短体副鳅微卫星位点及其引物和应用.pdf

摘要
申请专利号：	CN201810382671.7	申请日：	20180426
公开号：	CN108559782A	公开日：	20180921
当前法律状态：		有效性：	审查中
法律详情：
IPC分类号：	C12Q1/6888,C12N15/11	主分类号：	C12Q1/6888,C12N15/11
申请人：	水利部中国科学院水工程生态研究所
发明人：	李伟涛,阙延福,熊美华,邵科,廖小林,朱滨
地址：	430079 湖北省武汉市洪山区卓刀泉雄楚大街578号
优先权：	CN201810382671A
专利代理机构：	湖北武汉永嘉专利代理有限公司	代理人：	徐晓琴
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内容摘要

本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及短体副鳅微卫星位点及其引物和应用，所述微卫星位点的核酸序列如SEQ ID NO：1～7所示，用于扩增所述微卫星位点的引物对核苷酸序列如SEQ ID NO：8～21所示。本发明从短体副鳅基因组DNA中筛选出了7个微卫星位点，并依据微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物对，采用该特异性引物对扩增短体副鳅基因组DNA，获得的产物具有高度的多态性和稳定性，可应用于短体副鳅的种群遗传学、亲缘关系鉴定分析、分子标记辅助育种等领域。

权利要求书

1.短体副鳅的微卫星位点，其特征在于，包括7个微卫星位点，所述微卫星位点的核酸序列如SEQIDNO：1~7所示。 2.用于扩增权利要求1所述短体副鳅微卫星位点的引物对，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO：8~21所示；用于扩增序列为SEQIDNO：1的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQIDNO:8、SEQIDNO：9；用于扩增序列为SEQIDNO：2的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQIDNO：10、SEQIDNO：11；用于扩增序列为SEQIDNO：3的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQIDNO：12、SEQIDNO：13；用于扩增序列为SEQIDNO：4的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQIDNO：14、SEQIDNO：15；用于扩增序列为SEQIDNO：5的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQIDNO：16、SEQIDNO：17；用于扩增序列为SEQIDNO：6的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQIDNO：18、SEQIDNO：19；用于扩增序列为SEQIDNO：7的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQIDNO：20、SEQIDNO：21。 3.权利要求1所述短体副鳅的微卫星位点在短体副鳅的种群遗传学、家系鉴定和分子标记辅助育种方面的应用。 4.权利要求2所述短体副鳅微卫星位点引物对在短体副鳅的种群遗传学、家系鉴定和分子标记辅助育种方面的应用。 5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，利用权利要求2所述短体副鳅微卫星位点引物对检测短体副鳅种群遗传多样性，包括如下步骤：（1）基因组DNA的提取：采用酚氯仿法提取短体副鳅鳍条组织的基因组DNA；（2）微卫星PCR扩增：利用短体副鳅微卫星位点引物对，以短体副鳅鳍条组织的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物；（3）测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在ABI3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析；（4）遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP4.0.10计算遗传多样性参数。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及短体副鳅微卫星位点及其引物和应用。

背景技术

微卫星DNA：又称为短串联重复序列或简单序列重复。它是以1～6个碱基的短核苷酸为基本单位首尾相连组成串联重复序列，由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计一对特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛，密度大，多态性丰富，遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增，所需DNA数量极少，对DNA质量要求不高，结果重复性好等优点，目前已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析、连锁图谱构建、功能基因定位、分子标记辅助育种等领域。

短体副鳅(Paracobitis potanini)，别名包氏条鳅、钢鳅，隶属于鲤形目鳅科(Cobitidae)条鳅亚科(Noemacheilinae)副鳅属(Paracobitis)，主要分布在长江上游干流以及三峡库区的一些支流，如香溪、龙船河、大宁河、乌江等天然水域，秦岭南部也有分布，是长江上游特有鱼类。短体副鳅个体小，常见个体体长45～96mm，短体副鳅体色鲜艳，全身布满漂亮的花纹，具有极高的观赏价值。近年来，由于酷渔滥捕以及挖沙船等对鱼类三场的破坏等原因，资源量急剧下降。

发明内容

本发明的目的在于提供了7个短体副鳅的微卫星位点及其引物和应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

