高、选择性强、条件温和、环境友好等突出优点,是可持续发展过程中替代和拓展传统有机化学合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸引力的应用领域之一,在工业生物催化中一直扮演着重要角色。 0003 芳烃的羧化反应是一类重要的反应，其产物为芳烃羟基羧酸，是重要的药物合成起始原料。

6、。但是，现在的生产采用传统的化学合成，用芳烃与CO2反应，反应压力高达10MPa，温度高达140-380，反应选择性差，副产物多。采用微生物催化，则可能改变这种状况。采用微生物催化，可以在常温、常压下反应生产芳烃羟基羧酸，条件温和，选择性高，副反应少，产率高。 0004 本发明将采用微生物催化反应，生产芳烃羟基羧酸： 2， 3， 5-3羟基-苯酸。发明内容 0005 本发明采用青霉催化制备2， 3， 5-3羟基-苯酸，反应式如下：底物1， 2， 3-3羟基苯（1）经青霉催化反应，得到产物2， 3， 5-3羟基-苯酸（2）。有多种微生物可。

7、以催化此反应，经过大量实验筛选，最终确定采用青霉作为催化剂，因为其催化反应的效果最好，副产物极少，反应收率高。 0006 许多霉菌都可以进行生物催化此反应，然而，其效果不同，相差很大，经实验，本发明选用青霉菌株为IFO9501，其催化反应效果最佳。 0007 由于底物溶解度较低，所以，加入表面活性剂以增加底物的溶解度。尽管表面活性剂增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，属于液-液2相反应，底物、产物的相间传质为反应的限制环节，所以，还需采取措施，以提高反应速度。增加非均相反应的反应界面，是提高非均相反应的有效措施之一。加入表面活性剂后。

8、，在强烈搅拌下，反应液成为乳液，使得催化反应界面大幅度增加，从而大幅度提高反应速度。特别是，加入的表面活性剂，必须生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性剂种类和浓度的选择，是非常重要的。大量实验表明，对于本反应，加入吐温8015-16g/L是最佳的。说明书 1/4 页 3 CN 106119304 A 3 0008 反应结束后，用有机溶剂萃取产物。需要破乳，有多种方法可以破乳，包括盐析法：加入氯化钠、硫酸铵或氯化钙、氯化镁、硫酸钙、硫酸镁；凝聚法：加入聚合氯化铝、明矾等；或者将上述2类混合加入；加热等。不同产物，所用的。

9、方法不同，实验表明，对于本反应，加入 1.7%的硫酸铵+0.036%的聚合氯化铝是最佳的。 0009 羧化反应中，采用NaHCO3提供CO2,实际上，有多种物质可以提供CO2,但是，通过大量实验，结果表明，对于本发明，使用NaHCO3是最佳的。由于加入NaHCO3会使反应液的pH升高，而适宜的pH，对微生物催化反应致关重要，所以，不能一次加入，必须采用流加方式加入 NaHCO3。然而，即使流加NaHCO3，反应液的pH仍然升高，所以，还必须采取措施，维持反应液处于适宜的pH，使微生物能够正常发挥生物催化作用。通过大量实验表明，流加盐酸水溶液。

10、是适宜的方法，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH处于最佳范围，使生物催化反应正常进行。 0010 可以明显看出，本发明所涉及的微生物菌株选择、表面活性剂选择、破乳剂选择、 CO2供体选择，还有反应温度，反应时间，反应pH，底物浓度，生物催化反应液成分确定等，众多因素均需考虑，并且，它们相互影响。特别是，需要从实验室小试、中试，直到工业规模反应，更是大幅度增加了工作难度、工作量。所以，实验设计至管重要，如此多的因素，生物催化反应动力学理论分析和实验工作量巨大。 0011 培养介质： 1、种子培养基成份为:酵母提取物。

11、10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，麦芽浸膏 25-30g，硫酸铵0.5-0.7g/L;配制固体培养基时添加15g/L的琼脂粉。 0012 2、培养液成份：玉米浆(以干物质计)含量为36-40g/L，酵母浸膏7-8g/L，葡萄糖19-21g/L，麦芽浸膏21-23g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8- 2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.1。 0013 2、固体培养基成份：在液体培养基中加入2%的琼脂粉。 0014 微生物发酵液制备。青霉IFO9501经斜。

