一种直投式凝结芽孢杆菌发酵剂的制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102433279 B (45)授权公告日 2012.11.28 CN 102433279 B *CN102433279B* (21)申请号 201110418728.2 (22)申请日 2011.12.15 CGMCC No. 5233 2011.09.09 C12N 1/20(2006.01) C12N 1/04(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (73)专利权人 天津科技大学 地址 300457 天津市塘沽区经济技术开发区 第 13 大街 29 号 (72)发明人 王海宽 戚薇 周超 (74)专利代理机构 天津盛理知识产权代理有限 公司 1。

2、2209 代理人 王来佳 (54) 发明名称 一种直投式凝结芽孢杆菌发酵剂的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种直投式凝结芽孢杆菌发酵剂 的制备方法， 将凝结芽孢杆菌发酵液进行浓缩， 发酵液浓缩条件为 ： 离心转速 6000r/min， 离心 20min， 离心温度为 4， 添加保护剂， 所采用的保 护剂为含有 5 m/m 蔗糖和 10 m/m 麦芽糊精 的水溶液， 将菌泥加入到保护剂的水溶液中， 采 用真空干燥法干燥， 干燥温度选为 60， 干燥压 力选为 12000Pa。本发明所得的发酵剂活菌数为 3.241010cfu/g， 其芽孢率达 90.3， 按照 1的 接种量便可达到理想的液。

3、态和固态发酵效果。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 孙谦 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 9 页 附图 4 页 1/1 页 2 1. 一种直投式凝结芽孢杆菌发酵剂的制备方法， 其特征在于 ： 将凝结芽孢杆菌发酵液 进行浓缩获得菌泥， 发酵液浓缩条件为 ： 离心转速 6000r/min， 离心 20min， 离心温度为 4， 将菌泥加入到保护剂的水溶液中， 所采用的保护剂为含有5% m/m蔗糖和10% m/m麦芽糊精 的水溶液， 采用真空干燥法干燥， 干燥温度选为 60， 。

4、干燥压力选为 12000 Pa ； 所述凝结芽 孢杆菌的名称为 TQ33， 保藏编号为 ： CGMCC No. 5233， 分类名称 Bacillus coagulans， 所述 菌泥与保护剂的体积比 1:2-5。 权 利 要 求 书 CN 102433279 B 2 1/9 页 3 一种直投式凝结芽孢杆菌发酵剂的制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物制剂领域， 是一种直投式凝结芽孢杆菌发酵剂的制备方法。 背景技术 0002 凝结芽孢杆菌是一类具有端生芽孢结构的兼性厌氧杆菌， 是对宿主有益的正常微 生物。其被广泛添加到各种食品和饲料中， 食用后在体内的繁殖和定植能力强， 活菌数高， 对人。

5、体健康十分有利。凝结芽孢杆菌对人体的保健作用主要通过两种途径 ： 一是凝结芽孢 杆菌菌体本身的作用， 它可以产生大量有益代谢产物， 抑制腐败菌的生长， 维持机体肠道菌 群平衡 ； 二是其代谢产物， 可促进肠蠕动， 增强酶的活力， 帮助机体消化吸收。 0003 直投式发酵剂 (directed vat set， DVS) 是指一系列高度浓缩和标准化的干燥发 酵剂菌种， 可直接加入热处理的原料进行发酵而无需对其进行活化、 扩培等其他预处理工 作。目前国内外直投式凝结芽孢杆菌发酵剂尚未有产品。直投式凝结芽孢杆菌制剂具有以 下优点 ： 活菌含量高， 接种量小， 生产成本低 ； 保藏期长 ； 方便运输、。

6、 购买 ； 可有效防止菌种 污染及其退化， 提高产品品质 ； 无需扩大培养， 有效缩短生产周期， 提高劳动生产率。 发明内容 0004 本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供一种成本低、 操作简单、 具有独特优 势的直投式凝结芽孢杆菌发酵剂的制备方法。 0005 本发明实现目的的技术方案如下 ： 0006 一种直投式凝结芽孢杆菌发酵剂的制备方法， 将凝结芽孢杆菌发酵液进行浓缩， 发酵液浓缩条件为 ： 离心转速 6000r/min， 离心 20min， 离心温度为 4， 添加保护剂， 所采用 的保护剂为含有 5 m/m 蔗糖和 10 m/m 麦芽糊精的水溶液， 将菌泥加入到保护剂的水溶 液中。

