技术领域
本发明属于基因检测技术领域，尤其涉及一种用于结直肠癌诊断的引物及探针、试剂盒及基因检测方法。
背景技术
肿瘤是目前医学上最难攻克的病种之一，根据《2015年中国癌症统计数据》，我国2015年新发肿瘤病例429万，死亡人数281万。
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)为消化系统的常见恶性肿瘤。在世界范围内，CRC的发病率和病死率均在不断上升，已高居恶性肿瘤的第3位。而在西方发达国家，CRC 病死率高达33％，是最常见的恶性肿瘤死因之一，美国人群患CRC的终身风险率高达5％。由于生活习惯的改变，我国国民结直肠癌的发病率逐年增高，已高居男女各肿瘤发病率的前3－4位。结直肠腺瘤是CRC最主要的癌前病变，CRC 演变的经典腺瘤－腺癌机制，大约要经过5－10年时间。早期CRC常无明显的临床症状，约5％的早期CRC可得到确诊，但绝大多数患者就诊时已进展到中、晚期。手术治疗可使早期CRC得到根治，对于Ⅰ、Ⅱ期的CRC患者，外科手术的 5年生存率分别达到90％和75％，而对于晚期患者则不足10％，且晚期CRC经化放疗联合分子靶向治疗后平均生存时间不足30个月。
大量研究显示，早期筛查诊断可以降低CRC的发生率和病死率。CRC筛查的主要目标是找到可以治疗的早期肿瘤，或极有可能发展成为恶性肿瘤的癌前病变。结肠镜是发现早期CRC的重要方式，但是作为侵入性检查、要求完全彻底的肠道准备、存在隐私暴露等缺点，难以广泛接受。且纤维结直肠镜对于直径小于5mm的病变漏诊率也达到27％。大便潜血试验(faecal occult blood testing，FOBT)是目前临床推荐的CRC早期筛查的标准非侵入手段，然而其敏感性和特异性都较低，不能满足CRC早期诊断的要求。因此，亟需发掘新的筛查方法及方式。
septin9甲基化是目前CRC相关性最强的基因标志物，在多项临床研究中证明灵敏度74％，特异性97％，但检出率仍有不足，且只能做定性检测，无法对两份阳性结果进行定量比较。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种用于结直肠癌诊断的引物及探针，包括用于检测septin9基因的引物探针组合1和用于检测SFRP2基因的引物探针组合2，其中：
引物探针组合1
引物：SEQIDNO：3
探针：SEQIDNO：4
引物：SEQIDNO：5；
引物探针组合2
引物：SEQIDNO：6
探针：SEQIDNO：7
引物：SEQIDNO：8。
本发明还提供一种用于结直肠癌诊断的试剂盒，包括用于结直肠癌诊断的引物及探针。
进一步的，所述试剂盒还包括用于检测内对照基因 ACTB的引物探针组合3，所述引物探针组合3包括：
引物：SEQIDNO：9
探针：SEQIDNO：10
引物：SEQIDNO：11。
进一步的，所述试剂盒还包括PCR Mix和亚硫酸氢盐，所述PCR Mix包括Taq聚合酶、DNTP和PCR Buffer。
进一步的，所述试剂盒还包括变性剂或清除剂。
优选的，所述变性剂为正烷基二醇。
优选的，所述正烷基二醇为二乙二醇二甲基醚。
优选地，所述清除剂为色原烷衍生物，选自6-羟基 -2,5,7,8-四甲基色原烷2-羟酸，三羟基苯甲酸及其衍生物中的一种；
本发明还提供用于结直肠癌诊断的引物及探针在结直肠癌诊断中的应用。
本发明还提供用于结直肠癌诊断的试剂盒在结直肠癌诊断中的应用。
本发明还提供一种用于结直肠癌诊断的基因检测方法，应用用于结直肠癌诊断的引物及探针检测septin9、SFRP2中的每个基因的至少一个靶区域内的甲基化程度；所述靶区域分别选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2的连续的至少18个碱基长度的片段，所述引物及探针等同、互补或杂交于所述靶区域。
进一步的，所述引物及探针在中等严紧或严紧条件下杂交所述靶区域。
进一步的，所述方法包括：
S1.提供待测样本；
S2.由待测样本中提取基因组DNA，并进行预处理使基因组DNA的5’端未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交上不同于胞嘧啶的另一种碱基；
S3.以步骤S2处理过的基因组DNA为模板，利用用于结直肠癌诊断的引物及探针进行PCR扩增，获得待测样本的 septin9和SFRP2的Ct值；
S4.将测得的Ct值与判断是否患结直肠癌的临界Ct值进行对比，获得待测样本的结直肠癌的诊断结果。