短体副鳅的微卫星位点，包括7个微卫星位点，其核酸序列如SEQ ID NO：1～7所示。

用于扩增上述7个短体副鳅微卫星位点的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO：8～21所示；其中，用于扩增序列为SEQ ID NO：1的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO：9；用于扩增序列为SEQ ID NO：2的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11；用于扩增序列为SEQ ID NO：3的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13；用于扩增序列为SEQ ID NO：4的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15；用于扩增序列为SEQ ID NO：5的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17；用于扩增序列为SEQ ID NO：6的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19；用于扩增序列为SEQ ID NO：7的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21。

上述短体副鳅微卫星位点在短体副鳅的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助育种方面的应用。

上述短体副鳅微卫星位点引物对在短体副鳅的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助育种方面的应用。

利用上述述短体副鳅微卫星位点引物对检测短体副鳅种群遗传多样性，包括如下步骤：

(1)基因组DNA的提取：采用酚氯仿法提取短体副鳅鳍条组织的基因组DNA；

(2)微卫星PCR扩增：利用上述短体副鳅微卫星位点引物对，以短体副鳅鳍条组织的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物；

(3)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析；

(4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP 4.0.10计算遗传多样性参数。

本发明的有益效果如下：本发明从短体副鳅基因组DNA中筛选出了7个微卫星位点，并依据微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物对，采用该特异性引物对扩增短体副鳅基因组DNA，获得的产物具有高度的多态性和稳定性，可应用于短体副鳅的种群遗传学、亲缘关系鉴定分析、分子标记辅助育种等领域。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。

以下实施例中未注明具体条件的实施方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实施指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1短体副鳅微卫星位点和引物对的筛选

一、含有微卫星位点的序列查找：

从构建的短体副鳅基因文库的序列中用软件SSRHunter1.3进行微卫星序列的查找；参数设置为查找含有二碱基、三碱基和四碱基重复数5次以上的序列，共筛选出50个含有微卫星重复的位点；

二、微卫星引物设计：从含有微卫星的基因序列中，选取符合引物设计的序列，使用Primer Premier 5.0进行引物设计；主要参数设置为：引物长度17～25bp，20bp为最适长度，PCR产物片段长度范围100～350bp，最适退火温度55～65℃；GC含量一般在40％～60％之间，尽量避免二级结构出现；

三、对设计的引物进行多态性检测：

(1)基因组DNA的提取：采用酚氯仿法提取32尾短体副鳅鳍条组织的基因组DNA；

(2)微卫星PCR的扩增：采用设计的微卫星荧光引物，扩增短体副鳅基因组DNA；反应体系40μL：模板DNA 4μL(10ng/μL)，正反向引物各2.0μL(10pmol/μL)，0.4μL Ex-Taq酶(5U/μL)，4μL 10×PCRbuffer(Mg2+plus)，3.0μL dNTPs(2.5μmol/μL)，用灭菌双蒸水补足至40μL；

(3)PCR反应在ABI 9700PCR仪中进行，扩增程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，各位点退火温度下(各位点退火温度见表2所示)复性45s，72℃延伸1min，35个循环；最终72℃延伸5min；

(4)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析以确定短体副鳅微卫星位点在不同个体上的等位基因大小；

(4)遗传多样性分析：根据每个微卫星扩增产物的等位基因大小确定基因型，采用GENEPOP 4.0.10计算遗传多样性参数，从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的位点。

经过多样性检测，本发明共筛选出7个具有遗传多态性的微卫星位点，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1～7，其设计的多态性引物的信息如表1所示。

表1短体副鳅微卫星位点及对应引物信息

表2 8个微卫星位点的退火温度、片段长度、多态性等的相关信息

位点片段长度(bp) 退火温度Ta NA HO HE Ppo-5 108-136 52 13 0.983 0.768 Ppo-24 132-162 48 7 0.525 0.604 Ppo-34 146-160 52 16 0.918 0.880 Ppo-52 166-186 50 8 0.803 0.651 Ppo-59 182-194 50 8 0.639 0.674 Ppo-85 224-260 53 11 0.705 0.813 Ppo-101 238-262 53 11 0.590 0.601