7、， 采用真空干燥法干燥， 干燥温度选为 60， 干燥压力选为 12000Pa。 0007 而且， 所述凝结芽孢杆菌的名称为TQ33， 分类名称Bacillus coagulans， 保藏编号 为 ： CGMCC No.5233， 保藏日期 ： 2011 年 9 月 9 日， 保藏地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号 院 3 号， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 0008 而且， 所述凝结芽孢杆菌液体种子培养基为 g/L ： 蛋白胨 20.0、 酵母膏 10.0、 葡萄 糖 20.0、 CaCO3为 10.0， pH7.2-7.4 ； 培养条件为 ： 37培养 2。

8、0h。 0009 而且， 所述菌泥与保护剂的水溶液的体积比 1 2-5。 0010 而且， 所述凝结芽孢杆菌真空干燥存活率为 90.3， 活菌数达 3.241010cfu/g。 0011 而且， 所述凝结芽孢杆菌发酵剂按 1的接种量应用于液态发酵， 最高活菌数为 8.1109cfu/mL。 0012 而且， 所述凝结芽孢杆菌发酵剂按 1的接种量应用于固态发酵， 最高活菌数为 1.01010cfu/g。 0013 本发明的优点和积极效果 ： 0014 1、 本发明中凝结芽孢杆菌 TQ33 菌株通过高密度放大培养后， 采用真空干燥法制 说 明 书 CN 102433279 B 3 2/9 页 4 。

9、备菌体发酵剂。用本方法生产的直投式凝结芽孢杆菌发酵剂的存活率为 90.3， 活菌数达 3.561010cfu/g， 按照 1的接种量便可达到理想的液态和固态发酵效果。基于本菌株开 发了一种新型高活性低成本的直投式凝结芽孢杆菌发酵剂的制备方法。 0015 2、 本发明首次采用真空干燥法制备直投式凝结芽孢杆菌发酵剂， 与原液态种子接 种相比， 发酵剂具有接种量小， 直接使用， 节约劳动力， 缩短生产周期 ； 可有效地防止菌种污 染及退化 ； 保存管理方便， 产品品质稳定等优势。 0016 3、 本发明确定了凝结芽孢杆菌在浓缩过程中采用离心转速 6000r/min， 4下离心 20min， 离心得率。

10、为 93.27。 0017 4、 本发明确定了菌体真空干燥过程中保护剂为含 5 m/m 蔗糖和 10 m/m 麦芽糊 精的水溶液， 最终凝结芽孢杆菌存活率为 90.3， 活菌数为 3.241010cfu/g。 0018 5、 用本发明方法制备的直投式凝结芽孢杆菌发酵剂按 1的接种量应用于液态发 酵， 最高活菌数为 8.1109cfu/mL。 0019 6、 用本发明方法制备的直投式凝结芽孢杆菌发酵剂按 1的接种量应用于固态发 酵， 最高活菌数为 1.01010cfu/g。 附图说明 0020 图 1 为本发明 200L 发酵罐生长曲线 ； 0021 图 2 为本发明单一保护剂对凝结芽孢杆菌真空。

11、干燥存活率的影响 ； 其中， 1 水平各 保护剂浓度为 ： 蔗糖 3， 乳糖 3， 海藻糖 3， 谷氨酸钠 3， 麦芽糊精 3， 脱脂奶粉 3； 2 水平各保护剂浓度为 ： 蔗糖 5， 乳糖 5， 海藻糖 5， 谷氨酸钠 5， 麦芽糊精 5， 脱脂 奶粉 5 ； 0022 图 3 为本发明复合保护剂对凝结芽孢杆菌真空干燥存活率的影响， 其中， 1 号 5 蔗糖 ； 2 号 5蔗糖 +10脱脂奶粉 ； 3 号 5蔗糖 +10脱脂奶粉 +3谷氨酸钠 ； 4 号 5蔗 糖 +10麦芽糊精 ； 5 号 5蔗糖 +10脱脂奶粉 +5谷氨酸钠 ； 0023 图 4 为本发明温度对凝结芽孢杆菌真空干燥存活率。