进一步的，在PCR扩增中，以ACTB为内对照基因，检测内对照基因ACTB的引物探针组合为：
引物：SEQIDNO：9
探针：SEQIDNO：10
引物：SEQIDNO：11。
进一步的，步骤S2所述的预处理是通过亚硫酸氢盐实现的。
进一步的，所述亚硫酸氢盐与变性剂联用。
优选的，所述变性剂为正烷基二醇。
优选的，所述正烷基二醇为二乙二醇二甲基醚。
进一步的，所述亚硫酸氢盐试剂与清除剂联用。
优选地，所述清除剂为色原烷衍生物，选自6-羟基 -2,5,7,8-四甲基色原烷2-羟酸，三羟基苯甲酸及其衍生物中的一种。
进一步的，步骤S3所述的PCR扩增为荧光定量PCR扩增。
进一步的，PCR反应混合物包括DNA模板25～50ng、引物300～600nm、探针150～300nm、Taq聚合酶1～2U、各个 DNTP200～400μm、2×PCR Buffer缓冲至最终的40-50ul的体积；所述PCR反应条件为：95℃持续5分钟，然后进入 45～72℃的45个退火变性循环，在60℃下退火一分钟，在 95℃下变性30秒。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明将septin9和SFRP2两个靶基因结合在一起进行结直肠癌诊断，通过将分别用于检测septin9、SFRP2基因片段甲基化的核酸序列联合使用，使得对结直肠癌的灵敏度和特异性得到显著提高；两个靶基因在单独作为辅助诊断依据时，septin9的灵敏度为75％，SFRP2的灵敏度为68％，当两种基因联合检测时，可将灵敏度提高到92％；并且通过本发明能方便的实现对septin9、SFRP2这两个基因标志物的同时间的两通道检测，并能根据荧光定量PCR的荧光数值来判断样本的甲基化频率，可以无创、快速、准确地对结直肠癌进行检测和诊断。
具体实施方式
实施例1
一种用于结直肠癌诊断的引物及探针，包括：
用于检测septin9基因的引物探针组合1
引物：SEQIDNO：3
探针：SEQIDNO：4
引物：SEQIDNO：5；
用于检测SFRP2基因的引物探针组合2
引物：SEQIDNO：6
探针：SEQIDNO：7
引物：SEQIDNO：8。
本实施例提供的引物及探针用于检测septin9、SFRP2中的每个基因的至少一个靶区域内的甲基化程度；所述靶区域分别选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2的连续的至少18个碱基长度的片段，所述引物及探针等同、互补或杂交于所述靶区域。优选的，所述引物及探针在中等严紧或严紧条件下杂交所述靶区域。
本实施例提供的引物及探针具有以下特征：
(1)可扩增人造的甲基化的所述靶区域，而不能扩增人造的非甲基化的所述靶区域；
(2)在以正常的人白细胞提取的DNA为模板时显示没有扩增，但在从结直肠癌病人的血浆提取的DNA为模板时显著扩增；
(3)在以正常人的血浆提取的DNA为模板时显示没有扩增，但在从结直肠癌病人的血浆提取的DNA为模板时显著扩增。
实施例2
一种用于结直肠癌诊断的试剂盒，包括引物及探针、PCR Mix、亚硫酸氢盐和变性剂；
PCR Mix包括Taq聚合酶、DNTP和PCR Buffer；
变性剂为二乙二醇二甲基醚；
引物及探针包括用于检测septin9基因的引物探针组合 1、用于检测SFRP2基因的引物探针组合2和用于检测内对照基因ACTB的引物探针组合3，其中：
引物探针组合1
引物：SEQIDNO：3
探针：SEQIDNO：4
引物：SEQIDNO：5；
引物探针组合2
引物：SEQIDNO：6
探针：SEQIDNO：7
引物：SEQIDNO：8；
引物探针组合3
引物：SEQIDNO：9
探针：SEQIDNO：10
引物：SEQIDNO：11。
本实施例提供的试剂盒用于诊断结直肠癌的评价分析：
(1)准备24例结直肠癌和24例正常人的样品，并分别提取基因组DNA。DNA的提取可以采用现有技术中的任何标准手段来进行。在此次评价分析中，所有样品来源于唯实公司；所有样品DNA使用Epigenomics公司的EPi ProColon Plasma Quick Kit提取。
(2)将所述基因组DNA样品采用亚硫酸氢盐和变性剂进行预处理以使得在5’端未甲基化的胞嘧啶碱基被转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶。