实施例2短体副鳅微卫星位点引物对的应用

采用实施例1获得的表2中的短体副鳅微卫星位点引物对，对30个短体副鳅鳍条组织的基因组DNA进行扩增，检测短体副鳅种群遗传多样性，具体包括如下步骤：

(1)基因组DNA的提取：采用酚氯仿法提取短体副鳅鳍条组织的基因组DNA；

(2)微卫星PCR扩增：利用表1中的短体副鳅微卫星位点荧光引物对，以短体副鳅鳍条组织的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物；

(3)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析；

(4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP 4.0.10计算遗传多样性参数。

遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点的等位基因数目从7到16不等，平均等位基因数目为10.6个，观测杂合度的范围从0.525到0.983，期望杂合度的范围从0.604到0.880，这证明本发明筛选的微卫星位点和设计的引物具有遗传多态性。用本发明的微卫星引物还可用于短体副鳅的遗传多样性、放流效果评估、亲缘关系分析及分子标记辅助育种等领域研究。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

序列表

<110> 水利部中国科学院水工程生态研究所

<120> 短体副鳅微卫星位点及其引物和应用

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 122bp

<212> DNA

<213> 短体副鳅（Paracobitis potanini）

<400> 1

ggcgtggtct cttttcaaac tgtatgtaca gtataaactc ccacctacca aaaccctgac 60

agacagacag acagacagac agacagacag actgtgtgta aggcttcaga tgtctgtgtg 120

aa 122

<210> 2

<211> 150bp

<212> DNA

<213> 短体副鳅（Paracobitis potanini）

<400> 2

cagaatccgg ggaaaacata taagcctcaa ctttcacaca cactacgcag gaaactttac 60

atttaacttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttcttgt aatatgtggt 120