12、的影响 ； 0024 图 5 为本发明压力对凝结芽孢杆菌真空干燥存活率的影响 ； 0025 图 6 为本发明直投式凝结芽孢杆菌发酵剂液态发酵接种效果比较 ； 0026 图 7 为本发明直投式凝结芽孢杆菌发酵剂固态发酵接种效果比较。 具体实施方式 0027 下面结合实施例， 对本发明进一步说明， 下述实施例是说明性的， 不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 0028 本发明使用的菌种为凝结芽孢杆菌 TQ33， 分类名称 Bacillus coagulans， 保藏编 号为 ： CGMCC No.5233， 保藏日期 ： 2011 年 9 月 9 日， 保藏地址为 ： 北京市朝。

13、阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。 0029 1. 种子及发酵培养基 ： 0030 液态种子培养基 (g/L) ： 蛋白胨 20.0、 酵母膏 10.0、 葡萄糖 20.0、 CaCO310.0， pH7.2-7.4。 0031 液态发酵培养基 (g/L) ： 蛋白胨 10.0、 酵母膏 10.0、 葡萄糖 6.0， pH7.0。 说 明 书 CN 102433279 B 4 3/9 页 5 0032 2. 菌体活化 ： 0033 将甘油管冻藏的菌种接到装有50mL液体种子培养基的250mL摇瓶中， 37摇瓶培 养 20 小时。 003。

14、4 3. 菌体种子发酵培养 ： 0035 将活化好的菌种以 5的接种量接到装液量为 100mL 的 500mL 摇瓶中， 于 371 摇瓶培养 20 小时。 0036 4. 菌体的高密度放大培养 ： 0037 (1)50L 种子罐培养 0038 以 8的接种量将凝结芽孢杆菌接种于起始装液量为 30L 的种子罐中， 发酵温度 为 37， 起始搅拌转速 320r/min， 通风量为 1 0.7， 罐压为 0.05MPa。培养 20 小时。 0039 (2)200L 发酵罐培养 0040 以 4.0的接种量将凝结芽孢杆菌接种于 200L 罐进行发酵培养， 装液量为罐体积 的 60， 发酵温度为 37。

15、， 起始搅拌转速 220r/min， 通风量为 1 0.5， 培养 20 小时。 0041 5. 离心分离 ： 0042 采用离心法浓缩分离菌体， 分离条件为 ： 6000r/min 离心 20min， 离心温度为 4。 0043 离心效果测定 ： 0044 0045 0046 0047 6. 菌悬液的制备 ： 0048 离心后， 弃去上清液， 将浓缩后的菌泥添加配置好的复合保护剂制成菌悬浮液， 菌 泥与复合保护剂体积比为 1 3。 0049 7. 真空干燥 ： 0050 将加入保护剂的菌种经真空干燥 10 小时， 制得高活力凝结芽孢杆菌发酵剂。 0051 真空干燥存活率测定 0052 取待测。

16、样品干燥菌粉于超净工作台， 加入 10mL 无菌生理盐水， 静置 20min 使其复 水， 然后采用倾注计数法测定活菌数， 存活率按下式计算 ： 0053 0054 9. 菌体浓度的测定 ： 0055 平板倾注法计数， 用移液管取 1mL 菌液加进 9mL 无菌生理盐水试管中， 混合均匀， 依次做10倍梯度稀释， 取1mL稀释后菌液注入平板中， 每个稀释度做三个平行， 再将融化后 的计数培养基倒入平板， 将菌液与培养基混匀， 凝固后 37培养 48h。 说 明 书 CN 102433279 B 5 4/9 页 6 0056 以下是对直投式凝结芽孢杆菌 TQ33 发酵剂制备条件的确定， 包括最适。

17、菌体收获 时间、 离心时间、 离心力、 真空干燥保护剂、 温度、 压力等参数的确定， 以及直投式凝结芽孢 杆菌发酵剂的应用效果的测定。 0057 一、 最适菌体收获时间的确定 ： 0058 筛选实例 1 0059 液态发酵进行 6h 后从发酵罐中取样， 平板倾注法计数， 测该时刻活菌数。 0060 测得活菌数为 ： 1.5108cfu/mL。 0061 筛选实例 2 0062 液态发酵进行 16h 后从发酵罐中取样， 平板倾注法计数， 测该时刻活菌数。 0063 测得活菌数为 ： 8.2108cfu/mL。 0064 结果 0065 从绘出的发酵过程凝结芽孢杆菌生长曲线可知 ( 附图 1)， 。