12、面、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7， 121高压灭菌30分钟冷却至29-31，将青霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为8-9，通气比为1-1.2V/V分钟， 29-31培养36-40小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为90-95g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。 0015 用HPLC测产品收率及纯度， C18柱，紫外检测器，波长254nm，流动相为pH3的磷酸缓冲液：甲醇=90:10。 0016 生物催化反应：发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物1， 2， 3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，。

13、补加以下成份，使浓度为：吐温8015-16g/L，木糖20-24g/ L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22g/L， 121高压灭菌30分钟；冷却至36-37 时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为 5的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸乙酯萃取反应液。

14、萃取3次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物2， 3， 5-3羟基-苯酸，反应转化率 97.8-99.4，产品收率95.7-96.9。 0017 实施例1 说明书 2/4 页 4 CN 106119304 A 4 培养液成份：玉米浆(以干物质计)含量为36-40g/L，酵母浸膏7-8g/L，葡萄糖19-21 g/L，麦芽浸膏21-23g，硫酸铵0.5-0.7g/L，硫酸镁0.3-0.4g/L，磷酸二氧钾1.8-2.3g/L，碳酸钙0.7g/L,硫酸亚铁0.18g/L,硫酸锰0.025g/L;pH6.1。 0018 微生物发酵液制备。青霉IFO9501经斜面、。

15、摇瓶、种子罐培养得到种子液；发酵罐加入培养液，装料系数为0.6-0.7， 121高压灭菌30分钟冷却至29-31，将青霉菌种子液接种至发酵罐，接种比例为8-9，通气比为1-1.2V/V分钟， 29-31培养36-40小时，发酵液中湿酵母细胞浓度为90-95g/L，此发酵液用作生物催化反应催化剂。 0019 生物催化反应： 15L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物 1， 2， 3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温8015-16g/L，木糖20- 24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、。

16、黑豆粉18-22g/L， 121高压灭菌30分钟；冷却至 36-37时，搅拌乳化，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V 分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，用0.2倍反应液体积乙酸乙酯萃取反应液萃取3次，合并有机相，有机相蒸出乙酸乙酯，得到产物2， 3， 5-3羟基-苯酸，反应转化率97.8-99.4，。

17、产品收率95.7-96.9。 0020 实施例2 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。 0021 生物催化反应： 150L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物 1， 2， 3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温8015-16g/L，木糖20- 24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22g/L， 121高压灭菌30分钟；冷却至 36-37时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1的盐酸水溶液，调节。

18、NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，分别用0.2倍、 0.15倍、 0.1倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液各萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物2， 3， 5-3羟基-苯酸，反应转化率98.4，产品收率96.1。 0022 实施例3 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。 0023 生物催化反应： 1000L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物1， 2， 3-3羟基苯，使浓度为90-9。

19、5g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温8015-16g/L，木糖 20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22g/L， 121高压灭菌30分钟；冷却至36-37时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，分别用0.2倍、 0.15倍。

20、、 0.1倍反应液体积的乙酸乙酯萃取反应液各萃取1次，合并有机相，蒸出乙酸乙酯，得到产物2， 3， 5-3 羟基-苯酸，反应转化率97.8，产品收率95.7。 0024 实施例4 说明书 3/4 页 5 CN 106119304 A 5 培养液成份及微生物发酵液制备同实施例1。 0025 生物催化反应： 15000L发酵罐,即制备微生物发酵液发酵罐，在其发酵液中加入底物1， 2， 3-3羟基苯，使浓度为90-95g/L，补加以下成份，使浓度为：吐温8015-16g/L，木糖 20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麦芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22g/L，。

21、 121高压灭菌30分钟；冷却至36-37时，搅拌乳化，进行生物催化反应，反应时间为44-48小时；反应开始时，立即流加浓度为5的NaHCO3水溶液，同时流加浓度为1的盐酸水溶液，调节NaHCO3与盐酸水溶液的流加速率，维持pH6.1-6.4，所加入的物料均经过灭菌处理；通气比为0.7-0.8V/V分钟,即每分钟通气量为0.7-0.8倍反应液体积，反应结束后，破乳，用逆流萃取机萃取，萃取液为乙酸乙酯，蒸出有机相的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到产物2， 3， 5-3羟基-苯酸，反应转化率 99.4，产品收率96.9。说明书 4/4 页 6 CN 106119304 A 6 。

展开阅读全文