aatgcaatta gctggtcatg tcattggaaa 150

<210> 3

<211> 141bp

<212> DNA

<213> 短体副鳅（Paracobitis potanini）

<400> 3

tcccactgcc ctaaaatgtc atctatcttt ctatctatct atctatctat ctatctatct 60

atcttttcgt gtaaggaaaa aataacaacg aatatacaaa tgaatcatca agtaaattcg 120

ccagcgggta tagctttctc g 141

<210> 4

<211> 176bp

<212> DNA

<213> 短体副鳅（Paracobitis potanini）

<400> 4

caaaacattt tcctggttag ggttatatta tatccatatt tatatccagt acagatattg 60

tgttgctgtt gatttgtttg tttgtttgtt tgtttgtagg tttgtacagg aagtctggta 120

aactggtgtt tcttggttta gacaatgctg gaaaaacaac acttctgcac atgctg 176

<210> 5

<211> 194bp

<212> DNA

<213> 短体副鳅（Paracobitis potanini）

<400> 5

tcattttgga ccctgtgtga tggtacagag aagaacagag agacagacag aaagaaagaa 60

agaaagaaag aaagaaagaa agaaagggac agttaaagac acagagagag agacggccgg 120

gtaaatgtgt gtcagtgtga gcaggagaag aggcagatgt gaatgaagaa ggcgagcagg 180

agttctgtgg caat 194

<210> 6

<211> 227bp

<212> DNA

<213> 短体副鳅（Paracobitis potanini）

<400> 6

tgtggtattg aagcccaatg tttcatctaa ttcttatctc ttatctttgc aacatcgttt 60

gaatcataat agatagatag atagatagat agatagatag atagatgcag aatgtttgac 120

tgccataaat gcattttttc ccatgacccc tttagtcttt gattatgatg aaataacctg 180

ttatcttctg accccaataa ctcctgcaag taccctgtgt tgccgtc 227

<210> 7

<211> 241bp

<212> DNA

<213> 短体副鳅（Paracobitis potanini）

<400> 7

ctgcatgtgc aggtcaattt caccctattt ctgcctgtta tatgccttta ggacaatata 60

aatgccataa tttatgccaa aataattggt acatctttaa ataacagcat tttttgcaag 120

gcttgcattt ggttaaacat gcattttttt ctatttacat tttatttatg ggacacgcac 180

gcacgcacgc acgcacgcac acttaatttt tatatttttc ttccagagag gaagatgcaa 240

a 241

<210> 8

<211> 21bp

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttcacacaga catctgaagc c 21

<210> 9

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 9

ggcgtggtct cttttcaaac 20

<210> 10

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 10

cagaatccgg ggaaaacata 20

<210> 11

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 11

tttccaatga catgaccagc 20

<210> 12

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 12

cgagaaagct atacccgctg 20

<210> 13

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 13

tcccactgcc ctaaaatgtc 20

<210> 14

<211> 22bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 14

caaaacattt tcctggttag gg 22

<210> 15

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 15

cagcatgtgc agaagtgttg 20

<210> 16

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 16

attgccacag aactcctgct 20

<210> 17

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 17

tcattttgga ccctgtgtga 20

<210> 18

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 18

tgtggtattg aagcccaatg 20

<210> 19

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 19

gacggcaaca cagggtactt 20

<210> 20

<211> 20bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 20

ctgcatgtgc aggtcaattt 20

<210> 21

<211> 21bp

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 21

tttgcatctt cctctctgga a 21

资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810382671.7 (22)申请日 2018.04.26 (71)申请人水利部中国科学院水工程生态研究所地址 430079 湖北省武汉市洪山区卓刀泉雄楚大街578号 (72)发明人李伟涛阙延福熊美华邵科廖小林朱滨 (74)专利代理机构湖北武汉永嘉专利代理有限公司 42102 代理人徐晓琴 (51)Int.Cl. C12Q 1/6888(2018.01) C12N 15/11(2006.01) (54)发明名称短体副鳅微卫星位点及其引物和应用 (57)。

2、摘要本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及短体副鳅微卫星位点及其引物和应用，所述微卫星位点的核酸序列如SEQIDNO： 17 所示，用于扩增所述微卫星位点的引物对核苷酸序列如SEQIDNO： 821所示。本发明从短体副鳅基因组DNA中筛选出了7个微卫星位点，并依据微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物对，采用该特异性引物对扩增短体副鳅基因组 DNA，获得的产物具有高度的多态性和稳定性，可应用于短体副鳅的种群遗传学、亲缘关系鉴定分析、分子标记辅助育种等领域。权利要求书1页说明书4页序列表4页 CN 108559782 A 2018.09.21 。

3、CN 108559782 A 1.短体副鳅的微卫星位点，其特征在于，包括7个微卫星位点，所述微卫星位点的核酸序列如SEQ ID NO： 17所示。 2.用于扩增权利要求1所述短体副鳅微卫星位点的引物对，其特征在于，核苷酸序列如 SEQ ID NO： 821所示；用于扩增序列为SEQ ID NO： 1的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO： 9；用于扩增序列为SEQ ID NO： 2的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO： 10、 SEQ ID NO： 11；用于扩增序列为SEQ ID NO： 3的微卫星。

4、位点的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO： 12、 SEQ ID NO： 13；用于扩增序列为SEQ ID NO： 4的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO： 14、 SEQ ID NO： 15；用于扩增序列为SEQ ID NO： 5的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO： 16、 SEQ ID NO： 17；用于扩增序列为SEQ ID NO： 6的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为 SEQ ID NO： 18、 SEQ ID NO： 19；用于扩增序列为SEQ ID NO： 7的微卫星位点设计的引物对，其上下游。

5、序列分别为SEQ ID NO： 20、 SEQ ID NO： 21。 3.权利要求1所述短体副鳅的微卫星位点在短体副鳅的种群遗传学、家系鉴定和分子标记辅助育种方面的应用。 4.权利要求2所述短体副鳅微卫星位点引物对在短体副鳅的种群遗传学、家系鉴定和分子标记辅助育种方面的应用。 5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，利用权利要求2所述短体副鳅微卫星位点引物对检测短体副鳅种群遗传多样性，包括如下步骤：（1）基因组DNA的提取：采用酚氯仿法提取短体副鳅鳍条组织的基因组DNA；（2）微卫星PCR扩增：利用短体副鳅微卫星位点引物对，以短体副鳅鳍条组织的基因组 DNA为模板。

6、进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物；（3）测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析；（4）遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用 GENEPOP 4.0.10计算遗传多样性参数。权利要求书 1/1 页 2 CN 108559782 A 2 短体副鳅微卫星位点及其引物和应用技术领域 0001 本发明属于分子生物学DNA标记技术领域，具体涉及短体副鳅微卫星位点及其引物和应用。背景技术 0002 微卫星DNA：又称为短串联重复序列或简单序列重复。它是以16个碱基的短核苷酸为基本单。