18、发酵进行 16h 左右活菌 数达到最大， 约为 8.2108cfu/mL， 进入稳定期， 活菌数基本保持不变， 因此最适菌体收获 时间为 16h-20h。 0066 二、 离心分离 ： 0067 1、 发酵液 pH 对分离效果的影响 0068 筛选实例 1 0069 取发酵罐中培养 16h 的菌液， 不调节其 pH， 在 6000r/min、 4离心 20min 的条件下 收集上清液和沉淀物， 分别进行活菌计数， 计算离心收得率。 0070 测得离心沉积物活菌数为 3.81010cfu/g ； 上清液活菌数为 2.4104cfu/g ； 离心 得率为 82.1。 0071 筛选实例 2 007。

19、2 取发酵罐中培养 16h 的菌液用 NaOH 调节 pH 到 6.8， 在 6000r/min、 4离心 20min 的条件下收集上清液和沉淀物， 分别进行活菌计数， 计算离心收得率。 0073 测得 ： 离心沉积物活菌数为 3.91010cfu/g ； 上清液活菌数为 2.23104cfu/g ； 离 心得率为 84.9。 0074 结果 0075 发酵液 pH 对凝结芽孢杆菌的离心收得率影响不显著 ( 附表 1)， 因此， 对发酵 液 pH 不作调整， 可节省劳动强度， 简化操作工艺， 离心收得率为 82.1， 沉积物活菌数为 3.81010cfu/g。 0076 2、 离心时间对分离效。

20、果的影响 0077 筛选实例 1 0078 离心力为 4297g(5000r/min) 时， 4离心 15min 后， 收集上清液和沉淀物， 分别进 行活菌计数， 计算离心收得率。 0079 测得 ： 离心沉积物活菌数为 3.781010cfu/g ； 上清液活菌数为 2.31104cfu/g ； 离心得率为 85.67。 0080 筛选实例 2 0081 离心力为 5157g(6000r/min) 时， 4离心 15min 后， 收集上清液和沉淀物， 分别进 行活菌计数， 计算离心收得率。 说 明 书 CN 102433279 B 6 5/9 页 7 0082 测得 ： 离心沉积物活菌数为 。

21、3.791010cfu/g ； 上清液活菌数为 1.47104cfu/g ； 离心得率为 89.20。 0083 筛选实例 3 0084 离心力为 5157g(6000r/min) 时， 4离心 20min 后， 收集上清液和沉淀物， 分别进 行活菌计数， 计算离心收得率。 0085 测得 ： 离心沉积物活菌数为 3.631010cfu/g ； 上清液活菌数为 1.16104cfu/g ； 离心得率为 93.92。 0086 结果 0087 离心 15min-20min， 离心得率较高， 但以 6000r/min， 离心 20min 时， 离心得率最高 为93.92(附表2)， 且与5000r。

22、/min， 离心15min的离心得率差异显著， 所以离心时间定为 20min。 0088 3、 离心力对分离效果的影响 0089 筛选实例 1 0090 离心力为 4297g(5000r/min) 时， 4离心 20min 后， 收集上清液和沉淀物， 分别进 行活菌计数， 计算离心收得率。 0091 测得 ： 离心沉积物活菌数为 3.711010cfu/g ； 上清液活菌数为 2.4103cfu/g ； 离 心得率为 89.48。 0092 筛选实例 2 0093 离心力为 5157g(6000r/min) 时， 4离心 20min 后， 收集上清液和沉淀物， 分别进 行活菌计数， 计算离心收。

23、得率。 0094 测得 ： 离心沉积物活菌数为 3.631010cfu/g ； 上清液活菌数为 1.16104cfu/g ； 离心得率为 93.92。 0095 筛选实例 3 0096 离心力为 6451g(8000r/min) 时， 4离心 20min 后， 收集上清液和沉淀物， 分别进 行活菌计数， 计算离心收得率。 0097 测得 ： 离心沉积物活菌数为 3.141010cfu/g ； 上清液活菌数为 6.5103cfu/g ； 离 心得率为 83.44。 0098 结果 0099 随着离心力的增大， 离心得率逐渐降低， 以 5000r/min 离心 20min， 离心得率为 89.48。

24、， 其他离心力条件下离心20min， 离心得率均较低， 其中7000r/min离心20min， 离心 得率降低为 90.70 ( 附表 3)， 表明 7000r/min 离心 20min 为离心得率的临界条件。故选 择 6000r/min 离心 20min。 0100 4、 离心温度对分离效果的影响 0101 筛选实例 1 0102 离心力为4348g(5000r/min)时， 20离心20min后， 收集上清液和沉淀物， 分别进 行活菌计数， 计算离心收得率。 0103 测得 ： 离心沉积物活菌数为 3.041010cfu/g ； 上清液活菌数为 3.46104cfu/g ； 离心得率为 7。