(3)往经过预处理的24例结直肠癌和24例正常人的基因组DNA样本中，加入引物及探针和PCR Mix，进行荧光定量PCR扩增；PCR扩增的条件为：在Life Technologies 仪器(step one plus)上进行荧光定量PCR；PCR反应混合物由1ul经过预处理的DNA模板、10ul的引物及探针和29ul 的PCR Mix组成至最终40ul体积；在95℃持续5分钟，然后进入45～72℃的50个退火变性循环，在60℃下退火一分钟，在95℃下变性30秒。
(4)分别测得24例结直肠癌(crc01～crc21)和24例正常人(nom01～nom21)DNA样本对于septin9、SFRP2基因的荧光定量PCR的Ct值，具体结果如表1所示：
表1荧光定量PCR的Ct值的测量结果
通过Ct值的测试结果计算平均甲基化率，从Ct值和平均甲基化率的计算结果可以得出，septin9、SFRP2基因在结直肠癌样本上高度扩增，而在正常样本上很少扩增。由此可以得出，本发明提供的试剂盒能有效区别结直肠癌DNA和正常DNA。
实施例3
一种用于结直肠癌诊断的基因检测方法，包括：
S1.提供待测样本；
S2.由待测样本中提取基因组DNA，并进行预处理使基因组DNA的5’端未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶、胸腺嘧啶或在杂交上不同于胞嘧啶的另一种碱基；
S3.以步骤S2处理过的基因组DNA为模板，利用实施例2的试剂盒中的引物及探针进行PCR扩增，获得待测样本的septin9、SFRP2和ACTB的Ct值；
S4.将测得的septin9、SFRP2的Ct值与判断是否患结直肠癌的临界Ct值进行比对，获得待测样本的结直肠癌的诊断结果。
在本实施例中，步骤S2所述的预处理是通过亚硫酸氢盐与清除剂联用实现的，清除剂为三羟基苯甲酸。
步骤S3所述的PCR扩增为荧光定量PCR扩增。PCR反应混合物包括DNA模板25～50ng、引物300～600nm、探针 150～300nm、Taq聚合酶1～2U、各个DNTP200～400μm、2 ×PCR Buffer缓冲至最终的50ul的体积；所述PCR反应条件为：95℃持续5分钟，然后进入45～72℃的45个退火变性循环，在60℃下退火一分钟，在95℃下变性30秒。
在本实施例中，判断是否患结直肠癌的临界Ct值是采用实施例2所提供的试剂盒根据本实施例步骤S1-S3的方法，测定一定数量的结直肠癌样本和正常样本的septin9、SFRP2 的平均Ct值，根据平均Ct值制作ROC曲线，以此为依据确定相对于septin9、SFRP2的结直肠癌和正常的临界Ct值。
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 深圳凌鼎基因科技有限公司
<120> 用于结直肠癌诊断的引物及探针、试剂盒及基因检测方法
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 820
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gattccagac tccagaatcc actgctgcat atacttcatc cccccgactg gtcactgtct 60
gcgacctctc gacgtggagt tcatgaggcg tctcagcaag gtggtcaaca tcgtcccggt 120
cattgctaag gcagatactc tcacgctgga agagagagac ttcttcaaaa agaagatcag 180
ggaagagctg cgagccaatg ggattgatgt gtaccctcag aaggaatttg acgaggacgc 240
agaggacaga atgattaatg aaaagatcag ggagatgatc ccgtttgcgg tcgtgggcag 300
cgatcaggag taccaagtga acggcagaag gttgctgggg aggaagacca agtggggcac 360
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gacccacatg cagaatatta aggacatcac cagcagcatc cactatgaaa tgtaccgcgt 480
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<212> DNA
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