7、位首尾相连组成串联重复序列，由于重复次数不同以及重复程度的不完全造成了每个位点的长度多态性。由于每个微卫星两端的序列多是相对保守的单拷贝序列，可根据其两端设计一对特异性引物，通过PCR技术来扩增相应位点的微卫星序列，再经电泳分析，即可显示不同基因型个体微卫星的多态性。微卫星由于分布广泛，密度大，多态性丰富，遵循孟德尔分离定律，共显性遗传、易于PCR扩增，所需DNA数量极少，对DNA质量要求不高，结果重复性好等优点，目前已被广泛应用于遗传多样性、亲缘关系分析、连锁图谱构建、功能基因定位、分子标记辅助育种等领域。 0003 短体副鳅(Paracobi。

8、tis potanini)，别名包氏条鳅、钢鳅，隶属于鲤形目鳅科 (Cobitidae)条鳅亚科(Noemacheilinae)副鳅属(Paracobitis)，主要分布在长江上游干流以及三峡库区的一些支流，如香溪、龙船河、大宁河、乌江等天然水域，秦岭南部也有分布，是长江上游特有鱼类。短体副鳅个体小，常见个体体长4596mm，短体副鳅体色鲜艳，全身布满漂亮的花纹，具有极高的观赏价值。近年来，由于酷渔滥捕以及挖沙船等对鱼类三场的破坏等原因，资源量急剧下降。发明内容 0004 本发明的目的在于提供了7个短体副鳅的微卫星位点及其引物和应用。 0005 为实。

9、现上述发明目的，本发明采用的技术方案为： 0006 短体副鳅的微卫星位点，包括7个微卫星位点，其核酸序列如SEQ ID NO： 17所示。 0007 用于扩增上述7个短体副鳅微卫星位点的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO： 8 21所示；其中，用于扩增序列为SEQ ID NO： 1的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为 SEQ ID NO:8、 SEQ ID NO： 9；用于扩增序列为SEQ ID NO： 2的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO： 10、 SEQ ID NO： 11；用于扩增序列为SEQ ID NO： 3的微卫星位点的引物。

10、对，其上下游序列分别为SEQ ID NO： 12、 SEQ ID NO： 13；用于扩增序列为SEQ ID NO： 4 的微卫星位点的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO： 14、 SEQ ID NO： 15；用于扩增序列为SEQ ID NO： 5的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO： 16、 SEQ ID NO： 17；用于扩增序列为SEQ ID NO： 6的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别为SEQ ID NO： 18、 SEQ ID NO： 19；用于扩增序列为SEQ ID NO： 7的微卫星位点设计的引物对，其上下游序列分别。

11、为SEQ ID NO： 20、 SEQ ID NO： 21。 0008 上述短体副鳅微卫星位点在短体副鳅的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助育说明书 1/4 页 3 CN 108559782 A 3 种方面的应用。 0009 上述短体副鳅微卫星位点引物对在短体副鳅的种群遗传学、家系鉴定及分子标记辅助育种方面的应用。 0010 利用上述述短体副鳅微卫星位点引物对检测短体副鳅种群遗传多样性，包括如下步骤： 0011 (1)基因组DNA的提取：采用酚氯仿法提取短体副鳅鳍条组织的基因组DNA； 0012 (2)微卫星PCR扩增：利用上述短体副鳅微卫星位点引物对，以短体副鳅鳍条组织的。

12、基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物； 0013 (3)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析； 0014 (4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP 4.0.10计算遗传多样性参数。 0015 本发明的有益效果如下：本发明从短体副鳅基因组DNA中筛选出了7个微卫星位点，并依据微卫星重复序列两端的侧翼区设计特异性引物对，采用该特异性引物对扩增短体副鳅基因组DNA，获得的产物具有高度的多态性和稳定性，可应用于短体副鳅的种群遗传学、亲缘关系鉴定分析。

13、、分子标记辅助育种等领域。具体实施方式 0016 为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。 0017 以下实施例中未注明具体条件的实施方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克 (Sambrook)等编写的分子克隆实施指南中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。 0018 实施例1短体副鳅微卫星位点和引物对的筛选 0019 一、含有微卫星位点的序列查找： 0020 从构建的短体副鳅基因文库的序列中用软件SSRHunter1.3进行微卫星序列的查找；参数设置为查找含有二碱基、三碱基和四碱基重复数5次以上。