25、8.27。 0104 筛选实例 2 说 明 书 CN 102433279 B 7 6/9 页 8 0105 离心力为5257g(6000r/min)时， 20离心20min后， 收集上清液和沉淀物， 分别进 行活菌计数， 计算离心收得率。 0106 测得 ： 离心沉积物活菌数为 3.791010cfu/g ； 上清液活菌数为 2.64104cfu/g ； 离心得率为 86.30。 0107 结果 0108 离心力和离心时间不变， 温度增加， 凝结芽孢杆菌的离心得率降低(附表4)。 相同 条件下， 4比 20离心得率提高约 4 -10。故选择在 4下离心。 0109 三、 真空干燥保护剂的确定 。

26、0110 以下提及的保护剂的浓度均为对应物质的水溶液的重量百分比浓度。 0111 1、 单一保护剂的确定 ： 0112 筛选实例 1 0113 收集离心后的菌泥， 以重量百分比为 3的蔗糖水溶液作为保护剂， 按保护剂与菌 泥的体积比为 3 1 的比例混合。测定真空干燥前后的活菌数， 计算菌体存活率。 0114 测得存活率为 12.6。 0115 筛选实例 2 0116 收集离心后的菌泥， 以重量百分比为 3的海藻糖作为保护剂， 按保护剂与菌泥的 体积比为 3 1 的比例混合。测定真空干燥前后的活菌数， 计算菌体存活率。 0117 测得存活率为 20.8。 0118 筛选实例 3 0119 收集。

27、离心后的菌泥， 以重量百分比为 5的蔗糖作为保护剂， 按保护剂与菌泥的体 积比为 3 1 的比例混合。测定真空干燥前后的活菌数， 计算菌体存活率。 0120 测得存活率为 17.8。 0121 结果 0122 蔗糖保护作用效果显著 ( 附图 2)， 质量分数为 3的蔗糖凝结芽孢杆菌存活率为 12.6， 添加 5的蔗糖可使其存活率达到 17.8。 0123 2、 复合保护剂的确定 ： 0124 以下提及的保护剂的浓度均为对应物质的水溶液的重量百分比浓度。 0125 筛选实例 1 0126 以 5的蔗糖为基础， 添加 10脱脂奶粉作为保护剂， 按保护剂与菌泥的体积比 为 3 1 的比例混合。测定真。

28、空干燥前后的活菌数， 计算菌体存活率。 0127 测得存活率为 40.5。 0128 筛选实例 2 0129 以 5的蔗糖为基础， 添加 10麦芽糊精作为保护剂， 按保护剂与菌泥的体积比 为 3 1 的比例混合， 测定真空干燥前后的活菌数， 计算菌体存活率。 0130 测得存活率为 90.3。 0131 筛选实例 3 0132 以 5的蔗糖为基础， 添加 10脱脂奶粉和 3谷氨酸钠作为保护剂， 按保护剂与 菌泥的体积比为 3 1 的比例混合， 测定真空干燥前后的活菌数， 计算菌体存活率。 0133 测得存活率为 80.7。 说 明 书 CN 102433279 B 8 7/9 页 9 0134。

29、 结果 0135 其他复合保护剂效果见附图 3， 以含 5蔗糖和 10麦芽糊精的水溶液为保护剂 时， 凝结芽孢杆菌存活率达到最高为90.3。 因此， 复合保护剂为5蔗糖和10麦芽糊精 水溶液。 0136 其余没有具体列出的保护请参照图 3 和图 3 的附图说明。 0137 四、 真空干燥条件的确定 0138 1、 加热温度的确定 0139 筛选实例 1 0140 在干燥室压力为 3000Pa 和物料量为 40g 的情况下， 干燥温度为 40时， 测定真空 干燥前后的活菌数， 计算菌体存活率。 0141 测得存活率为 95。 0142 筛选实例 2 0143 在干燥室压力为 3000Pa 和物料。

30、量为 40g 的情况下， 干燥温度为 60时， 测定真空 干燥前后的活菌数， 计算菌体存活率。 0144 测得存活率为 93.7。 0145 结果 0146 干燥温度为 60时， 菌体存活率高， 与 40和 50相比存活率几乎没有差别， 而 且 60时能缩短干燥时间。因此， 干燥温度选为 60 ( 附图 4)。 0147 2、 干燥压力的确定 0148 筛选实例 1 0149 在干燥室温度为60和物料量为40g的情况下， 干燥压力为800Pa， 测定真空干燥 前后的活菌数， 计算菌体存活率。 0150 测得存活率为 94.5。 0151 筛选实例 2 0152 在干燥室温度为 60和物料量为 。