14、的序列，共筛选出50个含有微卫星重复的位点； 0021 二、微卫星引物设计：从含有微卫星的基因序列中，选取符合引物设计的序列，使用Primer Premier 5.0进行引物设计；主要参数设置为：引物长度1725bp， 20bp为最适长度， PCR产物片段长度范围100350bp，最适退火温度5565； GC含量一般在4060 之间，尽量避免二级结构出现； 0022 三、对设计的引物进行多态性检测： 0023 (1)基因组DNA的提取：采用酚氯仿法提取32尾短体副鳅鳍条组织的基因组DNA； 0024 (2)微卫星PCR的扩增：采用设计的微卫星荧光引物，扩增短体副。

15、鳅基因组DNA；反应体系40 L：模板DNA 4 L(10ng/ L)，正反向引物各2.0 L(10pmol/ L)， 0.4 L Ex-Taq酶 (5U/ L)， 4 L 10PCRbuffer(Mg2+plus)， 3.0 L dNTPs(2.5 mol/ L)，用灭菌双蒸水补足至 40 L； 0025 (3)PCR反应在ABI 9700PCR仪中进行，扩增程序如下： 94预变性3min； 94变性说明书 2/4 页 4 CN 108559782 A 4 30s，各位点退火温度下(各位点退火温度见表2所示)复性45s， 72延伸1min， 35个循环；最终72延伸5mi。

16、n； 0026 (4)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析以确定短体副鳅微卫星位点在不同个体上的等位基因大小； 0027 (4)遗传多样性分析：根据每个微卫星扩增产物的等位基因大小确定基因型，采用 GENEPOP 4.0.10计算遗传多样性参数，从而筛选出具有多态性的微卫星引物及对应的位点。 0028 经过多样性检测，本发明共筛选出7个具有遗传多态性的微卫星位点，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:17，其设计的多态性引物的信息如表1所示。 0029 表1短体副鳅微卫星位点及对应引物信息 0030 0031 表2。

17、 8个微卫星位点的退火温度、片段长度、多态性等的相关信息 0032 位点片段长度(bp)退火温度TaNAHOHE Ppo-5108-13652130.9830.768 Ppo-24132-1624870.5250.604 说明书 3/4 页 5 CN 108559782 A 5 Ppo-34146-16052160.9180.880 Ppo-52166-1865080.8030.651 Ppo-59182-1945080.6390.674 Ppo-85224-26053110.7050.813 Ppo-101238-26253110.5900.601 0033 实施例2短体副鳅微卫星位点引。

18、物对的应用 0034 采用实施例1获得的表2中的短体副鳅微卫星位点引物对，对30个短体副鳅鳍条组织的基因组DNA进行扩增，检测短体副鳅种群遗传多样性，具体包括如下步骤： 0035 (1)基因组DNA的提取：采用酚氯仿法提取短体副鳅鳍条组织的基因组DNA； 0036 (2)微卫星PCR扩增：利用表1中的短体副鳅微卫星位点荧光引物对，以短体副鳅鳍条组织的基因组DNA为模板进行PCR扩增，获得微卫星扩增产物； 0037 (3)测序仪检测扩增产物：将扩增产物避光保存，在ABI 3730XL测序仪进行毛细管电泳和STR分析； 0038 (4)遗传多样性分析：根据每个个体微卫星扩。

19、增产物的分子量大小确定基因型，采用GENEPOP 4.0.10计算遗传多样性参数。 0039 遗传多样性分析结果表明每个微卫星位点的等位基因数目从7到16不等，平均等位基因数目为10.6个，观测杂合度的范围从0.525到0.983，期望杂合度的范围从0.604到 0.880，这证明本发明筛选的微卫星位点和设计的引物具有遗传多态性。用本发明的微卫星引物还可用于短体副鳅的遗传多样性、放流效果评估、亲缘关系分析及分子标记辅助育种等领域研究。 0040 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基。

20、础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。说明书 4/4 页 6 CN 108559782 A 6 序列表水利部中国科学院水工程生态研究所短体副鳅微卫星位点及其引物和应用 21 PatentIn version 3.5 1 122bp DNA 短体副鳅（Paracobitis potanini） 1 ggcgtggtct cttttcaaac tgtatgtaca gtataaactc ccacctacca aaaccctgac 60 agacagacag acagacaga。