31、40g 的情况下， 干燥压力为 3000Pa， 测定真空干 燥前后的活菌数， 计算菌体存活率。 0153 测得存活率为 93。 0154 结果 0155 干燥压力为 12000Pa 时， 菌体存活率高， 而且干燥时间短。因此， 干燥压力选为 12000Pa( 附图 5)。 0156 五、 直投式凝结芽孢杆菌发酵剂在液态发酵中的应用 0157 筛选实例 1 0158 将凝结芽孢杆菌发酵剂加入已灭菌的 0.85生理盐水中， 常温复水 20min， 然后 按 0.1的接种量接入灭过菌的液态发酵培养基， 组成 (g/L) ： 蛋白胨 10.0 ； 酵母膏 10.0 ； 葡萄糖 10.0。于 371摇瓶。

32、培养 16h， 测活菌数。 0159 测得活菌数为 ： 6.0109cfu/mL。 0160 筛选实例 2 0161 将经液体活化后的凝结芽孢杆菌按 5的接种量接入灭过菌的液态发酵培养基， (g/L) ： 蛋白胨 10.0 ； 酵母膏 10.0 ； 葡萄糖 10.0。于 371摇瓶培养 16h， 测活菌数。测得 说 明 书 CN 102433279 B 9 8/9 页 10 活菌数为 ： 7.2109cfu/mL。 0162 结果 0163 使用直投式凝结芽孢杆菌发酵剂按接种量 0.1与接种量 5液体接种于液态发 酵培养基中对比， 最高活菌数分别为 8.1109cfu/mL 和 7.8109c。

33、fu/mL( 附图 6)。明显降 低接种量， 并可达到更好的发酵效果。 0164 六、 直投式凝结芽孢杆菌发酵剂在固态发酵中的应用 0165 筛选实例 1 0166 将凝结芽孢杆菌发酵剂加入已灭菌的 0.85生理盐水中， 常温复水 20min， 然后 按0.1的接种量接入灭过菌的以豆粕为主的固态发酵培养基， 组成() ： 豆粕60， 葡萄糖 20， 蛋白胨20。 然后按照每100g培养基加入水150ml。 于371好氧培养26h， 测活菌数。 0167 测得活菌数为 ： 7.9109cfu/g。 0168 筛选实例 2 0169 将经液体活化后的凝结芽孢杆菌按 10 (v/w) 的接种量接入灭。

34、过菌的以豆粕为 主的固态发酵培养基， 组成 ( ) ： 豆粕 60， 葡萄糖 20， 蛋白胨 20。然后按照每 100g 培养基 加入水 150ml。于 371好氧培养 26h， 测活菌数。 0170 测得活菌数为 ： 7.3109cfu/g。 0171 结果 0172 使用直投式凝结芽孢杆菌发酵剂按接种量 0.1与接种量 10液体接种于固态 发酵培养基中对比， 最高活菌数分别为10.0109cfu/g和9.7109cfu/g(附图7)。 发酵剂 接种后菌体存在约 14h 的迟滞期， 而后生长快速， 最终发酵效果理想， 可明显降低接种量。 0173 结论 0174 通过对直投式凝结芽孢杆菌发酵。

35、剂生产工艺的研究， 凝结芽孢杆菌浓缩采用最终 凝结芽孢杆菌存活率达 90.3， 发酵剂的活菌数为 3.241010cfu/g， 按 1的接种量便可 达到理想的液态或固态发酵效果， 最高活菌数分别为 8.1109cfu/mL、 1.01010cfu/g。 0175 表 1 发酵液 pH 对分离效果的影响 0176 0177 表 2 离心时间对分离效果的影响 0178 说 明 书 CN 102433279 B 10 9/9 页 11 0179 表 3 离心力对分离效果的影响 0180 0181 0182 表 4 离心温度对分离效果的影响 0183 说 明 书 CN 102433279 B 11 1/4 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102433279 B 12 2/4 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102433279 B 13 3/4 页 14 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102433279 B 14 4/4 页 15 图 7 说 明 书 附 图 CN 102433279 B 15 。