21、c agacagacag actgtgtgta aggcttcaga tgtctgtgtg 120 aa 122 2 150bp DNA 短体副鳅（Paracobitis potanini） 2 cagaatccgg ggaaaacata taagcctcaa ctttcacaca cactacgcag gaaactttac 60 atttaacttc tttctttctt tctttctttc tttctttctt tctttcttgt aatatgtggt 120 aatgcaatta gctggtcatg tcattggaaa 150 3 141bp DNA 短体副鳅（Paracob。

22、itis potanini） 3 tcccactgcc ctaaaatgtc atctatcttt ctatctatct atctatctat ctatctatct 60 atcttttcgt gtaaggaaaa aataacaacg aatatacaaa tgaatcatca agtaaattcg 120 ccagcgggta tagctttctc g 141 4 176bp DNA 短体副鳅（Paracobitis potanini） 4 caaaacattt tcctggttag ggttatatta tatccatatt tatatccagt acagatattg 60 tgttg。

23、ctgtt gatttgtttg tttgtttgtt tgtttgtagg tttgtacagg aagtctggta 120 aactggtgtt tcttggttta gacaatgctg gaaaaacaac acttctgcac atgctg 176 5 序列表 1/4 页 7 CN 108559782 A 7 194bp DNA 短体副鳅（Paracobitis potanini） 5 tcattttgga ccctgtgtga tggtacagag aagaacagag agacagacag aaagaaagaa 60 agaaagaaag aaagaaagaa agaaagg。

24、gac agttaaagac acagagagag agacggccgg 120 gtaaatgtgt gtcagtgtga gcaggagaag aggcagatgt gaatgaagaa ggcgagcagg 180 agttctgtgg caat 194 6 227bp DNA 短体副鳅（Paracobitis potanini） 6 tgtggtattg aagcccaatg tttcatctaa ttcttatctc ttatctttgc aacatcgttt 60 gaatcataat agatagatag atagatagat agatagatag atagatgcag aat。

25、gtttgac 120 tgccataaat gcattttttc ccatgacccc tttagtcttt gattatgatg aaataacctg 180 ttatcttctg accccaataa ctcctgcaag taccctgtgt tgccgtc 227 7 241bp DNA 短体副鳅（Paracobitis potanini） 7 ctgcatgtgc aggtcaattt caccctattt ctgcctgtta tatgccttta ggacaatata 60 aatgccataa tttatgccaa aataattggt acatctttaa ataacag。

26、cat tttttgcaag 120 gcttgcattt ggttaaacat gcattttttt ctatttacat tttatttatg ggacacgcac 180 gcacgcacgc acgcacgcac acttaatttt tatatttttc ttccagagag gaagatgcaa 240 a 241 8 21bp DNA 人工序列 8 ttcacacaga catctgaagc c 21 9 20bp DNA 人工序列 9 ggcgtggtct cttttcaaac 20 序列表 2/4 页 8 CN 108559782 A 8 10 20bp DNA 人工序列 1。

27、0 cagaatccgg ggaaaacata 20 11 20bp DNA 人工序列 11 tttccaatga catgaccagc 20 12 20bp DNA 人工序列 12 cgagaaagct atacccgctg 20 13 20bp DNA 人工序列 13 tcccactgcc ctaaaatgtc 20 14 22bp DNA 人工序列 14 caaaacattt tcctggttag gg 22 15 20bp DNA 人工序列 15 cagcatgtgc agaagtgttg 20 16 20bp DNA 序列表 3/4 页 9 CN 108559782 A 9 人工序列 16 attgccacag aactcctgct 20 17 20bp DNA 人工序列 17 tcattttgga ccctgtgtga 20 18 20bp DNA 人工序列 18 tgtggtattg aagcccaatg 20 19 20bp DNA 人工序列 19 gacggcaaca cagggtactt 20 20 20bp DNA 人工序列 20 ctgcatgtgc aggtcaattt 20 21 21bp DNA 人工序列 21 tttgcatctt cctctctgga a 21 序列表 4/4 页 10 CN 108559782 A 10 。

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